老年支氣管哮喘患者PAI-1、STAT2基因多態(tài)性分析

操麗芳，高穎，管立學(xué)，張華芳，李蕾，李峰

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261041；2濰坊市人民醫(yī)院)

老年支氣管哮喘患者PAI-1、STAT2基因多態(tài)性分析

操麗芳1，高穎2，管立學(xué)2，張華芳2，李蕾2，李峰2

(1濰坊醫(yī)學(xué)院，山東濰坊 261041；2濰坊市人民醫(yī)院)

目的探討老年支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)患者纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子2(STAT2)基因多態(tài)性。方法選擇80例老年哮喘患者(哮喘組)及80例老年健康查體者(對(duì)照組)。采用PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)兩組靜脈血PAI-1基因啟動(dòng)子區(qū)基因型(4G/4G型、5G/5G型、4G/5G型)和STAT2基因型(CG型、GG型、CC型)。結(jié)果哮喘組PAI-1基因4G/4G、4G/5G、5G/5G基因型及4G等位基因分別為33、36、11、102例，對(duì)照組分別為17、41、22、75例，除4G/5G基因型外，其他指標(biāo)兩組相比P均<0.05。哮喘組STAT2基因CC、CG、GG基因型及C等位基因分別為0、7、73、7例，對(duì)照組分別為0、3、77、3例，兩組相比P均>0.05。哮喘組PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG例數(shù)高于對(duì)照組(P均<0.05)。PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG發(fā)生哮喘的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)OR=2.22，95%CI=1.1～4.5，P<0.05。結(jié)論P(yáng)AI-1基因4G/4G基因型是老年哮喘發(fā)病的易感基因型；STAT2基因CG多態(tài)性與老年哮喘無(wú)明顯關(guān)聯(lián)；PAI-1基因4G/4G基因型和STAT2基因GG基因型在老年哮喘發(fā)病上具有協(xié)同作用。

纖溶酶原激活物抑制劑1；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子2；單核苷酸多態(tài)性；老年人；哮喘

近年我國(guó)支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)病患數(shù)量日益增長(zhǎng)，其中老年哮喘發(fā)病率、病死率呈遞增趨勢(shì)。哮喘是由多種炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)相互作用的慢性氣道炎癥疾病，各型各期哮喘的共同病理學(xué)特征均為氣道炎癥。研究[1]顯示，哮喘的發(fā)生、發(fā)展受遺傳和環(huán)境因素的雙重影響，其中遺傳因素在哮喘中起到極為重要的作用;目前發(fā)現(xiàn)的與哮喘病相關(guān)基因超過(guò)80個(gè)，幾乎涵蓋所有人類染色體。纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)是纖溶蛋白溶解系統(tǒng)的主要抑制劑，是纖維蛋白形成和降解的主要調(diào)節(jié)因子。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活因子2(STAT2)是由STATs基因編碼并在胞質(zhì)內(nèi)以一種潛在的單體形式存在的蛋白家族成員。STATs家族在組織和細(xì)胞中分布廣泛，可介導(dǎo)多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等信號(hào)向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在炎癥性疾病及免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[2]。PAI-1通過(guò)加重細(xì)胞外基質(zhì)沉積，產(chǎn)生氣道重塑；STAT2通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路產(chǎn)生生長(zhǎng)因子、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)促進(jìn)氣道慢性炎癥及氣道重塑；兩者是否在哮喘產(chǎn)生過(guò)程存在協(xié)同作用，目前國(guó)內(nèi)外無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。本研究分析了老年哮喘患者PAI-1、STAT2基因多態(tài)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年10月～2016年10月來(lái)濰坊市人民醫(yī)院就診的80例老年哮喘患者(哮喘組)，其中男43例、女37例，年齡65～95歲、平均74.6歲。哮喘診斷參照《支氣管哮喘防治指南2008版》[3]診斷標(biāo)準(zhǔn)。另選擇與哮喘組患有相同基礎(chǔ)疾病的我院非哮喘老年健康查體者80例(對(duì)照組)，經(jīng)病史、體檢、實(shí)驗(yàn)室、X線及心電圖檢查，排除肺間質(zhì)病、支氣管擴(kuò)張、肺癌及致肺部病變的全身免疫性疾病。對(duì)照組中男49例、女31例，年齡65～83歲、平均71.2歲。兩組一般資料具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)患者本人和家屬知情同意，并獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 PAI-1、STAT2基因多態(tài)性觀察方法

1.2.1 基因組DNA抽取 采集所有研究對(duì)象靜脈血2 mL，EDTA抗凝，應(yīng)用STMT buffer處理抗凝靜脈血，采用酚/氯仿法提取基因組DNA。

