銀杏葉提取物對COPD大鼠肺組織超微結構的影響*

潘玲，鄧禎，譚玉萍，楊紅梅，楊益寶，梁煒，李瑞祥

（廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

基礎研究·論著

銀杏葉提取物對COPD大鼠肺組織超微結構的影響*

潘玲，鄧禎，譚玉萍，楊紅梅，楊益寶，梁煒，李瑞祥

（廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

目的 研究銀杏葉提取物（GBE）對慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺組織超微結構的影響。方法將清潔級7周齡雄性Wistar大鼠90只稱重，隨機分組為正常對照組（A組）、COPD對照組（B組）、銀杏葉提取物早期干預組（C組）、銀杏葉提取物后期干預組（D組）、紅霉素早期干預組（E組）、紅霉素后期干預組（F），并復制模型。每組隨機選取6只，利用透射電鏡，觀察各組大鼠肺組織超微結構改變，計算線粒體病變率。結果 B、C、D、E、F組有COPD特征性改變，但程度不同。電鏡下觀察各組較B組結構更完整，線粒體各種病變發(fā)生率降低（P＜0.05），提示各治療組對COPD大鼠有積極治療作用。結論 GBE能夠延緩和改善COPD大鼠模型的形成。

慢性阻塞性肺疾?。汇y杏葉提取物；超微結構；線粒體病變率

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pul- monary disease，COPD）是一種累及氣道、肺實質及肺血管的常見慢性疾病。其特征是慢性炎癥的發(fā)展引起氣道重塑，導致氣流受限和肺組織破壞[1-2]。其高發(fā)病率與吸煙及空氣污染密切相關。前期研究證實，銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）能抑制肺氣腫的形成及肺血管重塑，早期干預效果更好[3-4]。本研究在前期研究的基礎上，設紅霉素早、晚期對照組，分別與GBE早、晚期干預組對比，在電鏡下觀察GBE和紅霉素對COPD大鼠肺組織超微結構的影響，研究兩者對COPD大鼠的療效及其區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑、材料及儀器 脂多糖（美國Sigma公司），過濾嘴香煙（南寧卷煙廠真龍牌香煙，尼古丁1.2 mg/支，焦油19 mg/支）。自制有機玻璃密閉箱（規(guī)格：80 cm×60 cm×50 cm，上方有一通氣孔，半徑為0.6 cm），透射電鏡（廣西醫(yī)科大學電鏡室提供，機型：日立HITACH H-7650），舒血寧注射液主要成分為 GBE，規(guī)格：5 ml/支，GBE 17.5 mg/支，河北神威藥業(yè)有限責任公司生產(chǎn)，注射用乳糖酸紅霉素30萬u/瓶（大連美羅大藥廠生產(chǎn)）。

1.1.2 動物選擇及分組 7周齡健康清潔級雄性Wistar大鼠（廣西醫(yī)科大學動物實驗中心供給，動物編號：SCXK20090002）90只，稱重后隨取分為正常對照組（A組）、COPD對照組（B組）、GBE早期干預組（C組）、GBE后期干預組（D組）、紅霉素早期干預組（E組）、紅霉素后期干預組（F組）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的復制 A組無需復制模型，于第1和第14天向大鼠氣管內注入0.9%氯化鈉溶液（2 ml/kg）。B、C、D、E、F 組采取煙霧吸入、氣管內注入脂多糖、冷空氣刺激復制COPD模型。28 d后，隨機處死B、C、D、E、F組大鼠各2只，以確認模型復制成功。

1.2.2 COPD動物模型評估 光鏡下觀察大鼠肺組織有以下COPD病理特征：各級支氣管周圍有炎癥細胞浸潤，氣道重塑，部分肺泡融合，甚至形成肺大泡。電鏡下可見支氣管纖毛柱狀上皮細胞胞漿腫大，呈大泡樣突起，部分纖毛脫落，未脫落的變短；Ⅱ型肺泡上皮細胞明顯變性，結構不清，核膜破壞，核染色質邊聚，板層小體減少，線粒體腫脹、空泡化、嵴破壞甚至消失，內質網(wǎng)擴張。血管內皮細胞腫脹變形，見大量成纖維細胞，提示COPD模型復制成功。

1.2.3 藥物干預 實驗第1～14天，C組用GBE干預，E 組用紅霉素干預；A、B、D、F 組用生理鹽水對照。實驗第29～42天，D組用GBE干預，F(xiàn)組用紅霉素干預；A、B、C、E組用生理鹽水對照。用藥量：C、D組0.4 ml/（kg·d）（根據(jù)成人標準量0.29 ml/kg，采取體表面積比值法：大鼠用藥量=成人量×70/56）；E、F組紅霉素用藥量根據(jù)體表面積換算為10 mg/kg2；A、B組用生理鹽水（1ml/只，1次/d）對照。采用腹腔注射給藥。

