太湖蘆葦根系中溶藻菌的分離鑒定及溶藻效果

沈紅池+潘瑞松+吳旭鵬+蔡慶慶+張文藝

摘 要：富含氮、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)的污水排入河流、湖泊，造成藍(lán)藻爆發(fā)，而溶藻菌可以有效降解水體中的藍(lán)藻污染。從藍(lán)藻污染嚴(yán)重的太湖百瀆港岸邊蘆葦根系中篩選出1株溶藻菌（Bacillus sp），命名為G6，系統(tǒng)發(fā)育分析表明，G6菌株與芽孢桿菌同源性最高。將培養(yǎng)至對數(shù)期的G6菌液以菌藻比1∶10的比例，在溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗比12 h∶12 h的條件下經(jīng)光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，對銅綠囊藻液Chla去除率可達(dá)82%。此外，G6菌株在無光照條件下也具有溶藻特性，這有利于其在缺少光照的深水域中增殖并發(fā)揮溶藻作用。G6通過分泌溶藻物質(zhì)殺滅銅綠囊藻，屬于間接溶藻，且溶藻物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性，能夠在較高溫度下發(fā)揮溶藻特性。

關(guān)鍵詞：溶藻菌；銅綠微囊藻；16SrDNA；溶藻效果

中圖分類號：X703

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1674-4764（2017）05-0123-06

Abstract： Large amounts of sewage with nitrogen， phosphorus， potassium and other nutrients into the river lake will cause the algae bloom. Algae-lysing bacteria which can effectively degrade cyanobacteria in water is a potential treatment. An algicidal bacterium against toxic Microcystis aeruginosastrain G6 is isolated from reed roots in Baidu port of Taihu Lake. According to phylogenetic analysis， strain G6（Bacillus sp） is identified as Bacillus sp .The strain G6 which cultivated to the logarithmic phase is voted to water with bacteria and algae ratio of 1∶10. The Chl-a of algae fluid could be reduced up to 82% when it is placed in the light incubator of 28 ℃ temperature， light intensity 2 500 lux， and photoperiod 12 h∶12 h for 7 days. Strain G6 has the character that it can kill the algae cells without light. It is conducive to bacteria breeding and degradate algae in the deep sea which lack of light. The strain G6 could produce substance which can dissolv algae to kill microcystis aeruginosa， which is an indirect way to kill algae. The substance has thermal stability to kill the algae cells at high temperature.

Keywords：algicidal bacteira； microcystis aeruginosa； 16SrDNA； algicidal effect

隨著工農(nóng)業(yè)發(fā)展，富含氮、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)的污水逐漸排入河流、湖泊中，造成水體富營養(yǎng)化日益加劇，藍(lán)藻大規(guī)模爆發(fā)，水資源越發(fā)緊缺，水生物的生存環(huán)境受到威脅[1-3]。藍(lán)藻的死亡不僅會產(chǎn)生惡臭，其分泌的藻毒素還具有致癌性，嚴(yán)重威脅著飲用水安全和人類的身體健康[4-6]。

除藻的方法主要有物理、化學(xué)和生物方法[7]。物理法有機(jī)械除藻、直接過濾法、超聲法等[8]，但這些方法都存在著成本高，耗時(shí)長的缺點(diǎn)。化學(xué)法主要通過投加化學(xué)試劑來進(jìn)行殺藻，殘留的化學(xué)藥劑仍然滯留在水體中容易造成二次污染[9-10]。所以，物理和化學(xué)方法都不能從根本上解決藍(lán)藻污染問題。溶藻菌控藻正在受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注，不少學(xué)者認(rèn)為，每年藍(lán)藻的突然消失可能與自然中存在的溶藻菌有關(guān)[11-15]。溶藻菌來源廣泛，繁殖速度快，安全無污染，可以作為一種安全有效的生物除藻方法。陳慶麗等[16]從水華爆發(fā)處的水樣中篩選出一株溶藻菌，對藻液作用18 h時(shí)，藻細(xì)胞已經(jīng)喪失恢復(fù)能力。溶藻菌的溶藻方式一般分為直接溶藻和間接溶藻，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的溶藻菌以間接控藻為主。

