漢防己乙素對人肺癌95D細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制

于有江 ，羅雪，葉記林，蘇蘭娣，彭建明

(揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

漢防己乙素對人肺癌95D細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制

于有江 ，羅雪，葉記林，蘇蘭娣，彭建明

(揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

目的觀察漢防己乙素對人肺癌95D細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。方法取人肺癌95D細(xì)胞分為4組，實(shí)驗(yàn)1、2、3組分別加入8、16、32 μmol/L的漢防己乙素，溶劑對照組加入等體積0.1%的DMSO。采用流式細(xì)胞儀測算各組細(xì)胞凋亡率，H2DCF-DA法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，Caspase-3活性測定試劑盒檢測Caspase-3活性，半定量RT-PCR法檢測BCL-2、BAX mRNA。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1、2、3組及溶劑對照組細(xì)胞凋亡率分別為6.71%±1.26%、17.07%±1.88%、25.78%±0.44%、5.41%±1.40%，ROS水平分別為117.7%±5.5%、151.0%±4.6%、212.0%±5.6%、100.0%±0.0%,Caspase-3活性分別為119.3%±5.7%、175.0%±13.1%、251.3%±17.0%、100.0%±3.0%，BCL-2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.93±0.02、0.75±0.04、0.61±0.04、1.00±0.03，BAX mRNA相對表達(dá)量分別為1.10±0.02、1.63±0.04、1.85±0.04、1.00±0.02，實(shí)驗(yàn)1、2、3組與溶劑對照組相比P<0.05或<0.01。結(jié)論漢防己乙素可誘導(dǎo)人肺癌95D細(xì)胞凋亡，這可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平、活化Caspase-3、激活BAX、抑制BCL-2實(shí)現(xiàn)的。

肺腫瘤；漢防己乙素；細(xì)胞凋亡；活性氧；半胱氨酸蛋白酶3；B淋巴細(xì)胞瘤-2；BCL-2相關(guān)X蛋白

近年來，肺癌的治療取得了較大的進(jìn)展，但5年生存率仍低于10%。漢防己乙素是從中藥粉防己等植物中提取的化學(xué)活性成分之一，具有降低血糖、抑制主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、抗高血壓和抗氧化等多種生物學(xué)功能[1,2]。近年來發(fā)現(xiàn)，漢防己乙素對乳腺癌、肝癌、前列腺癌、白血病等多種惡性腫瘤具有良好的抗癌效果[2～5]。但迄今為止，關(guān)于漢防己乙素在肺癌中作用的報(bào)道較少，其具體的分子機(jī)制尚不明確。細(xì)胞凋亡是抗癌藥物抑制腫瘤生長的重要機(jī)制之一，活性氧(ROS)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)和BCL-2相關(guān)X蛋白(BAX)在細(xì)胞凋亡中起重要作用。2016年5～``月，本研究觀察了漢防己乙素對人肺癌95D細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源及主要試劑 人肺癌95D細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。漢防己乙素購自上海詩丹德生物公司，純度為98%，用二甲基亞砜(DMSO)配成200 mmol/L的貯存液。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)為AMRESO產(chǎn)品；Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ROS測定試劑盒和Caspase-3活性測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人肺癌95D細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 漢防己乙素濃度篩選 采用MTT法觀察細(xì)胞增殖能力。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。24 h后藥物組加入不同濃度(2、4、8、16、24、32、48、64 μmol/L)的漢防己乙素，溶劑對照組加等體積0.1%的DMSO，同時(shí)設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的孔為空白對照。終止培養(yǎng)前4 h每孔加入10 μL MTT。培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加入100 μL DMSO溶解反應(yīng)產(chǎn)物，在酶標(biāo)儀上檢測492 nm時(shí)的OD值。細(xì)胞存活率=(藥物組OD值-空白對照OD值)/(溶劑對照組OD值-空白對照OD值)×100%。2、4、8、16、24、32、48、64 μmol/L漢防己乙素處理人肺癌95D細(xì)胞存活率分別為94.8%±2.4%、86.3%±0.2%、71.7%±0.8%、61.2%±1.4%、38.5%±1.6%、19.5%±2.4%、15.2%±3.5%、13.2%±3.1%，取8、16、32 μmol/L的漢防己乙素進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)以便于觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.4 細(xì)胞凋亡率測算 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于6孔板中，每孔3 mL。實(shí)驗(yàn)1、2、3組24 h后加入不同濃度(8、16、32 μmol/L)的漢防己乙素，溶劑對照組加等體積0.1%的DMSO。48 h后，將各組細(xì)胞用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后用500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，并先后加入Annexin V和碘化丙啶(PI)輕輕混勻。室溫避光孵育15 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測 細(xì)胞處理方法同1.4。48 h后，將各組細(xì)胞用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌后加入H2DCF-DA熒光探針至終濃度為10 μmol/L，在37 ℃下避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。