1.2.4 標本采集及制作 實驗完成后（即第43天），6組大鼠用10%烏拉坦麻醉，隨后每組隨機選6只剖取右肺下支氣管和肺組織1 mm×1 mm×1 mm，置于2.5%戊二醛固定液，1%鋨酸固定，醋酸雙氧鈾塊染，脫水，EUP 812包埋劑包埋。用鉆石刀切500 A超薄片，200目銅網(wǎng)撈起，醋酸雙氧鈾滴染，檸檬酸鉛復染，再進行投射電鏡觀察。

1.2.5 電鏡檢測 采用電子透射電鏡觀察，并且隨機拍攝全貌、局部及細胞器圖像，觀測并對比各組Ⅱ型肺泡上皮細胞、血管內皮細胞及成纖維細胞的超微結構變化。并計算線粒體和線粒體嵴的數(shù)量，計算每組每幅圖像里有病變征象的線粒體和線粒體嵴所占百分比。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.3統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用方差分析，方差齊則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況

實驗中因麻醉意外導致E組大鼠死亡1只。實驗前后6組大鼠體重比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表1）。實驗后B組與其余5組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），E組與 C、D 組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他各組相互比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（見表1）。精神狀況：A組良好，B組較差，C、E組一般，D、F組稍差；進食情況：A組良好，B組較差，C、E組一般，D、F組稍好。

2.2 肺組織外觀

解剖各組大鼠，A組大鼠兩肺形態(tài)正常，色淡粉，觸之光滑，質地柔軟，氣管及支氣管未見明顯分泌物；余各組均發(fā)現(xiàn)大鼠兩肺體積不同程度地增大，顏色較暗且略帶蒼白，觸之粗糙，質地偏韌硬，氣道黏膜紅腫，有較多的黏性分泌物。其中以B組情況最為嚴重。

表1 各組大鼠實驗前后體重比較 （n=13，g，±s）

表1 各組大鼠實驗前后體重比較 （n=13，g，±s）

組別 實驗前大鼠體重 實驗后大鼠體重A組 270.503±14.423 294.426±24.448 B 組 234.889±17.003 264.811±23.333 C 組 239.064±15.519 315.813±33.701 D組 234.943±11.527 308.462±25.976 E 組 248.496±20.971 288.418±17.257 F組 239.814±15.504 292.687±23.351 F值 9.326 6.452 P值 0.000 0.000

2.3 電鏡觀察結果

2.3.1 肺泡上皮細胞改變 A組大鼠支氣管上皮細胞纖毛排列整齊，基本無脫失、紊亂；肺組織Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞無異常，血管內皮細胞膜完整。其中，Ⅰ型肺泡上皮細胞胞漿內細胞器較少，Ⅱ型肺泡上皮細胞胞漿內富含板層小體及線粒體，板層小體結構正常，平行分布，線粒體嵴突完整，未見腫脹或變形。B組支氣管上皮細胞纖毛脫落、紊亂；Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮細胞結構嚴重異常，血管內皮細胞膜變性，微絨毛減少、斷裂甚至脫落；肺泡內可見上皮細胞壞死、脫落，并部分腔內可見滲出物；Ⅰ型上皮細胞出現(xiàn)增生，Ⅱ型上皮細胞可見損害性變化，部分板層小體明顯溶解，呈排空狀，肺泡腔內可見較多表面活性物質。部分線粒體腫脹明顯，嵴突斷裂或消失，內皮外基膜多處不完整，部分并有內質網(wǎng)擴張和肺泡壁纖維組織彌漫性增生。肺氣-血屏障有損傷，基底膜較A組變薄，部分有斷裂，肺泡隔毛細血管腔內凝血。C組與E組類似，大鼠支氣管纖毛排列較整齊，有少量脫失、紊亂；大鼠肺組織細胞微絨毛減少、斷裂情況少見；肺泡上皮細胞中的巨噬上皮細胞有所增多，體積較大，細胞漿豐富；板層小體空泡化少；肺泡腔內脫落的如巨噬細胞等炎癥細胞較少，滲出物較少。并可見成纖維細胞少量增生。D組與F組類似，大鼠支氣管纖毛較紊亂，可見脫落及紊亂，情況較B組輕，肺組織細胞微絨毛減少、斷裂情況較C組和E組稍嚴重；肺泡上皮細胞中的巨噬上皮細胞增多；板層小體空泡化較多；肺泡腔內脫落的如巨噬細胞等炎癥細胞及滲出物較多。見圖1。