1.2.2 PAI-1基因引物序列設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)由Sangon公司合成，擴(kuò)增引物位于PAI-1基因5′端啟動(dòng)子區(qū)-555～-697 bp，上游引物為5′-CACAGAGAGAGTCTGGCCACGT-3′(C為非配對(duì)堿基)，下游引物為5′-CAGCCACGTGATTGTCTAGGT-3′。PCR反應(yīng)條件:反應(yīng)體系為25 μL，含基因組DNA 100 ng，引物各0.3 μmoL，Tag DNA聚合酶1.0 U。采用PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ公司生產(chǎn))擴(kuò)增。反應(yīng)條件：先94 ℃預(yù)變性5 min，再按94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s的程序共循環(huán)35個(gè)周期，最后72 ℃延伸10 min。并采用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，其反應(yīng)體系20 μL，PCR產(chǎn)物5 μL，限制酶BseLⅠ(Fermentas Life Sciences)10 U，37 ℃，酶切3 h。最終行12% PAGE電泳分型，AgNO3染分析基因型。PAI-1基因PCR產(chǎn)物為142 bp，經(jīng)BseLⅠ酶切消化后產(chǎn)生不同的特異性片段，有3種基因型：4G/4G型產(chǎn)生96、46 bp 2條帶，5G/5G型產(chǎn)生74、46、22 bp 3條帶，4G/5G型產(chǎn)生96、74、46、22 bp 4條帶。

1.2.3 STAT2基因引物序列設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)由Sangon公司合成，對(duì)rs2066807C→G多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。PCR引物設(shè)計(jì)：P1為5′-CTCGGAAGGTGGCTAATGTC-3′，P2為5′-AAAGGAGAGGCTGTGGAAAT-3′。PCR反應(yīng)條件:反應(yīng)體系為25 μL，含基因組DNA 100 ng，引物各0.3 μmoL，Tag DNA聚合酶1.0 U。采用PTC-100型PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ公司生產(chǎn))擴(kuò)增。反應(yīng)條件：先94 ℃預(yù)變性5 min，再按94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s的程序共循環(huán)35個(gè)周期，最后72 ℃延伸10 min。并采用限制性內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，其反應(yīng)體系20 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，內(nèi)切酶Tth111Ⅰ 10 U，置37 ℃水浴，消化3 h。最終采用6%PAGE電泳分型，AgNO3染色后觀察酶切結(jié)果。STAT2基因有3種基因型：CG型擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)366、244、122 bp 3條帶，GG型擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)244、122 bp 2條帶；CC型擴(kuò)增產(chǎn)物為長(zhǎng)366 bp 1條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。用直接計(jì)數(shù)法計(jì)算各等位基因的表型頻率；χ2檢驗(yàn)分析兩組PAI-1和STAT2基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律；用χ2檢驗(yàn)和比值比(OR)分析PAI-1、STAT2基因與老年哮喘的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果 哮喘組、對(duì)照組PAI-1和STAT2基因達(dá)到遺傳平衡，具有代表意義。

2.2 兩組PAI-1基因型與等位基因分布情況 見(jiàn)表1。

表1 兩組PAI-1基因型與等位基因分布比較(例)

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05。

2.3 兩組STAT2基因型與等位基因分布情況 兩組STAT2基因型與等位基因分布比較P均>0.05，見(jiàn)表2。

表2 兩組STAT2基因型與等位基因分布比較(例)

2.4 兩組PAI-1與STAT2聯(lián)合基因型分布比較 見(jiàn)表3。PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG發(fā)生哮喘的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)OR=2.22，95%CI=1.1～4.5，P<0.05。

表3 兩組PAI-1與STAT2聯(lián)合基因型分布比較(例)

注：與對(duì)照組相比，#P<0.05。

3 討論

哮喘是氣道慢性炎癥疾病，病理生理學(xué)主要特征為氣道重塑、氣道炎癥。哮喘的發(fā)生與炎癥刺激氣道致氣道重塑有關(guān)，而宿主易感性及環(huán)境各方面因素可共同導(dǎo)致氣道炎癥，并促進(jìn)氣道內(nèi)黏液分泌增加、水腫等改變，進(jìn)一步為炎癥浸潤(rùn)提供條件，加重哮喘。老年人肺基礎(chǔ)功能相對(duì)減弱，氣道對(duì)刺激的敏感性逐漸降低，所以臨床上老年患者易出現(xiàn)急性哮喘，且極有可能為危重型哮喘合并呼吸衰竭，威脅患者生命[4]。因此，研究哮喘易感基因型將有助于發(fā)現(xiàn)高危老年人群，并有利于及早合理選擇有效預(yù)防及治療方案，改善老年患者生活質(zhì)量。

