骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠骨折愈合的研究

常瑞明 王鵬 楊濤 陳錦武 常建星

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠骨折愈合的研究

常瑞明1王鵬2楊濤2陳錦武1常建星3*

目的 檢測(cè)促炎因子TNF?α、IL?6及抗炎因子IL?4、IL?10以及Toll樣受體4在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠骨折愈合過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，探討炎癥失衡在此過(guò)程中的作用及可能機(jī)制。方法 7～8周齡SPF級(jí)雄性自發(fā)性2型糖尿病GK大鼠56只，喂養(yǎng)高脂飼料造模。造模成功后（隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L）暴露大鼠左側(cè)股骨，人為造成開(kāi)放性骨折并給與克氏針復(fù)位內(nèi)固定，將培養(yǎng)收集濃縮的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注射于骨折周?chē)∪廛浗M織，于實(shí)驗(yàn)后第1周、3周、6周、8周分別行X線(xiàn)攝片、下腔靜脈取血測(cè)定炎癥因子、骨折局部軟組織檢測(cè)TLR4表達(dá)。結(jié)果 術(shù)后第1周、3周、6周、8周對(duì)照組TNF?a、IL?6、TLR?4表達(dá)均高于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05），而IL?4、IL?10則低于實(shí)驗(yàn)組（P＜0.05）；兩組動(dòng)物在手術(shù)后第三周均可見(jiàn)骨折處骨痂生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組更加明顯，但對(duì)照組骨痂不均勻，骨密度較低。結(jié)論 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞局部移植可以降低GK糖尿病大鼠骨折后機(jī)體的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)骨折愈合。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；GK糖尿病大鼠；炎癥反應(yīng)因子；Toll樣受體4；骨折愈合

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

GK大鼠60只，雄性，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼（SCXK（滬）2012?2002；高脂飼料購(gòu)于上海普路騰生物科技有限公司；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞購(gòu)于Cyagen Biosciences Inc.兔抗鼠 TLR4抗體購(gòu)于 Cell Signaling（Boston，MA，US）；內(nèi) 參 抗 ?GAPDH 購(gòu) 于 USBiological（Swampscott，MA，US）；鼠 TNF?α、IL?6、IL?4、IL?10 ELISA Kit購(gòu)于達(dá)科為生物技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

雄性7～8周齡GK大鼠給于高脂飼料喂養(yǎng)2周，測(cè)隨機(jī)血糖≥11.1 mmol/L認(rèn)為造模成功。大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各28只。（1）實(shí)驗(yàn)組：大鼠在行手術(shù)后立即在骨折復(fù)位周?chē)∪廛浗M織處注射濃縮好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（2×106個(gè)/mL）；（2）對(duì)照組：術(shù)后在手術(shù)部位處注射同等劑量的無(wú)菌生理鹽水。然后兩組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由飲水、攝食。

大鼠截骨內(nèi)固定模型：戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉滿(mǎn)意后，俯臥位固定于手術(shù)實(shí)驗(yàn)臺(tái)，股骨外后方做約1.5 cm切口，逐層分離，暴露股骨中段，用電動(dòng)擺鋸橫型離斷股骨，復(fù)位后用克氏針內(nèi)固定，然后逐層縫合。手術(shù)過(guò)程見(jiàn)圖1。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)

鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞株在超凈臺(tái)下復(fù)蘇培養(yǎng)，定期換液、傳代，于手術(shù)當(dāng)天取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行濃縮制成細(xì)胞懸液（2×106個(gè)/mL），準(zhǔn)備注射。

1.4 標(biāo)本采集

于術(shù)后第1周、第3周、第6周、第8周麻醉后行骨折處攝片，下腔靜脈取血后即刻離心，取骨折處肌肉軟組織即刻-80℃低溫冰箱保存待測(cè)。

圖1 模型制作過(guò)程圖解

1.5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）

參照廠(chǎng)家說(shuō)明書(shū)測(cè)定血液當(dāng)中TNF?α、IL?6、IL?4、IL?10含量。

1.6 Western blot測(cè)定TLR?4表達(dá)

過(guò)程簡(jiǎn)述：取股骨骨折周?chē)悄ぜ凹∪廛浗M織，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行總蛋白測(cè)定（Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford，USA）。取上述蛋白樣品各20μg，進(jìn)行SDS?PAGE電泳和Western blotting分析。蛋白樣本加緩沖液混合，100℃變性處理5 min，蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，用60 V進(jìn)行濃縮膠電泳，時(shí)間20 min，120V在分離膠中電泳，60 min，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即終止電泳。電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，封閉2小時(shí)，4℃孵育特異性一抗，過(guò)夜，一抗反應(yīng)結(jié)束后與HRP標(biāo)記的特異性二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜，15 min×3次；用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。Adobe Photoshop 7.0分析條帶光密度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，符合正態(tài)分布的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組內(nèi)比較用方差分析，組間用t檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)為P小于0.05。

