溫州地區(qū)雞腸道大腸埃希菌耐藥性分析及血清型鑒定

侯鳳香 ，李培德，金俊杰，金大春，陳溥言

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095)

獸醫(yī)臨床

溫州地區(qū)雞腸道大腸埃希菌耐藥性分析及血清型鑒定

侯鳳香1，李培德1，金俊杰1，金大春1，陳溥言2

(1.溫州科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210095)

為研究溫州地區(qū)雞腸道大腸埃希菌的耐藥性和血清型，從27家養(yǎng)雞場(chǎng)采集泄殖腔拭子355份，分離并鑒定出346株雞大腸埃希菌，分離率為97.46%。在346株分離株中，對(duì)3種以上抗菌藥物耐藥的菌株占84.39%(292/346) ，呈現(xiàn)多重耐藥性。O血清型鑒定結(jié)果顯示，分離菌株分別屬于13個(gè)血清型，其中O138、O146、O136、O45占分離菌株的39.02%(135/346)，為優(yōu)勢(shì)血清型。

雞；大腸埃希菌；耐藥性；血清型

大腸埃希菌是一種重要的病原，是構(gòu)成胃腸道正常菌群的主要革蘭陰性兼性厭氧菌。在正常的雛雞體內(nèi)，腸道中10%～15%的大腸埃希菌屬于潛在致病菌[1]。大腸埃希菌在動(dòng)物居住的環(huán)境中大量存在，通過糞-口途徑傳播。在特定條件下，能夠?qū)е码u發(fā)病，隨宿主的年齡和感染方式的不同，表現(xiàn)形式多樣。大多數(shù)商品雞群都發(fā)生過一定程度的由大腸埃希菌感染造成的發(fā)病、死亡等，從多方面給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。

禽類和其他動(dòng)物的致病性大腸埃希菌具有共同的血清型、毒力因子以及耐藥性，而且禽大腸埃希菌菌株可能是編碼耐藥因子和毒力因子的基因或質(zhì)粒的來源[2]。禽類產(chǎn)品常被含有毒力因子和耐藥因子的大腸埃希菌污染，經(jīng)常成為人感染大腸埃希菌的來源。禽的大腸埃希菌分離株對(duì)人用抗菌藥物的耐藥性最小，但業(yè)已證明耐藥性細(xì)菌或質(zhì)粒從家禽到人之間的傳遞現(xiàn)象是普遍存在的[3-5]。

本研究從溫州27家雞場(chǎng)，采集臨床健康雞泄殖腔拭子，分離出346株大腸埃希菌，選取20種抗菌藥物，進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，并進(jìn)行血清型鑒定。為制定有效的用藥方案及控制大腸埃希菌耐藥性發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 346株菌株分別采集自溫州11個(gè)縣市區(qū)27家雞場(chǎng)內(nèi)的臨床健康雞群；大腸埃希菌質(zhì)控菌株ATCC25922，購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 Kary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；麥康凱、伊紅美藍(lán)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH平皿培養(yǎng)基，溫州康泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3細(xì)菌微量生化反應(yīng)管與藥敏紙片 腸桿菌科微量生化反應(yīng)管、鏈霉素(S)、卡那霉素(K)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、妥布霉素(TOB)、大觀霉素(SH)、復(fù)方新諾明(SXT)、氨芐西林(AMP)、頭孢唑林(KZ)、頭孢曲松(CRO)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢哌酮/舒巴坦(SCF)、阿莫西林/棒酸(AMC)、諾氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFX)、環(huán)丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)、四環(huán)素(TE)、多西環(huán)素(DO)、氟苯尼考(FFC)藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 大腸埃希菌O抗原診斷血清 大腸埃希菌O抗原診斷血清，天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，包括53種O抗原單價(jià)血清。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離、鑒定 采集臨床健康雞泄殖腔拭子樣品，移入Kary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基內(nèi)，于12 h內(nèi)劃線接種至麥康凱平皿培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h。挑取麥康凱平皿培養(yǎng)基上粉紅色單個(gè)菌落，劃線接種至伊紅美藍(lán)平皿培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18 h。挑取伊紅美藍(lán)平皿培養(yǎng)基上深紫色、帶金屬光澤單個(gè)菌落，劃線接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿培養(yǎng)基內(nèi)，37℃培養(yǎng)18 h[6]。將待檢菌接種至腸桿菌科微量生化反應(yīng)管中，37℃培養(yǎng)培養(yǎng)24 h～96 h ，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果，按說明書予以判定。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 按照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI) 推薦的K-B藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，每次測(cè)定均以質(zhì)控菌株ATCC25922為參照。根據(jù)CLSI—2016標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[7]。

