宋婷婷
(兗礦集團(tuán)公司總醫(yī)院,山東鄒城 273500)
異鉤藤堿對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響及機(jī)制
宋婷婷
(兗礦集團(tuán)公司總醫(yī)院,山東鄒城 273500)
目的觀察異鉤藤堿(Iso)對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響,并探討其機(jī)制。方法從新生SD大鼠分離出心肌細(xì)胞,將細(xì)胞分為對照組、AngⅡ組、低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組,對照組正常培養(yǎng),AngⅡ組用含有1 μmol/L AngⅡ的培養(yǎng)基培養(yǎng);低劑量Iso組用含有1 μmol/L AngⅡ和0.1 μmol/L Iso的培養(yǎng)基培養(yǎng);中劑量Iso組用含有1 μmol/L AngⅡ和1 μmol/L Iso的培養(yǎng)基培養(yǎng);高劑量Iso組用含有1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Iso的培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)測定各組心肌細(xì)胞表面積。BCA檢測試劑盒測定對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組培養(yǎng)12、24、48 h心肌細(xì)胞的蛋白含量;比色法檢測一氧化氮合酶(NOS)活力;硝酸還原法檢測一氧化氮(NO)含量;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡;Western blotting法檢測Bcl-2、Bax、I-κB、p-NF-κB蛋白表達(dá)。結(jié)果大鼠心肌細(xì)胞表面積AngⅡ組、低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組較對照組大,低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組較AngⅡ組小,中劑量Iso組、高劑量Iso組較低劑量Iso組小,高劑量Iso組較中劑量Iso組小(P均<0.01)。同時間點(diǎn)大鼠心肌細(xì)胞蛋白含量AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組高,中劑量Iso組較AngⅡ組低,且AngⅡ組、中劑量Iso組本組內(nèi)24、48 h較12 h時高,48 h較24 h時高(P均<0.01)。大鼠心肌細(xì)胞NOS活力、NO含量、細(xì)胞凋亡率及Bax、p-NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組高,中劑量Iso組較AngⅡ組低(P均<0.01)。大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組低,中劑量Iso組較AngⅡ組高(P均<0.01)。結(jié)論Iso對AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大起抑制作用,其機(jī)制與調(diào)控NF-κB信號通路,進(jìn)而下調(diào)NOS活力、減少NO釋放、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
異鉤藤堿;血管緊張素;心肌肥大;心肌細(xì)胞表面積;細(xì)胞凋亡;一氧化氮合酶;核轉(zhuǎn)錄因子κB
心肌肥大是引起心血管疾病患者死亡的重要原因,現(xiàn)已成為心血管疾病發(fā)病和死亡的獨(dú)立危險因素。心肌肥厚的主要特征有心肌總蛋白的合成量增多、心肌細(xì)胞的表面積增大及心肌間質(zhì)和血管結(jié)構(gòu)成分改變,是心肌在長期超負(fù)荷工作條件下的一種適應(yīng)性反應(yīng)。研究[1,2]表明,許多生長因子和血管的活性物質(zhì)參與了心肌重構(gòu)及血管損傷的病理過程,在這些影響因素中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一個主要的刺激因素,具有生長因子樣作用,可直接引起心肌肥厚。異鉤藤堿(Iso)和鉤藤堿為同分異構(gòu)體,是常用的傳統(tǒng)中藥鉤藤中所含的主要生物堿。已有研究[3,4]顯示,Iso能舒張血管、抗血管成纖維細(xì)胞增殖、抗炎、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等多種作用,目前已用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管疾病的治療。但I(xiàn)so對心肌細(xì)胞肥大的影響及機(jī)制尚不清楚。因此,2015年8月~2016年7月本研究觀察了Iso對AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大的影響,并探討其機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑、儀器 出生1~3 d的SD大鼠8只,雌雄不限,由山東大學(xué)提供。AngⅡ購自美國Sigma公司;Iso購自廣西中藥研究所;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶均購自美國Gibco公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司;BCA試劑盒、一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所;Bcl-2、Bax、I-κB、p-NF-κB單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購自美國Cell Signal公司;流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)購自德國Leica公司;酶標(biāo)儀、PAGE凝膠電泳儀、電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司;紫外分光光度計(jì)購自北京普析儀器有限公司。
