人參提取物對過氧化氫致人神經(jīng)母瘤細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

張慧媛++++++楊擎++++++孫佳明++++++劉英娜++++++林嘉楠++++++石曉征++++++李娜++++++曲曉波

[摘要] 目的 觀察人參提取物對過氧化氫致人神經(jīng)母瘤細(xì)胞（SH-SY5Y）損傷的影響并探討其作用機(jī)制。 方法 采用MTT法確定人參二醇總皂苷（PDS）、人參總皂苷（GS）、人參非皂苷（GN）的最佳給藥濃度。將處于對數(shù)生長期的SY5Y細(xì)胞加入過氧化氫（終濃度為300 μmol/L）孵育4 h造成細(xì)胞損傷模型，然后分為模型對照組、PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組，另設(shè)空白對照組加入等體積細(xì)胞培養(yǎng)液。采用MTT方法檢測細(xì)胞活力，Western blot法檢測Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 與空白對照組相比，模型組對照組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低（P < 0.01）；與模型對照組比較，PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組細(xì)胞存活率均升高，確定1、10、240 μg/mL為PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組實(shí)驗(yàn)濃度（P < 0.01）。與空白對照組比較，模型對照組SH-SY5Y中Keap1、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)水平明顯增加（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2、Nrf-2表達(dá)明顯降低（P < 0.01）；與模型組對照組比較，PDS給藥組、GS給藥組SH-SY5Y中Keap1、Bax、Caspase3、Caspase9蛋白表達(dá)水平明顯降低（P < 0.05或P < 0.01），Bcl-2、Nrf-2表達(dá)明顯增高（P < 0.01）。 結(jié)論 人參提取物中PDS與GS對過氧化氫致人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SY5Y細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與通過激活SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Nrf-2通路抑制氧化應(yīng)激、降低其凋亡發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 人參二醇總皂苷；人參總皂苷；人參非皂苷；過氧化氫；神經(jīng)母瘤細(xì)胞損傷

[中圖分類號] R329.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）10（c）-0013-05

Protective effect and mechanism of ginseng extract on human neuroblastoma injury induced by hydrogen peroxide

ZHANG Huiyuan YANG Qing SUN Jiaming LIU Yingna LIN Jia′nan SHI Xiaozheng LI Na QU Xiaobo

Molecular Pharmacology Laboratory， Changchun University of Traditional Chinese Medicine R&D Center， Jilin Province， Changchun 130117， China

[Abstract] Objective To observe the influence of ginseng extract on the injury induced by hydrogen peroxide in human neuroblastoma cells （SH-SY5Y） and explore its mechanism. Methods The optimal concentrations of panaxadiol saponins （PDS）， ginsenoside（GS） and ginseng non-saponin（GN） were determined by the MTT assay. SY5Y cells in the logarithmic growth phase were supplemented with hydrogen peroxide （final concentration of 300 μmol/L） and were incubated for 4 h. The cell injury model was established. SY5Y cells were divided into model control group， PDS group， GS group and GN group. A blank control group was added to an equal volume of cell culture fluid. MTT assay was used to detect the cell viability. The protein expressions of Nrf2， Keap1， Bcl-2， Bax， Caspase3 and Caspase9 were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group， the survival rate of SH-SY5Y cells in the model control group was significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model control group， the survival rates of PDS group， GS group and GN group increased， and the concentration of 1， 10， 240 μg/mL was selected as test concentration in PDS group， GS group and GN group （P < 0.01）. Compared with the blank control group， the protein levels of Keap1， Bax， Caspase3 and Caspase9 in SH-SY5Y of model control group were significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the protein levels of Bcl-2 and Nrf-2 were significantly decreased （P < 0.01）. Compared with the model control group， in PDS group and GS group the protein levels of Keap1， Bax， Caspase3 and Caspase9 were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and the protein levels of Bcl-2 and Nrf-2 were significantly increased （P < 0.01）. Conclusion PDS and GS from ginseng extract can protect human SH-SY5Y cells from the hydrogen peroxide-induced damage， and the mechanism may inhibit the oxidative stress by activating the Nrf-2 pathway in SH-SY5Y cells， and reduce apoptosis.endprint

[Key words] Panaxadiol saponins； Ginsenoside； Ginseng non-saponin； Hydrogen peroxide； Neuroblastoma injury

