基于定向進(jìn)化技術(shù)提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性

邵澤香，焦琳舒，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

基于定向進(jìn)化技術(shù)提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性

邵澤香，焦琳舒，陸兆新，別小妹，趙海珍，張 充，呂鳳霞*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

為提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性，通過定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分子改造。經(jīng)過兩輪易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和一輪DNA shuffling，從19 100多個(gè)突變株中篩選到突變體S10、S16和S21，其酶比活力較野生型分別提高了106%、74%和43%，且突變酶Kcat/Km都有所增大。其中，突變體S10氨基酸序列發(fā)生3 個(gè)突變，K 43E、N67S和I269L。三維模擬結(jié)果顯示，第43位氨基酸突變?yōu)楣劝彼帷⒌?7位氨基酸突變?yōu)榻z氨酸，可能提高了底物親和力和催化效率，從而提高酶活性。圓二色譜分析表明，相比野生酶，突變酶的α-螺旋數(shù)減少、無(wú)規(guī)則卷曲有所增加，表明其剛性略有降低，柔性有所增加。利用定向進(jìn)化策略能夠有效地提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性。

L-天冬酰胺酶；定向進(jìn)化；酶活性

L-天冬酰胺酶Ⅱ（L-asparaginaseⅡ，EC3.5.1.1）可以催化L-天冬酰胺脫氨基轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸和氨。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，L-天冬酰胺酶可以減少熱加工食品中致癌物——丙烯酰胺的形成[1-5]，而丙烯酰胺是由天冬酰胺和還原糖（果糖和葡萄糖）經(jīng)美拉德反應(yīng)生成[6]。采用L-天冬酰胺酶去除原料中的天冬酰胺是目前用于控制高熱加工食品中丙烯酰胺含量最有效的方法。同時(shí)，對(duì)生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品外觀、風(fēng)味以及營(yíng)養(yǎng)等方面沒有任何改變[7-8]。但目前L-天冬酰胺酶普遍存在穩(wěn)定性差、酶活性低等問題，難以滿足食品預(yù)處理的復(fù)雜環(huán)境要求。

蛋白質(zhì)工程是用于克服天然酶在工業(yè)應(yīng)用過程中缺陷的重要手段[9]，通常蛋白質(zhì)工程策略主要包括理性設(shè)計(jì)和非理性設(shè)計(jì)（定向進(jìn)化）等[10]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于L-天冬酰胺酶分子改造方面的研究主要集中于理性設(shè)計(jì)，如Sudhir等[11]對(duì)地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶進(jìn)行定點(diǎn)突變使得氨基酸D103V發(fā)生變化；Long Shuiqing等[12]通過定點(diǎn)突變改變了枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶氨基酸G107D，定點(diǎn)突變后的突變酶，催化活力和熱穩(wěn)定性均得到提高。而有關(guān)L-天冬酰胺酶的定向進(jìn)化研究報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性很低，限制其在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。為提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性，本研究采用易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)與DNA shuffling相結(jié)合的方法，對(duì)地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶進(jìn)行分子改造，以期獲得酶活性顯著提高的突變體，為工業(yè)化生產(chǎn)L-天冬酰胺酶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pET30a（+）-BliansZ重組質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。

限制性內(nèi)切酶SacⅠ與XhoⅠ 大連寶生物公司；2×Taq PCR M ixture、卡納青霉素、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY 98-Ⅲ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝科學(xué)儀器研究所；5840R冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；UV-2450紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；PTC-100TMPCR儀 美國(guó)MJ Research公司；PowPacTM高電流電泳儀 美國(guó)Bio-Rad有限公司；JS-380C全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)構(gòu)建