圖1 各組Ⅱ型肺泡上皮細胞 （電鏡×20 000）

2.3.2 血管內皮細胞改變 A組大鼠血管內皮細胞膜未發(fā)生破裂，內質網(wǎng)無擴張。B組血管內皮細胞腫脹變形，甚至有細胞核染色質高度致密，呈核固縮表現(xiàn)。C組和E組血管內皮細胞腫大變形。D組和F組血管內皮細胞腫脹變形，程度較C組和E組加重。見圖2。

2.3.3 成纖維細胞改變 A組大鼠電鏡下可見成纖維細胞數(shù)量少，胞體較小。B組大鼠鏡下可見成纖維細胞數(shù)量明顯增多。C組和E組電鏡下可見成纖維細胞有增多，但不明顯。D組和F組可見成纖維細胞增多，程度較C組和E組稍嚴重。見圖3。

2.3.4 各組大鼠肺組織線粒體病變率比較 B組較A組的線粒體腫脹肥大、空泡變及嵴突病變的病變率均增高，而C、D、E、F組的線粒體各種病變率較A組增高，而較B組降低。其中C、D、E、F組中，C、E組較D、F組的病變率低，C、D組較E、F組有所降低（P＜0.05）?？梢娝幬锔深A能一定程度降低COPD大鼠肺組織的線粒體病變率，以GBE早期干預的效果最佳。見表2。

圖2 各組血管內皮細胞 （電鏡×30 000）

圖3 各組成纖維細胞 （電鏡×30 000）

表2 各組大鼠肺組織線粒體病變率比較 （n=13±s）

表2 各組大鼠肺組織線粒體病變率比較 （n=13±s）

組別 病變線粒體/個 腫脹肥大/%A組 21.133±1.192 20.745±1.481 B組 78.296±3.453 85.862±5.643 C組 42.508±3.967 41.809±3.064 D組 52.891±4.143 48.744±1.231 E組 44.554±4.156 43.417±2.949 F組 56.013±4.193 50.134±1.832 F值 156.318 282.929 P值 0.000 0.000空泡變/% 嵴突病變/%20.604±1.476 21.561±1.994 77.952±1.101 80.184±3.621 25.986±1.593 30.993±2.681 38.981±2.768 24.882±1.041 27.011±1.682 33.731±2.706 40.041±2.924 28.232±1.334 625.127 496.008 0.000 0.000

3 討論

COPD發(fā)病的普遍性及危害性，給社會造成巨大危害，給患者造成巨大的經(jīng)濟負擔。目前認為COPD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是氣道炎癥，在氣道、肺實質及肺血管都存在肺泡巨噬細胞和中性粒細胞增加，激活的炎癥細胞可釋放TNF-α、IL-8、IFN-γ等多種炎癥介質，以上多種炎癥介質能使肺組織的結構產(chǎn)生毀損，并有促進粒細胞炎癥反應的作用[5]。有文獻表明，氣道、肺血管的慢性炎癥反應導致結構變化，在COPD發(fā)病機制中發(fā)揮重要的作用，產(chǎn)生該作用可能與氧化應激的線粒體功能障礙有關[6-7]。經(jīng)常吸煙或處在污染空氣中易引起內皮功能受損，內皮細胞功能異常被認為是血管增殖和血管結構異常的最主要因素之一[8]。有學者電鏡下觀察，暴露于煙草、煙霧及脂多糖可造成肺組織毛細血管內皮細胞線粒體減少、水腫，飲泡增多，與基底膜連接處增厚，肺小動脈內彈力膜菲薄、斷裂，管壁大量膠原纖維增生，而預防性使用紅霉素可干預上述的超微結構變化，電鏡下可見內皮細胞無明顯脫落，管壁平滑肌增殖，但膠原纖維增生明顯減少[9-11]。邵有和[12]和歐莉梅等[13]研究證實，紅霉素治療COPD穩(wěn)定期能降低痰白細胞總數(shù)和中性粒細胞比例，急性發(fā)作次數(shù)明顯減少，說明紅霉素對控制COPD急性發(fā)作是有積極意義的。張軍等[14]的研究進一步說明，紅霉素不但能預防COPD患者的急性發(fā)作，而且能降低COPD急性發(fā)作的嚴重程度。