2 結(jié) 果

2.1 血清炎癥因子的測(cè)定

GK糖尿病大鼠經(jīng)開(kāi)放骨折內(nèi)固定后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血液中炎癥因子的含量。實(shí)驗(yàn)組促炎因子TNF?α、IL?6在第1周、第3周、第6周、第8周均低于對(duì)照組（P＜0.05），而抗炎因子IL?4、IL?10在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組（P＜0.05）；有趣的是結(jié)果發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎因子的變化在第一周到第三周的變化幅度較大，第三周至第八周變化幅度趨于平穩(wěn)，這說(shuō)明炎癥反應(yīng)在術(shù)后三周內(nèi)較為劇烈，之后逐漸平穩(wěn)下來(lái)。見(jiàn)表1、表2。

表1 GK大鼠骨折內(nèi)固定術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)TNF?α、IL?6 （ng/mL,x±s，n=7）

表2 GK大鼠骨折內(nèi)固定術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)IL?4、IL?10（ng/mL,x±s，n=7）

2.2 骨折處軟組織TLR?4的表達(dá)

大鼠于手術(shù)后第1周、第3周、第6周、第8周分別取骨折周?chē)∪?、骨膜等軟組織測(cè)定其TLR?4的表達(dá)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組TLR?4表達(dá)在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組（P＜0.05）（圖2）。

2.3 術(shù)后大鼠不同時(shí)間點(diǎn)骨折愈合的X線(xiàn)表現(xiàn)

術(shù)后第一周實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未見(jiàn)明顯的骨痂生長(zhǎng)，術(shù)后第三周骨折處開(kāi)始有較明顯的骨痂生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第六、第八周骨折處逐漸愈合，骨皮質(zhì)連續(xù)，骨密度均勻；對(duì)照組雖然也有逐漸愈合的趨勢(shì)，但骨質(zhì)密度明顯不均勻，骨痂生長(zhǎng)狀況不如實(shí)驗(yàn)組（圖3）。

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)骨折處軟組織TLR-4的表達(dá)

3 討 論

炎癥反應(yīng)在糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越被研究者認(rèn)識(shí)［2］。但糖尿病足的神經(jīng)病變、血管病變、難以控制的感染仍然是臨床棘手問(wèn)題，而糖尿病足引起的骨質(zhì)破壞（特別是夏克氏足）是致殘的重要因素［3］。骨科研究者試圖通過(guò)矯正融合植骨等手段重建足部的正常骨骼形態(tài)，為足部潰瘍愈合、回復(fù)足部的行走承重功能提供條件，但術(shù)后骨質(zhì)延遲愈合甚至不愈合成為難以逾越的難關(guān)［4］。

圖3 骨折愈合的X線(xiàn)表現(xiàn)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源廣泛，在一定條件下可以定向分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等，具有促進(jìn)骨折愈合的能力［5］，但局部注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠骨折愈合的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究骨折周?chē)植孔⑸錆饪s后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)糖尿病大鼠骨折內(nèi)固定術(shù)后骨折愈合過(guò)程中炎癥因子、TLR?4的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)合骨折處X線(xiàn)顯示骨痂生長(zhǎng)情況，探討炎癥反應(yīng)在其中的作用。

TNF?α、IL?6是具有代表性的促炎因子，IL?4、IL?10是經(jīng)典的抗炎因子代表，正常情況下機(jī)體處于促炎抗炎動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)［6］。TLR?4是一類(lèi)跨膜蛋白模式識(shí)別受體，在機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，TLR?4是其中非常重要的一類(lèi)。它識(shí)別病原體后向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，激活多種核轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生，打破抗炎?促炎平衡［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組在術(shù)后第1、第3、第6、第8周促炎因子TNF?α、IL?6均低于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，而抗炎因子IL?4、IL?10均高于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，骨折處肌肉軟組織中TLR?4的表達(dá)均低于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的對(duì)照組，這些結(jié)果說(shuō)明炎癥反應(yīng)對(duì)糖尿病大鼠骨折內(nèi)固定術(shù)后骨折的愈合過(guò)程有影響。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在大鼠骨折內(nèi)固定術(shù)后第1周到第3周時(shí)間段炎癥反應(yīng)的變化幅度較大，第3周后逐漸趨于平穩(wěn)狀態(tài)，說(shuō)明骨折內(nèi)固定術(shù)后早期（3周內(nèi)）炎癥反應(yīng)較劇烈。