1.2 大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及分組處理 取8只新生SD大鼠,無菌條件下開胸取出心尖組織,D-Hanks洗滌3次后剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎塊,用0.8 g/L的胰蛋白酶消化分離后,將消化完全的細(xì)胞加入含有10%小牛血清及90% DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~1.5 h。采用差速貼壁法純化心肌細(xì)胞,非心肌細(xì)胞貼壁速度較快,首先附著在瓶底,心肌細(xì)胞在細(xì)胞懸液中,吸出細(xì)胞懸液,加入含有15% FBS、1%雙抗(100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2 d后換成含0.4%的小牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 d后加入處理因素。將細(xì)胞分為對照組、AngⅡ組、低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組,對照組用不含血清及Iso的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),AngⅡ組用含有1 μmol/L AngⅡ的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);低劑量Iso組用含有1 μmol/L AngⅡ和0.1 μmol/L Iso的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);中劑量Iso組用含有1 μmol/L AngⅡ和1 μmol/L Iso的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);高劑量Iso組用含有1 μmol/L AngⅡ和10 μmol/L Iso的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
1.3 各組大鼠心肌細(xì)胞表面積測算 收集上述生長至對數(shù)期的5組心肌細(xì)胞,以4×107/L的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,24 h后進(jìn)行HE染色,通過Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)對心肌細(xì)胞的表面積進(jìn)行測定。每組隨機(jī)選擇7個視野,每個視野中測定10~15個心肌細(xì)胞,測定100個心肌細(xì)胞的表面積,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.4 各組大鼠心肌細(xì)胞蛋白含量檢測 取對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組細(xì)胞以5×108/L密度接種至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)12、24、48 h。吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基,PBS洗滌細(xì)胞3次。加入適量的RIPA裂解液后收集細(xì)胞,用超聲破碎細(xì)胞,4 ℃、1 200 r/min離心20 min,取上清。按照BCA檢測試劑盒操作規(guī)定測定并計(jì)算每孔心肌細(xì)胞的蛋白含量。
1.5 各組大鼠心肌細(xì)胞NOS活力、NO含量檢測 取對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,比色法檢測NOS活力。取100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液,根據(jù)NOS試劑盒操作說明,用紫外分光光度計(jì)檢測530 nm波長處的吸光度值,計(jì)算NOS活力。硝酸還原法檢測NO含量。取50 μL細(xì)胞培養(yǎng)液,按照NO試劑盒操作說明,用酶標(biāo)儀檢測540 nm波長處的吸光度值,用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量。
1.6 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率測算 取生長至對數(shù)期的細(xì)胞,以4×109/L將心肌細(xì)胞接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察到細(xì)胞融合度達(dá)到70%~80%時,按上述對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組方法處理細(xì)胞。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,Annexin V-FITC結(jié)合液重新懸浮細(xì)胞,避光室溫孵育10 min,離心,棄上清,PI冰盒中避光孵育10 min。加400 μL緩沖液。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。
1.7 各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、p-NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組培養(yǎng)24 h心肌細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞,用適量的裂解液置于冰上裂解反應(yīng)30 min。收集細(xì)胞,4 ℃、14 000 r/min離心15 min,收集上清。采用BCA試劑盒測定提取的蛋白濃度。充分混勻蛋白樣品和上樣緩沖液后,100 ℃變性5 min。將變性蛋白加入到SDS-PAGE凝膠孔中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后4 ℃轉(zhuǎn)膜1.5 h,5%的脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h,以1∶500稀釋的Bcl-2、Bax、NF-κB、I-κB單克隆抗體作為一抗,4 ℃孵育過夜。TBST清洗后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h,TBST清洗后加入ECL發(fā)光劑顯影,自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參,分析蛋白表達(dá)水平。
2.1 各組大鼠心肌細(xì)胞表面積比較 對照組、AngⅡ組、低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組大鼠心肌細(xì)胞表面積分別為(161.9±11.8)、(505.8±22.4)、(439.6±16.9)、(321.5±17.8)、(221.3±14.6)μm2,AngⅡ組、低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組與對照組相比,低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組與AngⅡ組相比,低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組兩兩相比,P均<0.01。
2.2 各組大鼠心肌細(xì)胞蛋白含量比較 見表1。
表1 各組大鼠心肌細(xì)胞蛋白含量比較
注:與對照組比較,*P<0.01;與AngⅡ組比較,#P<0.01。
2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞NOS活力及NO含量比較 對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組大鼠心肌細(xì)胞NOS活力分別為(3.2±0.4)、(5.8±0.6)、(4.6±0.5)kU/L,NO含量分別為(4.6±0.3)、(7.2±0.5)、(5.9±0.4)μmol/L,AngⅡ組、中劑量Iso組與對照組相比,中劑量Iso組與AngⅡ組相比,P均<0.01。