以p ET 30a（+）-B liansZ重組質(zhì)粒為模板，使用含有SacⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線）的上游引物（5’-CGAGCTCATGACGAAAAAACGAATG-3’）和含有XhoⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線）的下游引物（5’-CCGCTCG AGTCAATATTCTTCAAAATAGG-3’）進(jìn)行易錯(cuò)隨機(jī)誘變。易錯(cuò)PCR誘變體系為：0.2 mmol/L dCTP、dTTP，3/5/7mmol/L Mg2+，0.05mmol/L Mn2+，上下游引物各2.0μL，DNA模板1.0μL，2×Taq PCR M ix 25.0μL，ddH2O補(bǔ)足50.0μL。將第1輪PCR的有益突變質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行第2輪易錯(cuò)PCR。易錯(cuò)PCR程序：94℃預(yù)變性3 m in，94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 m in，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 m in。1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，并使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化的PCR產(chǎn)物用SacⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切后回收目的片段與pET-30a表達(dá)載體進(jìn)行重組。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3），構(gòu)建隨機(jī)誘變文庫(kù)。

1.3.2 DNA shuffl ing突變文庫(kù)構(gòu)建

以易錯(cuò)PCR突變文庫(kù)篩選獲得酶活性最高的4個(gè)突變體基因?yàn)槟０澹褂肞fu聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。將等濃度的親本DNA片段混合并用DNaseⅠ消化。消化條件為：DNaseⅠ酶0.000 4 U/μL、37 ℃消化10m in。消化完成后90 ℃加熱15 m in終止消化反應(yīng)。使用2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，參考易錯(cuò)PCR純化方法回收大小為50～100 bp的片段。將50～100 bp片段進(jìn)行無(wú)引物PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系組成為25μL 50～100 bp膠回收片段，25μL 2×Taq PCR M ixture緩沖液。無(wú)引物PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 m in，94℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 m in。再以無(wú)引物PCR純化產(chǎn)物作為模板，使用1.3.1節(jié)引物擴(kuò)增全長(zhǎng)基因，建立突變文庫(kù)。

1.3.3 突變體文庫(kù)的高通量篩選

參考Guo Fangfang等[13]建立的重組大腸桿菌產(chǎn)脂肪氧合酶高通量篩選方法，稍作修改。高通量篩選方法：從LB-卡納青霉素平板上挑取單菌落，接種到96孔板，每孔含有600 μL LB（50 μg/m L卡納青霉素）培養(yǎng)基，以BlansZ作為陽(yáng)性對(duì)照；37 ℃、200 r/m in培養(yǎng)12 h后，將20 μL菌液接種到另一含有600 μL LB（50 μg/m L卡納青霉素）培養(yǎng)基中；37 ℃、200 r/m in培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6，加入IPTG使終質(zhì)量濃度為60 μg/m L；16 ℃、200 r/m in培養(yǎng)16 h。離心收集菌體，50 μL質(zhì)量濃度為1.5 m g/m L的溶菌酶緩沖液重懸，37 ℃水浴30 m in，-70 ℃冷凍30 m in，37 ℃溶解20 m in，反復(fù)凍融3 次破碎細(xì)胞，離心后上清液即為粗酶液。通過96 孔板高通量篩選獲得酶活性提高的突變體進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，以確定酶活性提高的突變體。

1.3.4 酶的表達(dá)和純化

將重組菌單菌落接種在LB培養(yǎng)基（50 μg/m L卡納青霉素）中培養(yǎng)10 h，按照1%的接種量轉(zhuǎn)接。培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.6時(shí)，加入IPTG使終質(zhì)量濃度至100 μg/m L，16 ℃誘導(dǎo)16 h。離心收集菌體，50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）重懸，超聲破碎。破碎液離心后上清液即粗酶液。重組L-天冬酰胺酶含有組氨酸標(biāo)簽，使用鎳柱親和層析對(duì)野生型和突變體酶進(jìn)行純化。純化后的蛋白用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[14]，純酶使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析和進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究。