筆者從藍(lán)藻污染嚴(yán)重的江蘇太湖百瀆港岸邊的蘆葦根系中篩選出一株溶藻菌命名為G6，通過對其進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和溶藻能力測定，以期為藍(lán)藻控制提供高效菌株。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，G6菌株在無光照和有光照條件下均對銅綠微囊藻具有較好的溶解作用，這種特性有利于降解缺少光照的深水域中爆發(fā)的藍(lán)藻，能夠更加全面的解決藍(lán)藻爆發(fā)問題。在此基礎(chǔ)上，提取G6菌株的DNA，測定16S rDNA序列，并利用MEGA 5.05構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其在細(xì)菌分類學(xué)上的地位。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藻種及培養(yǎng) 選用的藻種為銅綠微囊藻（M.aeruginosa）FACHB-905，購于中科院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫。將購買的藻靜置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件：溫度28 ℃、光照強(qiáng)度2 500 lx、光照周期比12 h∶12 h。endprint

1.1.2 培養(yǎng)基 1）溶藻菌用LB液體培養(yǎng)基[17]：蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，酵母浸膏5 g/L，pH7.2；固體培養(yǎng)基再加瓊脂15 g/L；2）藻的培養(yǎng)基為BG11：微量溶液：H3BO3 2.86 g，MnCl2·4H2O 1.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g，Na2MoO4·H2O 0.39 g，CuSO4·5H2O 0.08 g，Co（NO3）2·6H2O 0.05 g，蒸餾水1 000 mL。NaNO3 1.5 g，K2HPO4 0.04 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，CaCl2·2H2O 0.036 g，檸檬酸鐵銨 0.006 g，EDTA-Na20.001 g，Na2CO3 0.02 g，微量溶液1 mL，蒸餾水 1 L，pH7.1。

上述所用到的培養(yǎng)基均需在高壓滅菌鍋內(nèi)于溫度121 ℃、100 kPa條件下滅菌20 min后使用。

1.2 方法

1.2.1 溶藻細(xì)菌的分離篩選

從太湖岸邊挖出整顆蘆葦，收集蘆葦根系及其周圍土壤，并于4 ℃下保存。稱取樣品和無菌水以1∶10的比例混合，置于搖床，在130 r/min轉(zhuǎn)速、30 ℃下震蕩6～7 h，采用梯度稀釋法稀釋后，進(jìn)行平板涂布，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇不同的菌落分別用接種環(huán)劃線分離培養(yǎng)2～3 d，然后純化培養(yǎng)3～4次，得到菌株進(jìn)行溶藻效果測定。將效果好的優(yōu)勢菌種放置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，將菌株在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，以菌藻比1∶10投加到新鮮藻液中，6 d后比較各菌株的Chla去除率，選出最佳菌株。

1.2.2 溶藻細(xì)菌的鑒定 1）生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[18-19]；2）16Sr DNA序列分析方法：DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測定由微生物分析檢測中心完成，確定其種屬。挑選GenBank數(shù)據(jù)庫中發(fā)表的菌株，運(yùn)用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 生長曲線繪制

從細(xì)菌斜面培養(yǎng)基中挑取一環(huán)菌接入裝有200 mL滅菌后的新鮮細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，在溫度為30 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min的培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。以無菌液體培養(yǎng)基作為空白，每隔2 h測定菌株培養(yǎng)液在600 nm處的吸光度，測到吸光度明顯下降結(jié)束。根據(jù)測得的數(shù)據(jù)繪制菌株的生長曲線。

1.2.4 溶藻計(jì)算方式

利用乙醇法提取葉綠素，測定每天的葉綠素a含量并計(jì)算[20]。

溶藻率=空白組Chla-處理組Chla空白組Chla×100%

剩余率=100%-溶藻率

1.2.5 菌藻比對溶藻效果的影響

將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的量投加，并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定Chla剩余含量，計(jì)算其溶藻率。

1.2.6 光照時(shí)間對溶藻效果的影響

將培養(yǎng)18 h的菌液以菌藻比1∶10的投加量在光暗周期為0 h∶24 h（全黑暗）、24 h∶0 h（全光照）、12 h∶12 h這3個(gè)不同的光照條件下進(jìn)行溶藻實(shí)驗(yàn)，保持光照培養(yǎng)箱溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx，每隔24 h取樣測定Chla含量，計(jì)算溶藻率。

