TritonX-100對液體深層發(fā)酵樺褐孔菌產(chǎn)活性多糖的影響

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(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

TritonX-100對液體深層發(fā)酵樺褐孔菌產(chǎn)活性多糖的影響

陳翠，全麗麗，徐向群

(浙江理工大學(xué)理學(xué)院，杭州 310018)

探討表面活性劑TritonX-100對樺褐孔菌液體深層發(fā)酵產(chǎn)活性多糖的影響，利用醇沉法得到胞外多糖和胞內(nèi)多糖，通過測定菌絲體量和胞內(nèi)外多糖產(chǎn)量，明確TritonX-100對多糖的促進(jìn)作用。進(jìn)一步探討TritonX-100的最佳添加時(shí)間及濃度，得出在第0 d添加0.1% TritonX-100，促進(jìn)效果最顯著。多糖的DPPH自由基清除率測定結(jié)果表明，TritonX-100也促進(jìn)樺褐孔菌多糖的抗氧化活性。通過對多糖化學(xué)成分以及單糖組成的分析，證明多糖中的糖、蛋白含量及單糖的組成與DPPH自由基清除率具有一定關(guān)聯(lián)性。以上結(jié)果為進(jìn)一步深入研究樺褐孔菌多糖奠定理論基礎(chǔ)，從而建立一種樺褐孔菌發(fā)酵多糖的高產(chǎn)、高活性的液體深層發(fā)酵制備技術(shù)。

樺褐孔菌；多糖；TritonX-100；抗氧化活性

0 引 言

樺褐孔菌(Inonotusobliquus)作為一種珍貴食藥兼用真菌，具有很高藥用價(jià)值，在俄羅斯、波蘭和芬蘭等地應(yīng)用廣泛，民間常用樺褐孔菌的菌核來防治癌癥[1]。樺褐孔菌多糖是樺褐孔菌中主要化學(xué)成分，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，對糖尿病有很好的治療作用，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一[2-3]。樺褐孔菌的生長環(huán)境苛刻，野生資源稀少，人工培育技術(shù)還不成熟。通過液體深層發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)，既可縮短樺褐孔菌生長周期，也能提高多糖產(chǎn)量[4]。

為了提高多糖的產(chǎn)量，可對樺褐孔菌的液體深層發(fā)酵的條件進(jìn)行優(yōu)化，或不斷對培養(yǎng)基中的氮源、碳源進(jìn)行改進(jìn)[5-6]。表面活性劑Tween80能夠改變菌絲體細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)對發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而提高多糖的產(chǎn)量[7]。本文首次研究表面活性劑TritonX-100對樺褐孔菌液體深層發(fā)酵胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)，胞內(nèi)多糖(intrecellular polysaccharide,IPS)IPS1和IPS2積累和活性的影響。通過測定胞內(nèi)外多糖的產(chǎn)量和菌絲體生物量，并對TritonX-100的添加濃度及時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以期達(dá)到最佳促進(jìn)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原始菌種

用于液體深層發(fā)酵的樺褐孔菌的原始菌種購自于徐州師范大學(xué)。

1.1.2 主要試劑

TritonX-100，天津永大化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶，北京奧伯丁生物技術(shù)有限公司；蛋白胨，杭州百思生物技術(shù)有限公司；糖化酶，北京奧伯丁生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胞外多糖(EPS)的提取

首先采用布氏漏斗抽濾液體深層發(fā)酵液得到濾液，真空濃縮濾液至20 mL，再加入4倍體積95%的乙醇補(bǔ)齊至100 mL，攪拌均勻，在4 ℃條件下沉淀過夜。傾倒出上層液體保留沉淀，加入95%乙醇，然后離心(6500 r/min，10 min)，最后冷凍干燥4～5 h，即得EPS。