1.3.5 酶活性的測(cè)定

參照Pradhan等[15]的方法。向700 μL磷酸鹽緩沖液中加入100 μL 189 mmol/L L-天冬酰胺底物溶液和100 μL粗酶液，37 ℃水浴反應(yīng)25 m in，加入100μL 1.5 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)。12 000 r/m in離心2m in，取30 μL上清液加入到2.67 m L蒸餾水和300 μL納氏試劑中，混勻，室溫靜置10 m in，測(cè)定436 nm波長(zhǎng)處的吸光度。空白對(duì)照為先加入三氯乙酸終止反應(yīng)，再進(jìn)行后續(xù)的水浴處理。酶活力單位定義：在酶反應(yīng)條件下，單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生1 μmol/L NH3所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位。

1.3.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

最適反應(yīng)溫度測(cè)定：將酶液置于25～50 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活性。溫度穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液置于50 ℃熱處理8 h，間隔2 h取樣，以處理0 h酶活性作為100%，測(cè)定殘余酶活性。每次反應(yīng)均在同等條件下設(shè)置3 個(gè)平行，去掉空白后以平均值為此條件下的酶活性。

1.3.6.2 酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

最適反應(yīng)pH值測(cè)定：將酶液置于pH 4～10范圍內(nèi)，測(cè)定酶活性。pH值穩(wěn)定性測(cè)定：將酶液置于pH 4～11范圍內(nèi)處理酶液12 h，以處理0 h酶活性作為100%，測(cè)定殘余酶活性。

1.3.6.3 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

以0.5～5 mmol/L L-天冬酰胺為底物，加入過量的純酶液，置于最適條件下反應(yīng)，測(cè)定L-天冬酰胺酶活性，通過Lineweaver-Burk作圖法計(jì)算獲得Km和Kcat值。

1.3.6.4 三維結(jié)構(gòu)模擬及分析

將野生型氨基酸序列提交到SW ISS-MODEL服務(wù)器得到其三維結(jié)構(gòu)。利用PYMOL軟件分析氨基酸殘基間氫鍵相互作用和突變位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.6.5 突變酶圓二色譜分析

將純化的野生型酶和突變酶溶解在10 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH 8.0）中，在190～250 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為100 μg/m L，以緩沖液10 mmol/L PBS（pH 8.0）用作空白，分析野生型酶及突變酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變文庫(kù)高通量篩選

經(jīng)兩輪易錯(cuò)PCR，構(gòu)建突變文庫(kù)庫(kù)容量約12 600，獲得6株酶活性提高的突變體，結(jié)果見表1。由表1可知，最佳突變體F5A11，酶活性是野生型酶活性的2.26倍，其氨基酸序列有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變，分別為K42E、N67S、M 92V、V137I。

表1 野生型酶和易錯(cuò)PCR突變酶活性和氨基酸突變Table 1 L-asparaginase activity of the w ild-type strain and mutants generated from epPCR

以酶活性提高最多的突變體F5A 11、B7B3、F5G3和A 1D11重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行DNA shuffling，構(gòu)建含有6 500 個(gè)突變體的突變文庫(kù)，獲得3 株酶活性顯著提高的突變體，結(jié)果見表2。最佳突變酶S10，比活力為（306.59±3.21）IU/mg，比野生型酶提高106%。此突變體只發(fā)生3 個(gè)氨基酸突變，K43E、N67S和I269L。

表2 野生型酶和DNA shuffl ing突變酶活性及氨基酸突變Table 2 L-asparaginase activity and the w ild-type strain and mutants generated from DNA shuffl ing

2.2 純化酶的SDS-PAGE分析

將野生型酶和突變酶表達(dá)純化后，通過SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖1。蛋白目的條帶均在46 kD左右，與理論值相符。

圖1 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE electrophoresis of w ild-type and mutant enzymes

2.3 酶學(xué)性質(zhì)分析

2.3.1 酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

將野生酶與突變酶純酶液分別置于25～50 ℃條件下，測(cè)定酶活性，結(jié)果如圖2所示。S10和S16的最適反應(yīng)溫度與野生酶相同，S21最適反應(yīng)溫度為45 ℃，高于野生型最適溫度5 ℃。