1.2.7 菌齡對溶藻效果的影響

設(shè)置不同細(xì)菌生長階段（遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期），將菌液以菌藻比1∶10的比例投加到藻液中，并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔24 h取樣測定Chla含量，計(jì)算溶藻率。

1.2.8 溶藻方式對溶藻效果的影響

設(shè)置以下4種方式處理菌液：1）培養(yǎng)18～24 h的對數(shù)期菌液；2）將菌液1）經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌；3）收集2）中濾膜，經(jīng)無菌水洗滌3～4次，制備菌懸液；4）將菌液1）高溫高壓（121 ℃、1.0×105Pa）滅活處理25 min。將上述4種菌液按照菌藻比1∶10的比例投加到100 mL新鮮銅綠微囊藻液中。每隔24 h取樣測Chla剩余含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株形態(tài)

表1為G6菌株的生理生化特性結(jié)果。表2是從太湖蘆葦根系土中篩選出的12株菌株的形態(tài)特征及其溶藻效果。圖1為革蘭氏染色后的G6在油鏡下的顯微圖像，可見其呈紫色，屬于陽性菌。菌細(xì)胞呈短桿狀，芽孢橢圓。

2.2 G6細(xì)菌16SrDNA序列分析

圖2的電泳圖條帶清晰，說明DNA提取和PCR擴(kuò)增效果較好。圖3中挑選16株同源性為99%株菌進(jìn)行序列比對，通過系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，菌株G6與Bacillus sp. hb29親緣關(guān)系最近，并處于同一分支，自展值為91，相似性為99%，所以篩選出來的G6菌為芽孢桿菌（Bacillus sp）。馬洪瑞從活性污泥中篩選出一株芽孢桿菌對銅綠微囊藻的降解效果達(dá)到91.36%，說明芽孢桿菌確實(shí)存在溶藻效果。

2.3 生長曲線

由圖4可以看出，菌株G6最大OD600為0.769。10 h以后就進(jìn)入了對數(shù)生長期，對數(shù)時(shí)期營養(yǎng)物質(zhì)較充裕，菌能夠得到生長所需要的足夠的營養(yǎng)，所以生長速度很快，菌數(shù)呈恒定幾何數(shù)增長。44 h后隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌的繁殖速度減弱，菌株死亡率升高，G6的細(xì)菌增殖與死亡趨于平衡，進(jìn)入穩(wěn)定期。72 h后營養(yǎng)物質(zhì)幾乎消耗，菌株的死亡率增加超過繁殖速度，進(jìn)入衰亡期。

2.4 菌藻比對溶藻效果的影響

如圖5所示，當(dāng)菌藻比為1∶50時(shí)，此時(shí)藻液中培養(yǎng)基的含量很低，沒有足夠的營養(yǎng)物質(zhì)供菌生長，銅綠微囊藻的生長速率遠(yuǎn)高于菌的生長速率，因此，菌藻比為1∶50時(shí)，圖中葉綠素的含量呈上升趨勢，菌對于除藻沒有起到作用。endprint

當(dāng)菌藻比為1∶2、1∶5、1∶10、1∶20時(shí)，都能對藻液起到降解效果。從藍(lán)藻去除率的關(guān)系圖中可以看出，隨著菌液投加量的增加，溶藻效率逐漸增加。而在1～3 d之間，投加量為20、50 mL處的溶藻效率從第1 d就比較高，但是，隨著時(shí)間的增長變化不大。而投加量為5、10 mL時(shí)，前3 d的除藻效果并不好，可能是因?yàn)橥都拥木伲c藻類作用的速度相對減慢。而到第4 d時(shí)，菌藻比為1∶10、1∶20的去除效果已經(jīng)基本與菌藻比為1∶2、1∶5一致，而此時(shí)，1∶10的菌藻比效果最好，在第3 d可以達(dá)到去除率42%。