1.2.3 血清型鑒定 血清型鑒定參照天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司提供的產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

對(duì)355份雞泄殖腔拭子樣品進(jìn)行大腸埃希菌分離培養(yǎng)，經(jīng)生化鑒定得到346株大腸埃希菌，分離率為97.46%。

2.1 藥物敏感性結(jié)果

分離到的346株雞腸道大腸埃希菌對(duì)20種抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。其中對(duì)四環(huán)素耐藥率最高，達(dá)84.10%；對(duì)氨芐西林、新諾明、多西環(huán)素保持很高的耐藥率，均達(dá)到70%以上；對(duì)頭孢曲松、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、阿莫西林/棒酸、卡那霉素、頭孢唑林、鏈霉素、氟苯尼考保持較高的耐藥率，(39.02%～58.67%)；對(duì)妥布霉素、氧氟沙星、慶大霉素表現(xiàn)輕度耐藥性(28.90%～31.5%)；對(duì)阿米卡星、大觀霉素敏感，耐藥率分別為6.94%和7.80%；對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦最敏感，耐藥率僅為0.87%(表1)。

2.2 多重耐藥性結(jié)果

在346株雞腸道大腸埃希菌分離株中，有15株對(duì)所有20種抗菌藥物敏感；無對(duì)20種抗菌藥物均耐藥的菌株；1株對(duì)19種抗菌藥物耐藥(19R)；8株對(duì)1種抗菌藥物耐藥(1R)，31株對(duì)2種抗菌藥物耐藥(2R)。在受試菌株中，3R以上菌株占84.39%(292/346)，多重耐藥性結(jié)果見圖1。

表1 雞腸道大腸埃希菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Drug sensitivity test result of avian intestinal Escherichia coli isolates

圖1 雞腸道大腸埃希菌對(duì)20種抗菌藥物的多重耐藥性分布Fig.1 Multiple drug resistance distribution of avian intestinal Escherichia coli isolates to 20 antimicrobial drugs

2.3 血清型結(jié)果

對(duì)346株雞腸道大腸埃希菌分離株進(jìn)行血清型鑒定，其中75株未定型，其余271株分別屬于13個(gè)血清型，包括O1、O20、O29、O45、O78、O86、O91、O112、O117、O136、O138、O143、O146，其中O138、O146、O136、O45血清型數(shù)量較多，占分離菌株39.02%(135/346) ，為優(yōu)勢(shì)血清型(表2)。

表2 雞腸道大腸埃希菌分離株的血清型Table 2 Serotypes of avian intestinal Escherichia coli isolates

3 討論

集約化飼養(yǎng)的家禽，應(yīng)用抗菌藥物促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，預(yù)防相關(guān)細(xì)菌性疾病，是廣泛使用的策略，但也導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌的泛濫，通過多種途徑到達(dá)人群。動(dòng)物源耐藥性細(xì)菌(如大腸埃希菌和腸球菌)，能夠定居在人類的腸道，成為人類病原菌耐藥性基因的潛在來源[5]。

大腸埃希菌耐藥情況較為復(fù)雜，不同地區(qū)菌株耐藥性差異較大。本研究調(diào)查了溫州地區(qū)健康雞群腸道大腸埃希菌對(duì)20種抗菌藥物的耐藥性情況，結(jié)果顯示，本地區(qū)雞腸道大腸埃希菌分離株對(duì)四環(huán)素、氨芐西林、新諾明、多西環(huán)素、氟苯尼考、鏈霉素、頭孢唑林、卡那霉素、阿莫西林/棒酸、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、頭孢曲松等14種抗菌藥物保持較高的耐藥性，與劉聚祥等報(bào)道的我國(guó)多個(gè)地區(qū)雞致病性大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素類、氟喹諾酮類藥物耐藥率較高相一致；本試驗(yàn)分離菌株對(duì)慶大霉素、妥布霉素、氧氟沙星耐藥程度較輕，對(duì)阿米卡星、大觀霉素敏感，分離菌株中僅有3株對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥。表明本地區(qū)雞腸道大腸埃希菌耐藥性嚴(yán)重。本地區(qū)養(yǎng)殖戶未使用過妥布霉素，但卻有100株分離菌株對(duì)其耐藥，可能是因?yàn)樵谄渌被擒疹愃幬锏倪x擇壓力下，攜帶鈍化酶基因的菌株所致[8]。有3株分離菌株對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦保持耐藥性，該藥在本地養(yǎng)殖場(chǎng)也從未被使用過，可能因?yàn)樵谄渌^孢類抗生素的選擇壓力下，篩選出產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌所致[9-11]。