氧自由基對腦神經(jīng)細(xì)胞具有氧化修飾作用，是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的主要途徑之一[1]。近年來越來越多的資料證明，氧化應(yīng)激和線粒體參與可能是阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）主要的觸發(fā)因素[2]。細(xì)胞內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）通過誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）驅(qū)動基因核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）的激活引起細(xì)胞抗氧化反應(yīng)[3-4]。人參皂苷是人參主要活性成分，可以通過抗凋亡、抗氧化等一系列機(jī)制保護(hù)神經(jīng)[5]。有研究表明，人參皂苷Rg1可以修復(fù)過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷[6]，其作用機(jī)制與抗氧化抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)[7]。本研究主要觀察人參提取物中人參二醇型總皂苷（panaxadiol saponins，PDS）、人參總皂苷（ginsenoside，GS）、人參非皂苷（ginseng non-saponin，GN）對過氧化氫誘導(dǎo)的SY5Y細(xì)胞損傷的影響，并探討其機(jī)制與抑制氧化應(yīng)激及凋亡的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 SH-SY5Y細(xì)胞由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 人參二醇型總皂苷（hongjiu biotech公司，批號161204），人參總皂苷（hongjiu biotech公司，批號161101），人參非皂苷長春中醫(yī)藥大學(xué)自制。使用時(shí)用1640培養(yǎng)液稀釋配制成所需濃度工作液。β-actin（美國Proteintech公司，批號66009-1-Ig），Nrf2（美國Proteintech公司，批號16396-1-AP），Keap1（美國Proteintech公司，批號10503-2-AP），Bcl-2（美國Proteintech公司，批號12789-1-AP），Bax（美國Proteintech公司，批號50599-2-Ig），Caspase3（美國Proteintech公司，批號20538-1-AP），Caspase9（美國Cell Signaling Technolocy公司，批號#14697）。過氧化氫（北京化工廠，批號：20160218），四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Amresco 公司，批號40201ES80），RPMI-1640（美國Corning公司，批號10-040-CVR），組織細(xì)胞裂解液（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號：WB-0061），胎牛血清（美國Gibco公司，批號FB15015），BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號CW0051S）。

1.1.3 儀器 酶標(biāo)儀（TECAN公司），蛋白電泳儀（Hoffer公司），轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 將SH-SY5Y細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1%雙抗）放入含有5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及相關(guān)指標(biāo)檢測。SH-SY5Y細(xì)胞分為空白對照組、模型對照組、PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組。細(xì)胞接種24 h后配PDS濃度為1、5、10 μg/mL；GS濃度為10、50、100 μg/mL；GN濃度為240、1200、2400 μg/mL培養(yǎng)24 h。除空白對照組外均給予過氧化氫300 μmol/L孵育細(xì)胞4 h，消化收集細(xì)胞測定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 細(xì)胞存活率測定 采用MTT法。SH-SY5Y細(xì)胞以每孔4×104個(gè)/mL接種于96孔板中，每組細(xì)胞8復(fù)孔，培養(yǎng)結(jié)束前4 h每孔加入20 μL MTT，培養(yǎng)結(jié)束后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后，使結(jié)晶完全溶解，在490 nm波長下測定吸光度（A）值?？瞻讓φ战M細(xì)胞存活率設(shè)為100%，計(jì)算其余各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（各實(shí)驗(yàn)組A值/空白對照組A值）×100%。

1.2.3 氧化應(yīng)激相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。細(xì)胞經(jīng)分組處理后胰酶消化收集，提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后用TBST清洗膜3次，脫脂奶粉封閉1 h，再用TBST洗膜。將膜放入稀釋好的β-actin、Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax、Caspase9和Caspase3抗體中，4℃孵育過夜，在二抗中室溫孵育1 h，TBST洗膜，在BCIP/NBT顯色液中避光顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度值。各組蛋白表達(dá)相對強(qiáng)度=每個(gè)樣本條帶灰度值/β-actin條帶灰度值，進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度梯度PDS、GS、GN對SY5Y細(xì)胞抗凋亡作用24 h篩選

與空白對照組相比，模型對照組細(xì)胞存活率明顯降低（P < 0.01）；與模型對照組比較，PDS給藥組1、5、10 μg/mL細(xì)胞存活率顯著升高（P < 0.01），選取有效濃度的最低劑量即1 μg/mL做后續(xù)指標(biāo)檢測；GS給藥組、GN給藥組分別選取有效濃度的最低劑量為10、240 μg/mL做后續(xù)指標(biāo)檢測（P < 0.01）。

2.2 人參提取物對過氧化氫損傷SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)的影響

處理后的細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：空白對照組細(xì)胞胞體呈梭形；模型對照組細(xì)胞數(shù)量減少，胞體皺縮，且有的細(xì)胞呈圓形；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組細(xì)胞數(shù)量增多，胞體皺縮現(xiàn)象明顯改善；GN給藥組胞體皺縮現(xiàn)象明顯改善，但是數(shù)量增多不明顯。見圖1。endprint

2.3 人參提取物對過氧化氫損傷SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與空白對照組相比，模型對照組Nrf2表達(dá)明顯減少（P < 0.01），Keap1表達(dá)明顯增加（P < 0.01）；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組Nrf2表達(dá)明顯增加（P < 0.01），Keap1表達(dá)明顯減少（P < 0.01），GN給藥組Nrf2表達(dá)水平增強(qiáng)不明顯（P > 0.05），Keap1表達(dá)水平明顯減弱（P < 0.01）。