2.5 光暗周期對溶藻效果的影響

如圖6所示，在全光照、全黑暗以及光暗周期12 h∶12 h條件下菌株對銅綠微囊藻都有降解效果。第1天全暗條件下藻的去除效果比全光照以及光暗周期12 h∶12 h時(shí)去除效果好，可能是藻缺少光合作用生長速度減慢。隨著時(shí)間的增加，菌藻混合液的顏色由綠變黃，但從圖中看，光暗周期12 h∶12 h時(shí)，藻的去除效果更好一些，說明接近自然光照條件能夠使溶藻菌起到更好的溶解藻效果，有利于實(shí)際應(yīng)用。同時(shí)，菌在全光照和全黑暗條件下仍對銅綠微囊藻有去除效果，可能是菌種來自黑暗中的蘆葦根系土中，所以，菌在黑暗中能夠生長，在光亮下也有很好的繁殖能力。G6菌株的這種特性有利于降解缺少光照的深水域中爆發(fā)的藍(lán)藻，能夠更加全面地解決藍(lán)藻爆發(fā)問題。

2.6 菌齡對溶藻效果的影響

根據(jù)生長曲線培養(yǎng)不同生長時(shí)期的菌液，由圖7可以看出，遲滯期、對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的菌都對銅綠微囊藻具有降解效果。但是，衰亡期的菌株從第4 d開始對銅綠微囊藻的去除效果就沒有其他幾個(gè)生長時(shí)期明顯。遲滯期菌株開始時(shí)降解藻的效果比較明顯，第4～7 d溶藻率幾乎沒有提高，可能這個(gè)時(shí)期的菌活性不強(qiáng)，后期溶藻能力較差。對數(shù)時(shí)期和穩(wěn)定時(shí)期的溶藻效果都很明顯，1～3 d時(shí)銅綠微囊藻去除效果較慢，到第4 d時(shí)溶藻效果就較為明顯，第6、7 d去除率能夠達(dá)到76%。這兩個(gè)時(shí)期的菌活性較強(qiáng)，繁殖較快，對銅綠微囊藻的去除效果很明顯。

2.7 溶藻方式對溶藻效果的影響

由圖8可知，4種不同的處理方式有3種均能不同程度的抑制銅綠微囊藻的生長。細(xì)菌在無菌水中不能很好的繁殖，細(xì)菌數(shù)量不夠，達(dá)不到溶藻的效果，在水中，菌的繁殖能力也有限。而未處理的菌液、菌液過濾液和高溫處理菌液均對銅綠微囊藻表現(xiàn)出較為明顯的去除效果，最后都能達(dá)到82%。說明溶藻效果并沒有隨著菌株的高溫滅菌或者將菌體過濾掉而減弱，細(xì)菌的溶藻方式更有可能是菌株分泌的胞外物質(zhì)對銅綠微囊藻生長產(chǎn)生了抑制作用。溶藻菌一般是通過分泌蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽等物質(zhì)來抑制藻的生長，而高溫高壓下處理過的菌株對銅綠微囊藻仍有較好的降解效果，說明菌株分泌的物質(zhì)具有熱穩(wěn)定性，可能不屬于蛋白質(zhì)[21]。因此，G6菌株可能是通過分泌非蛋白質(zhì)的胞外物質(zhì)達(dá)到溶藻的目的，屬于間接溶藻方式。目前，仍未找到通用的溶藻活性物質(zhì)的方法，所以，只能通過物質(zhì)性質(zhì)初步推算溶藻物質(zhì)。

3 結(jié)論

1）從太湖岸邊的蘆葦根系分離篩選出1株溶藻細(xì)菌G6。菌液在對數(shù)期、菌藻比1∶10、光暗比12 h∶12 h的實(shí)驗(yàn)條件下溶藻效果最佳。菌藻培養(yǎng)7 d后銅綠囊藻液Chla去除率高達(dá)82%。因此，蘆葦根系可作為高效溶藻菌篩選的新菌種來源。G6菌株經(jīng)生理生化試驗(yàn)及菌株16SrDNA分子鑒定可知其為陽性菌，屬于芽孢桿菌。

2）G6通過分泌具有熱穩(wěn)定性的物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對銅綠囊藻的殺滅、溶藻，屬于間接溶藻。而G6菌株所具有的在無光照條件下也能溶藻這一特性，有利于對缺少光照的深水域中增殖，并對藍(lán)藻進(jìn)行殺滅、溶解。

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（編輯 王秀玲）endprint