氣道炎癥導(dǎo)致氣道高反應(yīng)，炎性細(xì)胞在其環(huán)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用，其中尤為重要的是肥大細(xì)胞的激活。在IgE介導(dǎo)下，肥大細(xì)胞迅速脫顆粒釋放炎性介質(zhì)(包括5-羥色胺、白三烯B4、前列腺素D2)，而這些介質(zhì)可直接增高過(guò)敏性哮喘速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增強(qiáng)、支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌增加等[5]哮喘過(guò)敏反應(yīng)，并且哮喘患者肥大細(xì)胞也可分泌PAI-1參加哮喘的發(fā)生。有研究[6]表明，PAI-1通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和纖維蛋白溶解酶的活性促進(jìn)氣道的膠原沉積，促進(jìn)氣道高反應(yīng)、過(guò)敏性炎癥、氣道重塑的發(fā)生，加重哮喘。PAI-1作為PAI系統(tǒng)中發(fā)揮60%的纖溶酶原抑制作用的特異性抑制物[5]，它的編碼位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂(q21.3～22)，全長(zhǎng)12.2 kb，包含了9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子。目前研究[7]發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因上有8種基因多態(tài)位點(diǎn)，其中PAI-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-675位點(diǎn)存在單個(gè)鳥(niǎo)嘌呤的缺失或插入，導(dǎo)致PAI-1基因存在3種多態(tài)性。研究顯示，4G/5G基因多態(tài)性是決定血漿PAI-1水平主要基因因素[8]；且研究[9～13]報(bào)道指出PAI-1基因4G/5G基因多態(tài)性與哮喘之間存在風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系，其中4G/4G基因型可被定義為哮喘的潛在易感基因型。本研究結(jié)果亦證明，PAI-1基因4G/4G為老年哮喘患者易感基因型。

STAT2基因的編碼位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂(q13.2)，全長(zhǎng)18 kb，是STAT蛋白家族成員之一，其編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為113 kDa。STAT蛋白家族成員STAT1a與細(xì)胞因子相關(guān)受體結(jié)合后被磷酸化，形成二聚體被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活子的作用[14]。在抗原因子刺激下，STAT2被有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫促分化作用的IFN-α和IFN-β活化[15]，并與發(fā)生磷酸化的STAT1結(jié)合形成二聚體，通過(guò)JAK-STAT信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用[16]，可影響Th2細(xì)胞分化，進(jìn)一步誘導(dǎo)IgE分泌和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)哮喘發(fā)生。有文獻(xiàn)[17]表明，STAT1蛋白的過(guò)量活化會(huì)有助于其依賴基因細(xì)胞間黏附因子1的過(guò)量表達(dá)，促進(jìn)NO的產(chǎn)生，進(jìn)一步加重氣道炎癥和氣道高反應(yīng)，為哮喘提供分子基礎(chǔ)。阻斷STAT2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及堿性成纖維生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移、微血管增生，而在哮喘氣道重構(gòu)過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及微血管增生是必不可少的[18]。目前STAT2單基因?qū)ο〉挠绊懭源嬖跔?zhēng)議，Hsieh等[19]對(duì)117例臺(tái)灣哮喘病兒童進(jìn)行STAT2基因、CD40基因、TLR4基因多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果顯示STAT2基因的CG基因型與C等位基因與哮喘發(fā)病有關(guān)聯(lián),攜帶C等位基因型的個(gè)體哮喘風(fēng)險(xiǎn)高于G等位基因型6倍，而與其他基因的多態(tài)性無(wú)關(guān)聯(lián)。但也有文獻(xiàn)[20]報(bào)道，STAT2基因與哮喘無(wú)關(guān)聯(lián)。本研究中哮喘組與對(duì)照組STAT2基因多態(tài)位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，STAT2基因多態(tài)性與老年哮喘的關(guān)聯(lián)性不密切，其研究結(jié)果的不一致可能與地區(qū)受限以及樣本量過(guò)小有關(guān)。同時(shí)，哮喘為多個(gè)致病基因共同作用的結(jié)果，并非是單基因病，因此單基因的作用可能相對(duì)較小。

哮喘患者的支氣管平滑肌細(xì)胞、炎性細(xì)胞可在體外產(chǎn)生大量PAI-1，抑制纖溶酶的分裂作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1釋放減量，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞合成膠原[21]。在疾病狀態(tài)下，PAI-1促進(jìn)血管的形成[22],而STAT2參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后同樣有使微血管增生的作用；同時(shí)STAT2可誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，而PAI-1與肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞可形成復(fù)雜的參與氣道重塑的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。二者可相互促進(jìn)使人體發(fā)生哮喘或加重哮喘。本研究的STAT2基因、PAI-1基因聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果示PAI-1基因型為4G/4G且STAT2基因型為GG個(gè)體發(fā)生哮喘的風(fēng)險(xiǎn)比其他聯(lián)合基因型增加2.22倍，表明STAT2基因和PAI-1基因在老年哮喘發(fā)病上具有協(xié)同作用。

[1] Koppelman GH. Gene by environment interaction in asthma[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2006,6(2):103-111.