1.6 細(xì)胞Caspase-3活性檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，接種于T75培養(yǎng)瓶中，每瓶15 mL。實(shí)驗(yàn)1、2、3組24 h后加入不同濃度(8、16、32 μmol/L)的漢防己乙素，溶劑對照組加等體積0.1%的DMSO。48 h后，將各組細(xì)胞用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次后按照Caspase-3活性測定試劑盒方法進(jìn)行測定。吸盡上清后，按照每200萬細(xì)胞加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。4 ℃ 16 000 r/min離心15 min。把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中。設(shè)置如下反應(yīng)體系：樣品50 μL、檢測緩沖液40 μL、2 mmol/L Ac-DEVD-pNA 10 μL，對照組加入50 μL裂解液作為對照。37 ℃孵育60～120 min后測定405 nm處的OD值。Caspase-3相對活性=實(shí)驗(yàn)組或溶劑對照組OD值/對照組OD值。

1.7 細(xì)胞BCL-2、BAX mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR法。細(xì)胞處理方法同1.4。48 h后，取實(shí)驗(yàn)1、2、3組和溶劑對照組細(xì)胞，用TRIzol 抽提細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)，取適量cDNA為模板，PCR法檢測。引物序列如下：BCL-2上游引物為5′-GGTCGCCAGGACCTCGCCGC-3′，下游引物為5′-AGTCGTCGCCGGCCTGGCG-3′；BAX上游引物為5′-GAGCTGCAGAGGATGATTGC-3′，下游引物為5′-AGCCCAACAGCCGCTCCCGG-3′；GAPDH上游引物為5′-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′，下游引物為5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。采用Quantity One 軟件進(jìn)行分析，以GAPDH條帶為內(nèi)參，對目的條帶(BCL-2和BAX)的光密度值進(jìn)行半定量分析，進(jìn)而得到其相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞凋亡率分別為6.71%±1.26%、17.07%±1.88%、25.78%±0.44%，與溶劑對照組(5.41%±1.40%)相比P<0.05或<0.01。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別為117.7%±5.5%、151.0%±4.6%、212.0%±5.6%，與溶劑對照組(100.0%±0.0%)相比P均<0.01。

2.3 各組細(xì)胞Caspase-3活性比較 實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞Caspase-3活性分別為119.3%±5.7%、175.0%±13.1%、251.3%±17.0%，與溶劑對照組(100.0%±3.0%)相比P<0.05或<0.01。

2.4 各組細(xì)胞BCL-2、BAX mRNA表達(dá)比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞BCL-2、BAX mRNA表達(dá)比較

注：與溶劑對照組相比，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

漢防己乙素對多種惡性腫瘤具有較好的抑制作用，如肝癌、前列腺癌、白血病以及乳腺癌等，作用機(jī)制包括誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞遷移和侵襲等[1～3]。然而，漢防己乙素在肺癌中的作用研究較少。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)1、2、3組人肺癌95D細(xì)胞較溶劑對照組凋亡率高，表明漢防己乙素能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是現(xiàn)代抗癌藥物研究的一個(gè)重要分支[6,7]。多數(shù)臨床使用的抗癌藥物能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制腫瘤細(xì)胞增殖[8]。ROS能夠介導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)的信號通路信號傳遞[9,10]，還參與脂質(zhì)過氧化過程，并能介導(dǎo)連接硫醇基類的蛋白。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較溶劑對照組高，表明漢防己乙素能升高人肺癌95D細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。ROS產(chǎn)生過多能導(dǎo)致氧化應(yīng)激、細(xì)胞功能失常、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡?？梢奟OS在漢防己乙素引起的腫瘤細(xì)胞凋亡中起重要作用。但漢防己乙素通過何種途徑升高ROS尚需要進(jìn)一步研究。