積極探索應用中醫(yī)中藥治療COPD對于控制發(fā)病次數(shù)、降低病死率、減輕社會負擔有重要的意義。銀杏葉治療肺系疾病在我國有著十分悠久的歷史，最早載于《神龍本草經(jīng)》，有潤肺、止咳、平喘的功效。GBE是銀杏樹干燥葉的提取物，成分主要為黃酮類、萜內酯類，以及少量的多酚類、生物堿、長鏈醇、酮類及微量元素等。近年來國內外研究表明，GBE具有抗氧化，清除自由基，拮抗PAF，抑制細胞凋亡，調節(jié)細胞間黏附分子-1表達及興奮性氨基酸釋放，改善微循環(huán)等多種作用[15]。

本實驗參照劉鑫等[16]的煙霧吸入、氣道內注入脂多糖聯(lián)合冷空氣刺激的方法復制COPD模型，分別用GBE和紅霉素進行早、晚期干預。用足療程后觀察大鼠一般情況，電鏡下觀察氣管和肺血管的變化情況。結果顯示，造模未治療組存在COPD急性加重的癥狀，經(jīng)過治療后各組癥狀有所減輕，其中C組和E組情況最好。解剖各組大鼠發(fā)現(xiàn)，造模組顏色較暗且?guī)в猩n白色，觸之粗糙，質地偏韌硬，氣道黏膜腫脹，可見有較多的黏性分泌物。治療組情況較造模組改善。電鏡下觀察GBE干預組和紅霉素干預組大鼠支氣管纖毛排列較整齊，有少量脫失、紊亂；大鼠肺組織細胞微絨毛減少、斷裂情況少見；肺泡上皮細胞中的巨噬上皮細胞增多，體積較大，細胞漿豐富；板層小體空泡化少；肺泡腔內脫落的如巨噬細胞等炎癥細胞較少，滲出物較少；且GBE干預組和紅霉素干預組大鼠肺組織線粒體的病變率較造模組減少。以上說明GBE能一定程度上減輕支氣管和小動脈周圍的炎癥反應，從而抑制其結構重塑。這與紅霉素的作用效果類似。有研究證實，紅霉素不僅具有抗菌作用，在治療COPD時其免疫調節(jié)作用可能比抗菌作用更為重要[17]。早期研究證實GBE能抑制肺泡融合等肺泡結構改變，還對減少腺泡內肺血管壁周圍的炎癥細胞、肺動脈血管平滑肌細胞增殖，抑制肺血管重塑有較好的效果。劉忠等[18-19]研究表明，GBE可降低AE-COPD血清中IL-8和TNF-α濃度，抑制COPD大鼠ET-1、TGF-β1水平，對AE-COPD氣道炎癥具有抑制作用。GBE對COPD模型大鼠的肺臟具有治療作用，可能是其重要作用機制。樓黎明等[20]的研究結果表明，GBE可降低AE-COPD患者血清E-selectin和VCAM-1水平，改善肺功能，與本研究結果一致。

綜上所述，GBE能在一定程度上延緩和改善大鼠肺組織及肺血管周圍炎癥，抑制支氣管、肺血管結構重塑，延遲肺間質纖維化的進展，降低線粒體的病變率。其作用與紅霉素類似，并有可能優(yōu)于紅霉素，進一步研究GBE的具體抗炎機制將是筆者接下來的研究方向。

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Effect ofGinkgo bilobaextract on pulmonary ultrastructures of rats with chronic obstructive pulmonary disease*

Ling Pan,Zhen Deng,Yu-ping Tan,Hong-mei Yang,Yi-bao Yang,Wei Liang,Rui-xiang Li
(Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530011,China)

Objective To study the intervention effect ofGinkgo bilobaextract (GBE)on thepulmonary ultrastructural changes in rats with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods Ninety Wistar rats were randomly divided into normal control group(group A),COPD control group(group B),early-stage GBE treatment group (group C),late-stage GBE treatment group (group D),Erythromycin early-treatment group(group E),and Erythromycin late-stage treatment group (group F).Six rats were randomly seleted from each group,ultrastructural changes of the lungs were observed by transmission electron microscopy,and the rates of pathological changes of mitochondria were calculated.Results The groups B,C,D,E and F all showed characteristic pathological changes of COPD to different extent.Under the transmission electron microscope,the ultrastructures in the groups C,D,E and F were more complete than those in the group B,and the rates of mitochondrial lesions were conspicuously lowered in the treatment groups,suggesting that GBE had a positive therapeutic effect.Conclusions GBE has inhibitory effects on airway and vascular remodeling in rat model of COPD.

chronic obstructive pulmonary disease;Ginkgo biloba extract;ultrastructure;rate of mitochondrial lesion

R541.5

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.001

1005-8982（2017）26-0001-06

2017-01-11

國家自然科學基金（No：81260005）

譚玉萍，Tel：0771-2326770；E-mail：tanlaoshi1226@126.com

（童穎丹 編輯）