圖2 野生型酶和突變酶最適反應(yīng)溫度Fig. 2 Effects of temperature on the activity of wild-type and mutant enzymes

將野生酶與突變酶純酶液置于50 ℃進(jìn)行溫度穩(wěn)定性研究，結(jié)果見表3。突變酶S16和S21在50 ℃半衰期分別為9.35 h和19.12 h，分別較野生型縮短11.97 h和2.2 h，表明突變酶S16和S21的溫度穩(wěn)定性有所降低。突變酶S10半衰期為23.27 h，較野生型延長(zhǎng)1.95 h，表明其溫度穩(wěn)定性在突變前后無(wú)較大變化。

表3 野生型酶和突變酶熱穩(wěn)定性Tab le 3 Thermal stability of w ild-type and mutant enzymes

2.3.2 酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

將野生酶與突變酶液分別置于pH 4.0～10.0的緩沖液中，測(cè)定L-天冬酰胺酶活性，結(jié)果如圖3所示。突變酶S10和S21與野生型酶最適反應(yīng)pH值相同，而突變酶S16在pH 9.0時(shí)表現(xiàn)出最高酶活性。

圖3 野生型酶和突變酶最適反應(yīng)pH值Fig. 3 Effect of pH on the activity of w ild-type and mutant enzymes

野生酶與突變酶液在pH 4.0～11.0的緩沖液處理12 h后，相對(duì)酶活性如圖4所示。在弱堿性環(huán)境范圍內(nèi)突變酶S10和S21均具有較高的相對(duì)酶活性，表明其具有良好的穩(wěn)定性，能夠更好地應(yīng)用于食品加工環(huán)境。

圖4 野生型酶和突變酶pH值穩(wěn)定性Fig. 4 pH stability of w ild-type and mutant enzymes

2.3.3 酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果見表4，3 個(gè)突變酶的Km值均比野生型低，說明突變體酶對(duì)底物的親和力有所增強(qiáng)；突變酶的Kcat/Km值都高于野生型，表明其催化效率有所提高。

表4 野生型酶和突變酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab le 4 K inetics of w ild-type and mutant enzymes

2.3.4 三維結(jié)構(gòu)模擬及分析

圖5 地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶三維建模結(jié)構(gòu)Fig. 5 Protein 3-D structure of L-asparaginase from Bacillus licheniform is

為分析突變體S10、S16和S21酶活性提高的原因，擬建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，從氨基酸殘基間的相互作用力和空間結(jié)構(gòu)的變化來(lái)分析。因地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶晶體結(jié)構(gòu)尚未解析，將野生型氨基酸序列提交到SW ISS-MODEL服務(wù)器，以與其序列相似度達(dá)到60.62%的同源四聚體蛋白（PDB，id：5i4B.1A）為模板得到其三維結(jié)構(gòu)模型（圖5A）。地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性中心位點(diǎn)為62位的蘇氨酸和109位的絲氨酸（圖5B）。由圖5B可知，活性位點(diǎn)位于Loop環(huán)上，靠近N末端。3 個(gè)突變體發(fā)生的主要氨基酸突變位點(diǎn)在第43位和第67位，因三維結(jié)構(gòu)模板不全，模型無(wú)法構(gòu)建第43位氨基酸殘基，第67位突變前后的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化見圖5C、D。由圖5可知，67位氨基酸殘基位于柔性較大的Loop環(huán)上，由天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸后可能增大了該處的柔性，更有利于單聚體間相互作用，形成完整四聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)而促進(jìn)催化作用[16]。突變酶S10和S16均在269位發(fā)生氨基酸突變，異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼?，兩者都是脂肪族類氨基酸，性質(zhì)相似，由圖5E、F可知，突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大，表明此位點(diǎn)可能對(duì)酶活性無(wú)影響。