2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率分別為2.28%±0.56%、21.24%±1.64%、14.35%±1.11%,AngⅡ組、中劑量Iso組與對照組相比,中劑量Iso組與AngⅡ組相比,P均<0.01。
2.5 各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、p-NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)比較 對照組、AngⅡ組、中劑量Iso組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)分別為0.367±0.037、0.108±0.016、0.221±0.026,Bax蛋白表達(dá)分別為0.211±0.025、0.415±0.051、0.293±0.032,p-NF-κB蛋白表達(dá)分別為0.142±0.039、0.363±0.043、0.261±0.023,I-κB蛋白表達(dá)分別為0.341±0.034、0.611±0.054、0.482±0.029,AngⅡ組、中劑量Iso組與對照組相比,中劑量Iso組與AngⅡ組相比,P均<0.01。
心肌肥厚初期的適應(yīng)性反應(yīng)有益于正常心肌輸出量的維持,但長期的超負(fù)荷狀態(tài)則誘發(fā)心肌重構(gòu),導(dǎo)致心力衰竭、心肌收縮力降低、猝死等的發(fā)生,從而使心臟疾病的病死率增加[5~7]。因此,研究引起心肌肥大發(fā)生發(fā)展的因素,并尋找抑制心肌肥厚有效的藥物,對于心臟疾病的治療具有重要意義。
在心肌肥大形成的病理過程中,AngⅡ是一個重要的體液因子,可引起細(xì)胞間質(zhì)的堆積及心肌細(xì)胞的肥大,從而導(dǎo)致心肌肥大的發(fā)生[8]。目前已有許多研究證實(shí)AngⅡ是引起心肌肥大的誘導(dǎo)劑[9]。本研究結(jié)果顯示,大鼠心肌細(xì)胞表面積AngⅡ組、低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組較對照組大,低劑量Iso組、中劑量Iso組、高劑量Iso組較AngⅡ組小,中劑量Iso組、高劑量Iso組較低劑量Iso組小,高劑量Iso組較中劑量Iso組?。煌瑫r間點(diǎn)大鼠心肌細(xì)胞蛋白含量AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組高,中劑量Iso組較AngⅡ組低,且AngⅡ組、中劑量Iso組本組內(nèi)24、48 h較12 h時高,48 h較24 h時高??梢姡珹ngⅡ可引起心肌細(xì)胞表面積增大及細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)增多,且不同濃度的Iso均能緩解AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積的增大,呈濃度依賴性。Iso作用不同時間可降低AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)蛋白含量降低,呈時間依賴性。
NO是一個心血管系統(tǒng)的關(guān)鍵信號分子。已有研究[10]證實(shí),NO和NOS參與了高血壓、氧化應(yīng)激、炎癥、高膽固醇血癥等多種心血管疾病的病理發(fā)展過程。心肌細(xì)胞在正常情況通過內(nèi)皮型的NOS合成少量的NO以維持機(jī)體的生理功能,當(dāng)受到細(xì)胞因子、內(nèi)毒素等一些刺激因素時則促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá),使NO合成量增多,從而引起機(jī)體的病理過程[11,12]。本研究結(jié)果顯示,大鼠心肌細(xì)胞NOS活力及NO含量AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組高,中劑量Iso組較AngⅡ組低??梢姡珹ngⅡ可引起NO釋放增多并上調(diào)NOS表達(dá),而Iso能降低NO釋放和NOS表達(dá)。
已有研究[13]證實(shí),心肌細(xì)胞的凋亡參與心室重塑的形成,并誘導(dǎo)心力衰竭的發(fā)生。原癌基因存在于各種生物體內(nèi),其中Bax有促凋亡作用,Bcl-2有抑凋亡作用,Bcl-2/Bax有決定細(xì)胞是否進(jìn)入凋亡的重要作用[14,15]。有研究[16]表明,心肌細(xì)胞中的Bcl-2參與心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。本研究結(jié)果顯示,大鼠心肌細(xì)胞凋亡率AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組高,中劑量Iso組較AngⅡ組低;大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組低,中劑量Iso組較AngⅡ組高,Bax蛋白表達(dá)情況與之相反??梢?,AngⅡ能引起心肌細(xì)胞凋亡,下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)并上調(diào)Bax蛋白表達(dá);而Iso能降低心肌細(xì)胞凋亡,使Bcl-2蛋白表達(dá)增多、Bax蛋白表達(dá)減少。
心肌肥大是心臟對神經(jīng)體液刺激及生物機(jī)械牽張的一種主要反應(yīng)。多種信號通路的激活參與心肌肥大反應(yīng),包括MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、NF-κB信號通路等[17~19]。NF-κB是Rel蛋白家族的成員,以同型或者是異型二聚體的形成存在。NF-κB二聚體在大多數(shù)細(xì)胞中與抑制蛋白I-κB結(jié)合,以無活性的形式在胞質(zhì)中存在。NF-κB參與了細(xì)胞的生長和分化、炎癥、內(nèi)毒素休克、免疫反應(yīng)等過程[20]。NF-κB的激活可引起心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)[21]。本研究結(jié)果顯示,大鼠心肌細(xì)胞p-NF-κB、I-κB蛋白表達(dá)AngⅡ組、中劑量Iso組較對照組高,中劑量Iso組較AngⅡ組低。可見,AngⅡ可上調(diào)p-NF-κB和I-κB蛋白表達(dá),而Iso能減弱NF-κB和I-κB蛋白表達(dá)。
綜上所述,Iso對AngⅡ誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞肥大起抑制作用,其機(jī)制與調(diào)控NF-κB信號通路,進(jìn)而下調(diào)NOS活力、減少NO釋放、抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
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