1.2.2 胞內(nèi)多糖(IPS)的提取

稱取1 g干燥菌絲體并研成粉末后，在離心管中按體積比1∶5加入粉末和去離子水，超聲破壁5 min(超聲時(shí)間5 s，間歇時(shí)間3 s)，95 ℃水浴加熱2 h，冷卻后離心(6500 r/min，10 min)，收集上清液，向離心管中加入去離子水，重復(fù)上述操作，合并兩次上清液，定容至50 mL。收集兩次操作剩余的沉淀，加少量去離子水，在水浴鍋中控制溫度為121 ℃加熱時(shí)間1.5 h，冷卻后離心(6500 r/min，10 min)，保留上清液定容至50.0 mL。分別取0.1 mL上述兩種溶液加入去離子水補(bǔ)齊至1.0 mL，采用真空濃縮濾液至20.0 mL后，再加入4倍體積95%乙醇至100 mL，玻璃棒充分?jǐn)嚢?，在溫? ℃下沉淀時(shí)間24 h，然后離心(6500 r/min，10 min)、冷凍干燥得胞內(nèi)多糖。上述操作分別得到兩種胞內(nèi)多糖，95 ℃條件下的IPS1，121 ℃條件下的IPS2。

1.2.3 菌絲體生物量的測定

從搖床中隨機(jī)取出搖瓶，進(jìn)行抽濾操作，用去離子水反復(fù)沖洗菌絲體，直至最后沖洗液呈無色；然后將漏斗中的菌絲體放到表面皿中，置于烘箱中恒溫(60 ℃)干燥至恒重；最后，采用電子天平稱重干燥后的菌絲體。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定

本文采用Xu等[8]的方法來測定多糖樣品的DPPH自由基清除活性，操作步驟為：配制不同濃度的多糖樣品溶液，在試管中加入0.8 mL的DPPH溶液(0.4 mmol/L)，加入2.4 mL多糖溶液，充分振蕩搖勻，在暗室中靜置30 min；在517 nm下有最大吸收，測定吸光度值OD1。用0.8 mL甲醇溶液代替DPPH溶液，重復(fù)上述操作，測定吸光度值OD2。對照組采用0.8 mL的甲醇溶液與2.4 mL的DPPH溶液反應(yīng)，測定吸光度值OD0。計(jì)算方程式為：

1.2.5 化學(xué)組成的分析

多糖樣品的蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行，根據(jù)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，在562 nm下測定。多糖樣品含量的測定通常采用苯酚-硫酸法[9]，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，在490 nm下測定；采用氣相色譜GC分析多糖樣品中單糖的組成[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 TritonX-100對多糖產(chǎn)量及菌絲體生物量的影響

在樺褐孔菌菌種發(fā)酵培養(yǎng)初期的搖瓶中加入0.1%(V/V)TritonX-100，經(jīng)過9 d時(shí)間的發(fā)酵培養(yǎng)，測定最終菌絲體的生物量及胞內(nèi)外多糖的產(chǎn)量來判斷樺褐孔菌的生長情況。TritonX-100對樺褐孔菌菌絲體生物量、胞內(nèi)外多糖量的影響見圖1。TritonX-100對菌絲體生長起到抑制作用，對胞外多糖的產(chǎn)生起到促進(jìn)作用，促進(jìn)率為42.86%(p<0.05)；TritonX-100同時(shí)促進(jìn)IPS1和IPS2的產(chǎn)生，促進(jìn)率分別為6.08%和12.29%(p<0.05)，其可能機(jī)理為：TritonX-100作為表面活性劑，通過抑制細(xì)胞膜磷脂雙分子層的合成，增大細(xì)胞膜通透性，從而分泌出更多的多糖，同時(shí)還具有加強(qiáng)供氧運(yùn)輸能力來增加次級代謝產(chǎn)物的積累[11]；在樺褐孔菌液體深層發(fā)酵過程中，搖瓶中的發(fā)酵環(huán)境逐漸發(fā)生變化，氧氣的減少，厭氧細(xì)菌的產(chǎn)生等都不利于樺褐孔菌生長，從而抑制菌絲體的生物量[12]。

圖1 TritonX-100對樺褐孔菌菌絲體生物量及胞內(nèi)外多糖量的影響注：不同字母表明數(shù)據(jù)之間有顯著性差異，相同字母代表差別不顯著(p<0.05)。

2.2 最佳添加時(shí)間和濃度的確定

TritonX-100不同添加時(shí)間對菌絲體生物量和胞內(nèi)外多糖的影響見表1，觀察表1得出，樺褐孔菌的生長情況隨著TritonX-100的不同添加時(shí)間而改變，在后期添加的TritonX-100，菌絲體的生物量大于前期，生長情況較好。當(dāng)添加時(shí)間定為第1 d的時(shí)候，EPS產(chǎn)量達(dá)到最高，與對照相比提高53.85%。IPS1添加時(shí)間為第0 d時(shí)，促進(jìn)率為9.45%，促進(jìn)作用最明顯。IPS2在第0 d的促進(jìn)率為11.17%，促進(jìn)作用也最明顯(p<0.05)。