2.3.5 突變酶圓二色譜分析

表5 突變酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的比例Tab le 5 Proportions of secondary structures in mutant enzymes二級(jí)結(jié)構(gòu) 比例/%野生型 S10 S16 S21 α-螺旋 38.4 39.1 35.7 36.8 β-折疊 28.2 26.5 24.6 27.1轉(zhuǎn)角 4.3 3.1 5.5 4.4無(wú)規(guī)則卷曲 29.1 31.3 34.2 31.7

在圓二色譜儀190～250 nm范圍內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的橢圓率[17]，計(jì)算突變酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比例，并對(duì)突變酶進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，突變酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)比例見表5。由表5可知，與野生型酶相比，突變體S10的α-螺旋從38.4%增加到39.1%，無(wú)規(guī)則卷曲從29.1%增加到31.3%，整體二級(jí)結(jié)構(gòu)變化不大，這與突變體S10熱穩(wěn)定性無(wú)明顯變化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。突變酶S16和S21的α-螺旋數(shù)分別由38.4%減少到35.7%和36.8%，無(wú)規(guī)則卷曲由29.1%分別增加到34.2%和31.7%。研究表明，α-螺旋具有維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用[18]，無(wú)規(guī)則卷曲的增加提高了蛋白質(zhì)柔性結(jié)構(gòu)，不利于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[19-21]，這與熱穩(wěn)定性研究結(jié)果相一致。

3 討 論

目前關(guān)于L-天冬酰胺酶分子改造方面的研究，主要針對(duì)酶催化活力和穩(wěn)定性的提高，國(guó)內(nèi)外學(xué)者大部分采用理性設(shè)計(jì)的方法。如2007年，Li Liangzhu等[22]通過用脯氨酸替代位于氫鍵環(huán)內(nèi)的Asp178獲得大腸桿菌D178P突變體，突變體具有較高的熱穩(wěn)定性，且不影響酶活性；Shikha等[23]通過替換表面氨基酸殘基得到幾株酶活性和穩(wěn)定性均提高的突變株；2014年，Vidya等[24]通過對(duì)大腸桿菌克隆的ansB基因的定點(diǎn)誘變研究了表面電荷對(duì)L-天冬酰胺酶Ⅱ的穩(wěn)定性的影響。而關(guān)于L-天冬酰胺酶定向進(jìn)化研究的報(bào)道甚少，只有2009年Georgia等[25]使用定向進(jìn)化方法建立來(lái)源于歐文氏菌（Erw inia）的L-天冬酰胺酶突變文庫(kù)，獲得熱穩(wěn)定性有所改善的突變體Asp133Val。

本研究利用易錯(cuò)PCR和DNA shuffling策略對(duì)地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變，從19 100 個(gè)突變株中獲得酶活性提高的3個(gè)突變體S10、S16和S21，突變酶比活較野生型分別提高106%、74%和43%。最佳突變體S10酶比活力達(dá)到（306.59±3.21）IU/m g，高于張顯[26]、Long Shuiqing[12]等定點(diǎn)突變的最佳突變體酶活性。動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明突變酶S10的Km值為0.598 mmol/L，高于野生型酶（0.692 mmol/L），Kcat/Km為522.26 L/（mmol·m in），較野生型提高75%，說明該突變酶對(duì)底物的親和力有所增強(qiáng)，同時(shí)催化效率也大幅度提高，該結(jié)果優(yōu)于Saurabh[27]、Long Shuiqing[12]等定點(diǎn)突變后突變酶催化效率。