Caspases是半胱氨酸蛋白酶家族蛋白，能通過控制死亡受體和線粒體通路來促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspases蛋白平常以失活的酶原形式存在，在細(xì)胞凋亡中則以活化的酶形式存在。Caspase-3是Caspases家族蛋白中主要的蛋白酶之一，能夠催化多種主要的細(xì)胞內(nèi)蛋白的特異性剪切。BCL-2和BAX分別是BCL-2家族中最有代表性的抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。在凋亡發(fā)生過程中，BAX在某些凋亡相關(guān)因素的激活下，促進(jìn)細(xì)胞線粒體內(nèi)的細(xì)胞色素C釋放到胞質(zhì)，通過級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組相比，實(shí)驗(yàn)1、2、3組細(xì)胞Caspase-3活性高，BAX mRNA表達(dá)高，BCL-2 mRNA表達(dá)低。提示漢防己乙素可通過誘導(dǎo)Caspase-3的活化和BCL-2/BAX失衡，進(jìn)而促發(fā)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，漢防己乙素可誘導(dǎo)人肺癌95D細(xì)胞凋亡，這可能是通過升高細(xì)胞內(nèi)ROS水平、活化Caspase-3、激活BAX、抑制BCL-2實(shí)現(xiàn)的。

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Effectoffangchinolineonproliferationofhumanlungcancer95Dcells

YUYoujiang,LUOXue,YEJilin,SULandi,PENGJianming

(MedicalCollegeofYangzhouPolytechnicCollege,Yangzhou225009,China)

ObjectiveTo investigate the inducible effect and possible mechanism of fangchinoline on apoptosis of human lung cancer 95D cells.MethodsThe human lung cancer 95D cells were divided into four groups: experimental groups 1, 2, 3, and the control group. The cells in the experimental groups 1, 2, and 3 were added with 8, 16, and 32 μmol/L fangchinoline, respectively. Cells in the control group were added with the same volume of 0.1% DMSO. The apoptosis was measured by flow cytometry. The levels of cellular reactive oxygen species (ROS) and Caspase-3 activity were detected by H2DCF-DA and Caspase-3 activity assay. The BCL-2 and BAX mRNA expression was determined by semi-quantitative RT-PCR.ResultsThe apoptosis rate of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 6.71%±1.26%, 17.07%±1.88%, 25.78%±0.44%, and 5.41%±1.40%, respectively; the relative ROS levels of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 117.7%±5.5%, 151.0%±4.6%, 212.0%±5.6%, and 100.0%±0.0%, respectively; the activities of Caspase-3 of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 119.3%±5.7%, 175.0%±13.1%, 251.3%±17.0%, and 100.0%±3.0%, respectively; the levels of BCL-2 mRNA of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 0.93±0.02, 0.75±0.04, 0.61±0.04, and 1.00±0.03, respectively; the levels of BAX mRNA of the experimental groups 1, 2, 3 and control group were 1.10±0.02, 1.63±0.04, 1.85±0.04, 1.00±0.02, respectively. Significant difference was found between the the experimental groups 1, 2, 3 and the control group (P<0.05 orP<0.01).ConclusionFangchinoline may induce the apoptosis of human lung cancer 95D cells by increasing the cellular ROS, activating Caspase-3 and Bax, and inhibiting Bcl-2.

lung neoplasms; fangchinoline; apoptosis; reactive oxygen species; Caspase-3; B lymphocytoma-2; BCL-2 associated X protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.002

R730.1

A

1002-266X(2017)38-0005-03

江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)教育科研資助項(xiàng)目(NJ201410)。

于有江(1963-)，男，副教授，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞凋亡、生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail： 836485572@qq.com

彭建明(1984-)，男，副教授，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞凋亡、鎮(zhèn)痛。E-mail： shmily_peng@163.com

2017-06-29)