表1 TritonX-100不同添加時(shí)間對菌絲體生物量和胞內(nèi)外多糖的影響

注：同一列中相同字母代表差別不顯著，不同字母表明數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(p<0.05)

不同濃度TritonX-100對菌絲體生物量和胞內(nèi)外多糖的影響測定結(jié)果如表2所示，菌絲體生物量隨著TritonX-100濃度增加而減少，TritonX-100的濃度為0.1%(V/V)，對EPS和IPS1的產(chǎn)量促進(jìn)作用最明顯，促進(jìn)率分別為50.00%和9.45%(p<0.05)。添加濃度為0.05%，IPS2有最高產(chǎn)量，達(dá)到33.83 mg/g，增長率為27.34%(p<0.05)。因此在第0d添加0.1%的TritonX-100，對胞內(nèi)外多糖的促進(jìn)效果最好。

表2 TritonX-100不同添加濃度對菌絲體生物量和胞內(nèi)外多糖的影響

注：同一列中相同字母代表差別不顯著，不同字母表明數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(p<0.05)

2.3 多糖的抗氧化活性分析

圖2是來源于對照培養(yǎng)基、TritonX-100培養(yǎng)基的胞內(nèi)外多糖對DPPH自由基的清除率，多糖濃度梯度為0.5～5.0 mg/mL。從圖2中發(fā)現(xiàn)，TritonX-100-EPS的DPPH清除率高于對照。當(dāng)多糖濃度為2 mg/mL時(shí)，TritonX-100-EPS的清除率接近對照；當(dāng)濃度為5 mg/mL，TritonX-100-EPS清除率達(dá)到最高，與對照-EPS相接近。低濃度時(shí)，對照培養(yǎng)基來源的IPS1的DPPH清除率高于TritonX-100-IPS1。相反，TritonX-100-IPS2的清除率整體顯著高于對照，濃度高于4 mg/mL，與對照的差異減?。粷舛葹? mg/mL，TritonX-100-EPS清除率達(dá)到最高，與對照-EPS相接近。

圖2 不同來源樺褐孔菌胞外多糖(EPS)、胞內(nèi)多糖(IPS1、IPS2)的DPPH清除率注：來源于對照培養(yǎng)基、TritonX-100培養(yǎng)基的樺褐孔菌胞內(nèi)外多糖分別表示為CT-IPS1、CT-IPS2、CT-EPS、TritonX-100-IPS1、TritonX-100-IPS2、TritonX-100-EPS。

表3是來源于對照、TritonX-100培養(yǎng)基的胞內(nèi)外多糖的對DPPH自由基清除率的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果顯示：IPS比EPS具有較小的IC50，說明胞內(nèi)多糖的抗氧化活性要高于胞外多糖；添加有TritonX-100培養(yǎng)基的多糖的IC50比對照組低，TritonX-100有增強(qiáng)多糖DPPH清除率的作用。因此，TritonX-100添加可能使多糖的結(jié)構(gòu)或化學(xué)成分發(fā)生改變。

表3 不同來源的樺褐孔菌多糖的半抑制濃度

注：同一列中相同字母代表差別不顯著，不同字母表明數(shù)據(jù)之間有顯著性差異(p<0.05)