為探究突變酶酶活性提高的原因，對(duì)野生型氨基酸序列進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)模擬，結(jié)果見圖5。突變體S10、S16和S21都在第67位發(fā)生突變，該位點(diǎn)氨基酸殘基由天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸。此突變位點(diǎn)位于Loop環(huán)上，靠近四聚體催化活性中心界面，且絲氨酸側(cè)鏈較短，是一種柔性較大的強(qiáng)親水性氨基酸。圓二色譜結(jié)果顯示，相比野生酶，突變酶的α-螺旋減少、無(wú)規(guī)則卷曲有所增加，表明其剛性略有降低，這與熱穩(wěn)定性研究結(jié)果相一致[18-21]；柔性有所增加，突變酶Loop環(huán)結(jié)構(gòu)與野生酶相比有所上升，柔性結(jié)構(gòu)的增大可能增加了Loop環(huán)結(jié)構(gòu)，利于酶與底物結(jié)合和產(chǎn)物的釋放，提高了轉(zhuǎn)化效率，這可能是這3 個(gè)突變酶活性提高的主要原因[28-29]。在突變體S10和S16中都發(fā)生第43位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?，但因其三維結(jié)構(gòu)模板不全，模型無(wú)法構(gòu)建出第43位氨基酸殘基。推測(cè)第43位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼岷?，在此位點(diǎn)引入了更多的氫鍵相互作用，可能增加了酶分子和底物間的氫鍵相互作用，提高了底物親和力[19,23,30]。另一方面，谷氨酸攜帶強(qiáng)的負(fù)電荷，可與正電離子相互作用，降低催化反應(yīng)的活化能，從而提高酶的催化效率[27]。

本研究通過定向進(jìn)化技術(shù)提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的酶活性，提高了該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力，說明利用定向進(jìn)化策略能夠有效地提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性。

[1] FRIEDMAN M. Chemistry, biochemistry, and safety of acrylamide. A review[J]. Journal of Agricultural and Food Chem istry, 2003, 51(16):4504-4526. DOI:10.1021/jf030204.

[2] W ILSON K M, RIMM E B, THOMPSON K M, et al. Dietary acrylamide and cancer risk in humans: a review[J]. Journal Für Verbraucherschutz Und Lebensm ittelsicherheit, 2006, 1(1): 19-27. DOI:10.1007/s00003-006-0005-6.

[3] ANSSE M, QUARTA B, PELOUX L, et al. Effect of formulation on the capacity of L-asparaginase to m inim ize acrylam ide formation in short dough biscuits[J]. Food Research International, 2011, 44(9):2837-2842. DOI:10.1016/j.foodres.2011.06.025.

[4] MOHAN N S, SHIMRAY C A, INDRANI D, et al. Reduction of acrylam ide formation in sweet bread w ith L-asparaginase treatment[J].Food and Bioprocess Technology, 2013, 7(3): 741-748. DOI:10.1007/s11947-013-1108-6.

[5] MEDEIROS R, MESTDAGH F, DEMEULENAER B, et al.Acrylamide formation in fried potato products—present and future,a critical review on mitigation strategies[J]. Food Chem istry, 2012,133(4): 1138-1154. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.08.001.

[6] SALOME M F P, CARRASCO J A, GRANBY K. Patented techniques for acrylam ide m itigation in high-temperature[J]. Recent Patents on Food, Nutrition & Agriculture, 2011, 3: 158-171.

[7] CAPUANO E, FERRIGNO A, ACAMPA I, et al. Effect of flour type on Maillard reaction and acrylam ide formation during toasting of bread crisp model system s and m itigation strategies[J]. Food Research International, 2009, 42(9): 1295-1302. DOI:10.1016/j.foodres.2009.03.018.

[8] KUKUROVA K, MORALES F J, BEDNARIKOVA A, et al. Effect of L-asparaginase on acrylam ide m itigation in a fried-dough pastry model[J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2009, 53(12): 1532-1539. DOI:10.1002/mnfr.200800600.

[9] B?TTCHER D, BORNSCHEUER U T. Protein engineering of m icrobial enzymes[J]. Current Opinion in M icrobiology, 2010, 13(3):274-282. DOI:10.1016/j.m ib.2010.01.010.