[2] Darnell JE. STATs and gene regulation[J]. Science, 1997,277(5332):1630-1635.

[3] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)[J/OL].中華哮喘雜志(電子版),2008,2(1):3-13.

[4] Wang Y, Li L, Han R, et al. Diagnostic value and influencing factors of fractional exhaled nitric oxide in suspected asthma patients[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(5):5570-5576.

[5] 李俠.uPA/uPAR/PAI纖溶酶原激活系統(tǒng)與哮喘[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2007,8(5):670-673.

[6] Ma Z, Paek D, Oh CK. Plasminogen activator inhibitor-1 and asthma: role in the pathogenesis and molecular regulation[J]. Clin Exp Allergy, 2009,39(8):1136-1144.

[7] 蔣建中,尹士全,孫根義.急性心肌梗死與纖溶酶原激活抑制物-1及其基因多態(tài)性相關(guān)性研究[J].吉林醫(yī)學(xué),2010,31(27):4684-4685.

[8] Eriksson P, Kallin B, Van′t Hooft FM, et al. Allele-specific increase in basal transcription of the plasminogen-activator inhibitor 1 gene is associated with myocardial infarction[J]. P Natl Acad Sci USA, 1995,92(6):1851-1855.

[9] Kowal K, Bodzenta-Lukaszyk A, Pampuch A, et al. Analysis of 675 4G/5G SERPINE1 and C-159T CD14 polymorphisms in house dust mite-allergic asthma patients[J]. J Investig Allergol Clin Immuno, 2008,18(4):284-292.

[10] Ozbek OY, Atac FB, Ogus E, et al. Plasminogen activator inhibitor-1 gene 4G/5G polymorphism in Turkish children with asthma and allergic rhinitis[J]. Allergy Asthma Proc, 2009,30(1):41-46.

[11] Cosan D, Kurt E, Kurt H, et al. Plasminogen activator inhibitor type-1 gene 4G/5G polymorphism in Turkish adult patients with asthma[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2009,13(4):543-546.

[12] 張曉巖,林江濤,楊萌，等.PAI-1基因多態(tài)性對(duì)哮喘氣道重塑影響的研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2009,13(23):1-6.

[13] Dijkstra A, Postma DS, Bruinenberg M, et al. SERPINE1-675 4G/5G polymorphism is associated with asthma severity and inhaled corticosteroid response[J]. Eur Respir J, 2011,38(5):1036-1043.

[14] Pruitt KD, Tatusova T, Maglott DR. NCBI Reference Sequence (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins[J]. Nucleic Acids Res, 2005,33(suppl 1):501-504.

[15] Gamero AM, Young MR, Mentor-Marcel R, et al. STAT2 contributes to promotion of colorectal and skin carcinogenesis[J]. Cancer Prev Res, 2010,3(4):495-504.

[16] Takeuchi K, Kadota S, Takeda M, et al. Measles virus V protein blocks interferon (IFN)-α/β but not IFN-γ signaling by inhibiting STAT1 and STAT2 phosphorylation[J]. FEBS Lett, 2003,545(2-3):177-182.

[17] Guo FH, Comhair SA, Zheng S, et al. Molecular mechanisms of increased nitric oxide (NO) in asthma: evidence for transcriptional and post-translational regulation of NO synthesis[J]. J Immunol T, 2000,164(11):5970-5980.

[18] Finkenzeller G, Sparacio A, Technau A, et al. Sp1 recognition sites in the proximal promoter of the human vascular endothelial growth factor gene are essential for platelet-derived growth factor-induced gene expression[J]. Oncogene, 1997,15(6)：669-676.

[19] Hsieh YY, Wan L, Chang CC, et al. STAT2* C related genotypes and allele but not TLR4 and CD40 gene polymorphisms are associated with higher susceptibility for asthma[J]. Int J Biol Sci, 2009,5(1):74.

[20] 劉志翠,管立學(xué),于維新，等.STAT2基因rs2066807C→G多態(tài)性與哮喘病的關(guān)聯(lián)研究[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2010,18(3):28-29.

[21] 韓照升,徐軍,李時(shí)悅,等.支氣管哮喘患者氣道黏膜活檢組織MMP-9表達(dá)的臨床研究[J].中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志,2002,22(6):331-333.

[22] Pepper MS, Montesano R, Mandriota SJ, et al. Angiogenesis: a paradigm for balanced extracellular proteolysis during cell migration and morphogenesis[J]. Enzyme Protein, 1996,49(1-3):138-162.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.016

R725

B

1002-266X(2017)38-0053-04

李峰(E-mail： 13963678789@163.com)

2017-02-19)