2.4 人參提取物對過氧化氫損傷SH-SY5Y細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與空白對照組相比，模型對照組Bcl-2表達(dá)水平明顯減弱（P < 0.01），Bax、Caspase9、Caspase3表達(dá)水平明顯增強(qiáng)（P < 0.05或P < 0.01）；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組Bcl-2表達(dá)水平明顯增強(qiáng)（P < 0.01），GN給藥組Bcl-2表達(dá)水平增強(qiáng)不明顯（P > 0.05）；PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組Bax、Caspase9、Caspase3表達(dá)水平較模型對照組明顯減弱（P < 0.05或P < 0.01），但GN給藥組減弱效果稍弱。見圖3、表5。

3 討論

人參皂苷具有多靶點(diǎn)、毒副作用小等優(yōu)勢，已成為近年來治療神經(jīng)退行性疾病的研究熱點(diǎn)[8]。氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用[9-10]，Nrf2在細(xì)胞抗氧化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。正常生理狀態(tài)下Nrf2被Keap1限制在細(xì)胞漿內(nèi)，當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1與Nrf2解聯(lián)，新合成的Nrf2轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，識別并結(jié)合ARE，從而啟動下游抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞的抗氧化能力[12]。Keap1-Nrf2信號傳導(dǎo)已成為預(yù)防和治療氧化應(yīng)激相關(guān)疾病和病癥的有吸引力的靶標(biāo)[13-14]。AD患者腦中Nrf2定位在細(xì)胞核，表達(dá)水平較正常對照組明顯下降[15]。本研究采用300 μmol/L過氧化氫處理SH-SY5Y細(xì)胞誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷，利用MTT對3種不同人參提取物篩選最佳濃度，采用有效濃度的最低劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最終確定以1、10、240 μg/mL為PDS給藥組、GS給藥組、GN給藥組實(shí)驗(yàn)濃度，進(jìn)行后續(xù)Western blot指標(biāo)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組相比，模型對照組Nrf2表達(dá)水平明顯減少，Keap1表達(dá)水平明顯增強(qiáng)。與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，Keap1表達(dá)水平明顯減弱；GN給藥組Nrf2表達(dá)水平增強(qiáng)效果不明顯，Keap1表達(dá)水平減弱效果明顯。說明PDS與GS有抗氧化應(yīng)激的神經(jīng)保護(hù)作用，能阻止Nrf2與其阻遏蛋白Keap1結(jié)合，從而使Nrf2更好地發(fā)揮抗氧化作用，GN抗氧化效果不如PDS與GS明顯。

Bax是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡家族成員，在正常細(xì)胞中主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，受到凋亡刺激后轉(zhuǎn)位到線粒體上，引起細(xì)胞色素C的釋放[16]。Bcl-2是其家族蛋白中最主要的抗凋亡蛋白，Bcl-2/Bax組成一個(gè)體系，Bax表達(dá)增多，可致細(xì)胞凋亡，而Bcl-2表達(dá)增多則抑制細(xì)胞凋亡[17]。Caspase9作為凋亡啟動因子處于級聯(lián)反應(yīng)的上游，可以識別及激活下游的Caspase-3。Caspase-3在細(xì)胞凋亡過程中作為主要效應(yīng)因子，其活化是細(xì)胞進(jìn)入凋亡不可逆階段的標(biāo)志[18-20]。本研究分別采用PDS、GS與GN處理過氧化氫損傷神經(jīng)細(xì)胞，比較其抗凋亡作用，結(jié)果表明，與空白對照組相比，模型對照組Bcl-2表達(dá)水平明顯減弱，Bax、Caspase9、Caspase3表達(dá)水平明顯增強(qiáng)；與模型對照組相比，PDS給藥組、GS給藥組Bcl-2表達(dá)水平明顯增強(qiáng)，GN給藥組Bcl-2表達(dá)水平增強(qiáng)不明顯；PDS給藥組、GS給藥組、Bax、Caspase9、Caspase3表達(dá)水平明顯減弱，GN給藥組減弱效果稍弱。說明PDS與GS具有抑凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，GN抗凋亡效果不如PDS與GS明顯。

綜上所述，PDS與GS可能通過促使受損SY5Y細(xì)胞中Nrf2與Keap1脫離進(jìn)入細(xì)胞核，提高下游抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax比值，抑制Caspase-9、Caspase-3表達(dá)，提高細(xì)胞的存活率，因此，PDS與GS對過氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。機(jī)制可能與激活Nrf2信號通路并抑制凋亡有關(guān)。PDS與GS是否可以作為一種潛在治療AD的藥物，還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-07-17 本文編輯：程 銘）endprint