[10] YANG H Q, LU X Y, LIU L, et al. Fusion of an Oligopeptide to the N term inus of an alkaline α-amylase from Alkalimonasamylolytica simultaneously improves the enzyme’s catalytic efficiency, thermal stability, and resistance to oxidation[J]. Applied and Environmental M icrobiology, 2013, 79(9): 3049-3058. DOI:10.1128/AEM.03785-12.

[11] SUDHIR A P, AGARWAAL V V, DAVE B R, et al. Enhanced catalysis of L-asparaginase from Bacillus licheniformis by a rational redesign[J]. Enzyme and M icrobial Technology, 2016, 86: 1-6.DOI:10.1016/j.enzm ictec.2015.11.010.

[12] LONG S Q, ZHANG X, RAO Z, et al. Am ino acid residues adjacent to the catalytic cavity of tetramer L-asparaginaseⅡ contribute significantly to its catalytic efficiency and thermostability[J].Enzyme and M icrobial Technology, 2015, 82: 15-22. DOI:10.1016/j.enzm ictec.2015.08.009.

[13] GUO F F, ZHANG C, BIE X M, et al. Improving the thermostability and activity of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 by directed evo lution and site-directed mutagenesis[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2014, 107: 23-30. DOI:10.1016/j.MOLCATB.2014.05.016.

[14] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of m icrogram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochem istry, 1976, 72(1/2): 248-254.DOI:10.1016/0003-2697(76)90527-3.2.

[15] PRADHAN B, DASH S, SAHOO S. Screening and characterization of extracelluar L-asparaginase producing Bacillus subtilis strainhswx88,isolated from Taptapanihotspring of Odisha, India[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2013, 3(12): 936-941. DOI:10.1016/S2221-1691(13)60182-3.

[16] MEZENTSEV Y V, MOLNAR A A, SOKOLOV N N, et al.Specificity of molecularrecognition in oligomerization of bacterial L-asparaginases[J]. Biochem istry(M oscow) Supp lement Series B: Biomedical Chem istry, 2011, 5(2): 124-134. DOI:10.1134/S1990750811020107.

[17] MOHSEN M, ZARGHAM S, AZADEH E H, et al. Enhancing activity and thermostability of lipase A from Serratiamarcescens by sitedirected mutagenesis[J]. Enzyme and M icrobial Technology, 2016, 94:18-28. DOI:10.1016/j.enzm ictec.2016.07.006.26.

[18] SELVARAJ S, GORM IHA M M. Importance of long-range interaction in (α/β)8barrel fold[J]. Journal of Protein Chem istry, 1998, 17: 691-697. DOI:10.1007/BF02780972.28.

[19] KIM M S, LEI X G. Enhancing thermostability of Escherichia coli phytase AppA 2 by error-prone PCR[J]. Applied M icrobiology and Biotechnology, 2008, 79(1): 69-75. DOI:10.1007/s00253-008-1412-7.

[20] YUEN C M, LIU D R. Dissecting protein structure and function using directed evolution[J]. Nature Methods, 2007, 4(12): 995-997.DOI:10.1038/nmeth1207-995.

[21] KAMAL M Z, AHMAD S, MOLUGU T R, et al. In vitro evolved nonaggregating and thermostable lipase: structural and thermodynam ic investigation[J]. Journal of Molecular Biology, 2011, 413(3): 726-741.DOI:10.1016/j.jmb.2011.09.002.

[22] LI L Z, X IE T H, LI H J, et al. Enhancing the thermostability of L-asparaginaseⅡ by substitution w ith pro in predicted hydrogenbonded turn structures[J]. Enzyme and M icrobial Technology, 2007,41(4): 523-527.

[23] SHIKHA V, RANJIT K M, PRASANTA M, et al. Improvement of stability and enzymatic activity by site-directed mutagenesis of E. coli asparaginaseⅡ[J]. Biochim ica et Biophysica Acta, 2014, 1844(7):1219-1230. DOI:10.1016/j.bbapap.2014.03.013.