本研究顯示，溫州地區(qū)雞腸道大腸埃希菌3R以上菌株占84.39%，最多的耐19種藥物，多重耐藥性問題嚴(yán)重，與國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者報(bào)道的食品動(dòng)物源大腸埃希菌的耐藥性不斷發(fā)展的趨勢(shì)相一致，即大腸埃希菌的耐藥譜越來越廣[12-15]。

國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道，從不同地區(qū)發(fā)病雞分離到的菌株，血清型種類較多，張燕飛等[16]從寧夏分離的雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型為O15、O18、O78、O88；丁伯良等[17]報(bào)道天津市雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O88、O2、O45、O53、O145;岳陽(yáng)市雞致病性大腸埃希菌以O(shè)78、O1、O2、O55為優(yōu)勢(shì)血清型[18]；揚(yáng)州市雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O2、O127、O18、O1[19]；馬興樹等[20]研究發(fā)現(xiàn)，冀南地區(qū)雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O65、O1、O93、O141；楊斌等[21]報(bào)道云南省雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型為O78、O11、O88；錦州市雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型為O15、O35[22]；本試驗(yàn)分離到的健康雞腸道大腸埃希菌菌株分別屬于O1、O20、O29、O45、O78、O86、O91、O112、O117、O136、O138、O143、O146等13個(gè)血清型，其中O138、O146、O136、O45為優(yōu)勢(shì)血清型，與上述學(xué)者從發(fā)病雞分離到的菌株差異較大，與Blanco J E等[23]報(bào)道的致病性大腸埃希菌與健康禽群所分離到的菌株血清型基本一致，了解溫州地區(qū)雞致病性大腸埃希菌優(yōu)勢(shì)血清型對(duì)于合理用藥和疫苗研制有重要參考作用。

本研究結(jié)果顯示，溫州地區(qū)雞腸道大腸埃希菌血清型眾多，耐藥率高，多重耐藥問題嚴(yán)重，能在一定程度上反映出本地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)抗菌藥物使用不規(guī)范。后續(xù)應(yīng)定期監(jiān)測(cè)大腸埃希菌耐藥性情況，根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果，及時(shí)調(diào)整用藥方案，指導(dǎo)疾病防控，以減緩耐藥性的發(fā)展和傳播。

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DrugResistanceandSerotypeIdentificationofIntestinalEscherichiacolifromChickeninWenzhou

HOU Feng-xiang1,LI Pei-de1,JIN Jun-jie1,JIN Da-chun1,CHEN Pu-yan2

(1.CollegeofAnimalSciences,WenzhouVocationalCollegeofScience&Technology,Wenzhou,Zhejiang,325006,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing,Jiangsu,210095,China)

To investigate the drug resistance and serotype of chicken intestinalEscherichiacoliin Wenzhou，355 cloaca swab samples were collected from 27 chicken farms in Wenzhou,346Escherichiacolistrains were isolated and identified through germiculture and biochemistry experiments,and the percentage of isolation was 97.46%.Among 346 isolates ofEscherichiacoli，84.39%(292/346) isolates showed resistance to more than three antimicrobial drugs.Multiple resistance to antimicrobial drugs was presented in the isolates ofEscherichiacolifrom healthy chickens.Thirteen O serotypes of were identified，of which serotypes of O138,O146,O136,O45 accounted for 39.02%(135/346) and were the prevalent serotypes.

chicken;Escherichiacoli; drug resistance; serotype

2017-02-12

溫州市公益性科技計(jì)劃項(xiàng)目(N20140038)；溫州市2015年農(nóng)業(yè)豐收計(jì)劃項(xiàng)目；溫州市甌海區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(N20150307)

侯鳳香(1982-)，女，山東鄆城人，碩士，講師，主要從事動(dòng)物傳染病學(xué)研究。

S852.612

B

1007-5038(2017)10-0114-04