2.4 多糖的化學(xué)成分及單糖組成分析

自然界中的多糖大多結(jié)合游離蛋白，不易除去，本文采用BCA試劑盒法測定醇沉法得到的多糖中的蛋白含量。大部分真菌多糖的結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，為了進(jìn)一步探討的多糖的初級結(jié)構(gòu)，采用氣相色譜法測定單糖的組成。表4為不同來源樺褐孔菌EPS、IPS1、IPS2、蛋白含量及單糖組成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從表4中得出，TritonX-100-EPS中糖含量顯著高于對照-EPS，蛋白含量相近。TritonX-100-IPS1蛋白含量低于對照-IPS1，糖含量則較低。TritonX-100-IPS2的糖含量高于對照-IPS2，比例均很高。對照組的胞內(nèi)外多糖的糖含量均低于TritonX-100培養(yǎng)基來源的多糖，蛋白含量則略低。另外，胞內(nèi)多糖與胞外多糖相比較，蛋白含量更低，糖含量更高。單糖組成分析中，其中葡萄糖、甘露糖和半乳糖共占60%以上。TritonX-100-IPS1擁有最高含量的半乳糖，為40.8%，TritonX-100-IPS2有最高含量的甘露糖，達(dá)到34.2%。部分真菌多糖提取出來之后以糖蛋白的形式存在，多糖中蛋白質(zhì)的含量與抗氧化活性具有一定關(guān)系，蛋白質(zhì)含量越高，多糖的DPPH清除活性也高[13]。Quan等[4]發(fā)現(xiàn)在多糖組成中，較高的糖含量對多糖的生物活性是有提高作用的，有更低的IC50值。多糖的DPPH清除率及IC50結(jié)果保持一致，因此多糖的化學(xué)成分與抗氧化活性具有一定關(guān)聯(lián)。

表4 不同來源樺褐孔菌多糖的化學(xué)成分和單糖組成

注：-表示未發(fā)現(xiàn)。同一欄中相同字母表明數(shù)據(jù)之間差別不顯著(p<0.05)。來源于對照培養(yǎng)基、TritonX-100培養(yǎng)基的樺褐孔菌胞內(nèi)外多糖表示為CT-IPS1、CT-IPS2、CT-EPS、TritonX-100-IPS1、TritonX-100-IPS2、TritonX-100-EPS。

3 結(jié) 論

表面活性劑TritonX-100作為一種新的多糖生物合成的調(diào)控方法，不僅提高了多糖的產(chǎn)量、抗氧化活性，同時(shí)，TritonX-100的添加對多糖的結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生一定影響。因此，添加TritonX-100是一種獲得高產(chǎn)量和高抗氧化活性多糖的有效途徑，真菌多糖作為一種珍貴稀有的物質(zhì)，為其大規(guī)模生產(chǎn)多糖提供可能性。本文僅對多糖的初級結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，還需要將多糖進(jìn)行分離純化，采用NMR、FTIR分析確定多糖的高級結(jié)構(gòu)以及多糖中單糖的連接方式和糖苷鍵的構(gòu)型。

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EffectofTritonX-100ontheProductionofActivePolysaccharidesofInonotusObliquusunderSubmergedLiquidFermentation

CHENCui,QUANLili,XUXiangqun

(School of Sciences, Zhejiang Sci-Tech University, Hangzhou 310018, China)

This study aims to discuss the effect of surfactant TritonX-100 on the production of active polysaccharides produced fromInonotusobliquusunder submerged liquid fermentation. Extracellular polysaccharide(EPS) and intracellular polysaccharide (IPS1, IPS2) were obtained with the alcohol precipitation method, and the promoting effect of TritonX-100 on polysaccharide was determined by measuring the mycelium quantity and yield of extracellular and intracellular polysaccharides. The best time and concentration for adding TritonX-100 were further studied. It is found that the promoting effect is most significant by adding 0.1% TritonX-100 on Day 0. The measurement result of DPPH free radical clearance ratio of polysaccharide indicates that TritonX-100 also can promote the antioxidant activity ofI.obliquuspolysaccharide. The analysis of polysaccharide chemical components and monosaccharide composition indicates that the saccharide, protein content and monosaccharide composition of polysaccharide have certain relevance to DPPH free radical clearance ratio. The conclusions presented above lay a theoretical foundation for further study oninonotusobliquuspolysaccharide, based on which a submerged liquid fermentation technology ofinonotusobliquuspolysaccharide of high yield and high activity can be developed.

Inonotusobliquus; polysaccharide; TritonX-100; antioxidant activity

10.3969/j.issn.1673-3851.2017.11.021

2016-04-18 網(wǎng)絡(luò)出版日期： 2017-08-07

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY16B020013)

陳 翠(1993-)，女，安徽六安人，碩士研究生，主要從事生物技術(shù)和生物分析化學(xué)方面的研究。

徐向群，E-mail：xuxiangqun@zstu.edu.cn

Q538

A

1673- 3851 (2017) 06- 0888- 05

(責(zé)任編輯：唐志榮)