[24] VIDYA J, USHASREE M V, PANDEY A. Effect of surface charge alteration on stability of L-asparaginaseⅡ from Escherichia sp.[J].Enzyme & M icrobial Technology, 2014, 56(6): 15-19.

[25] KOTZIA G A, LABROU N E. Engineering thermal stability of L-asparaginase by in vitro directed evolution[J]. FEBS Journal, 2009,276: 1750-1761.

[26] 張顯, 龍水清, 饒志明, 等. 定點(diǎn)突變提高枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的活力及穩(wěn)定性[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015, 34(11): 1128-1134.

[27] SAURABH B, ANKIT S, GOUTAM M, et al. Hyperthermophilic asparaginase mutants with enhanced substrate affinity and antineoplastic activity: structural insights on their mechanism of action[J]. Faseb Journal,2012, 26(3): 1161-1171. DOI:10.1096/fj.11-191254.

[28] TSOU C L. Location of the active sites of some enzymes in lim ited and flexible molecular regions[J]. Trends in Biochem ical Sciences,1986, 11(10): 427-429. DOI:10.1016/0968-0004(86)90178-7.

[29] VERMA S, MEHTA R K, MA ITI P, et al. Im p rovement o f stability and enzymatic activity by site-directed mutagenesis of E. coli asparaginaseⅡ[J]. Biochim ica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteom ics, 2014, 1844(7): 1219-1230. DOI:10.1016/j.bbapap.2014.03.013.

[30] WONG K S, FONG W P, TSANG P W. A single Phe54Tyr substitution im proves the catalytic activity and thermostability of Trigonopsis variabilis D-am ino acid oxidase[J]. New Biotechnology, 2009, 27(1):78-84. DOI:10.1016/j.nbt.2009.11.002.

Improving L-Asparaginase Activity from Bacillus licheniformis by Directed Evolution

SHAO Zexiang, JIAO Linshu, LU Zhaoxin, BIE Xiaomei, ZHAO Haizhen, ZHANG Chong, Lü Fengxia*
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to improve its L-asparaginase activity, the L-asparaginase gene of Bacillus licheniformis was molecularly modified by directed evolution. Mutants S10, S16 and S21 were screened out of more than 19 100 mutants by two rounds of error-prone PCR and one round of DNA shuffl ing, whose specific activities were increased by 106%, 74% and 43%,respectively, as compared to that of the w ild type, together increased Kcat/Km. The am ino acid sequence of S10 showed three mutations, K43E, N67S and I269L. The results of three-dimensional simulation showed that amino acid mutations at position 43 for glutam ic acid and at position 67 for serine may improve substrate affinity and catalytic efficiency, thereby increasing enzymatic activity. The circular dichroism analysis showed that the mutant enzymes contained less α-helix and more random coil than the w ild enzyme, indicating a slight decrease in rigidity and an increase in flexibility. This study indicates that directional evolution can effectively improve the L-asparaginase activity from B. licheniformis.

L-asparaginase; directed evolution; enzyme activity

10.7506/spkx1002-6630-201722002

TS201.3

A

1002-6630（2017）22-0008-06

邵澤香, 焦琳舒, 陸兆新, 等. 基于定向進(jìn)化技術(shù)提高地衣芽孢桿菌L-天冬酰胺酶活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(22): 8-13.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722002. http://www.spkx.net.cn

SHAO Zexiang, JIAO Linshu, LU Zhaoxin, et al. Improving L-asparaginase activity from Bacillus licheniformis by directed evolution[J]. Food Science, 2017, 38(22): 8-13. (in Chinese w ith English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201722002.http://www.spkx.net.cn

2017-05-11

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31671800）

邵澤香（1990—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：2014108005@njau.edu.cn

*通信作者：呂鳳霞（1963—），女，教授，博士，主要從事酶工程研究。E-mail：lufengxia@njau.edu.cn