術(shù)后第1周、第3周、第6周、第8周兩組X線(xiàn)結(jié)果顯示隨著時(shí)間的推移，骨折處逐漸均有骨痂形成，骨皮質(zhì)逐漸形成連續(xù)，但實(shí)驗(yàn)組大鼠骨折內(nèi)固定后骨折處骨痂生長(zhǎng)情況在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)明顯優(yōu)于對(duì)照組，而且骨質(zhì)密度均勻，愈合處骨形態(tài)規(guī)整。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞局部注射可促進(jìn)糖尿病大鼠骨折的愈合，可能與注射干細(xì)胞后抑制機(jī)體的促炎因子形成、促進(jìn)抗炎因子的釋放有關(guān)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源豐富，易于培養(yǎng)，局部注射方法簡(jiǎn)便，期望在臨床上能有更廣闊的應(yīng)用前景。

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Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on fracture healing in diabetic rats

CHANG Ruiming1，WANGPeng2，YANGTao2，CHENJinwu1，CHANGJianxing3.
1Boji Medical Center，2Department of Emergency，3Department of Genaral Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120.Corresponding author：CHANGJianxing，chang_jianxing@aliyun.com

Objective To study the role of inflammation imbalance on mesenchymal stem cells promoting fracture healing in a model of GK diabetic rats by detecting the dynamic changes of the level of inflammation factors TNF?α，IL?6，IL?4，IL?10 and the expression of Toll?like receptor?4（TLR?4）.Methods The diabetic model on GK rats was induced by feeding high?fat diet（random blood sugar≥11.1 mmol/L）.The fracture was fixed with kirschner wire after the left thigh?bone of rats were exploded and sawed off，and then the concentrated stem cells were injected into the local area of the fracture.We collected the blood and tissue specimen to detect the concentrations of TNF?α，IL?6，IL?4，IL?10 and the expression of TLR?4 in one week，three week，six week and eight week after fracture fixation.The fracture healing was evaluated by X?ray.Results Thelevelsof TNF?α，IL?6 and the expression of TLR?4 were higher in the control group than those in the experimental group（all P values ＜ 0.05），however，the levels of IL?4 and IL?10 were lower in the control group（all P values ＜ 0.05）.The osteotylus forma?tion was more obvious and the bone mineral density was more homogeneous in the experimental group.Conclusion In the present study，our findings demonstrated that the local transplantation of bone mar?row mesenchymal stem cells reduced the inflammatory response and promote fracture healing fracture in diabetic GK rats.

mesenchymal stem cells；GK diabetic rats；inflammatory factors；TLR?4；fracture

中圖分類(lèi)號(hào)：R683 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

10.3969/j.issn.1009?976X.2017.05.014

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B060300008）

510120 廣州 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1博濟(jì)醫(yī)療中心；2急診科；3普外科*通訊作者：常建星，Email：chang_jianxing@aliyun.com

隨著人們生活水平的提高，生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年升高、年輕化的態(tài)勢(shì)。糖尿病血管病變、神經(jīng)病變等并發(fā)癥給患者帶來(lái)嚴(yán)重后果，其中，糖尿病足導(dǎo)致的高致殘率更是給患者帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。糖尿病足出現(xiàn)足部骨質(zhì)的破壞，導(dǎo)致足踝部畸形，潰瘍難以愈合。諸多學(xué)者試圖通過(guò)矯形手術(shù)矯正畸形，為足部潰瘍愈合提供條件，但是術(shù)后骨折愈合困難甚至不愈合成為一個(gè)棘手的問(wèn)題。近年來(lái)有報(bào)道應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)骨折愈合［1］，但局部注射的研究報(bào)道未見(jiàn)。炎癥反應(yīng)在糖尿病發(fā)生發(fā)展中的重要作用越來(lái)越受到人們的普遍重視，本研究探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)糖尿病大鼠骨折愈合過(guò)程中炎癥間質(zhì)及Toll樣受體4（TLR?4）的動(dòng)態(tài)變化，為糖尿病骨折術(shù)后的愈合提供理論依據(jù)。

2017-08-26）