基于富集微流控芯片的稻曲病菌孢子光電檢測(cè)方法

楊 寧，王 盼，張榮標(biāo)，徐佩鋒，孫 俊，毛罕平

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基于富集微流控芯片的稻曲病菌孢子光電檢測(cè)方法

楊 寧1,2，王 盼1，張榮標(biāo)1※，徐佩鋒1，孫 俊1，毛罕平2

（1. 江蘇大學(xué)電氣信息工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)工程研究院，鎮(zhèn)江 212013）

針對(duì)當(dāng)前水稻真菌病害發(fā)病時(shí)間短、傳播速度快，缺乏有效早期預(yù)警技術(shù)的難點(diǎn)，提出一種基于微流控芯片的空氣流中水稻真菌病害光電檢測(cè)方法。該文根據(jù)微尺度下孢子富集動(dòng)力學(xué)特征設(shè)計(jì)了病害孢子高效富集微流控芯片，并結(jié)合光電檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行病害孢子的檢測(cè)。試驗(yàn)根據(jù)空氣動(dòng)力學(xué)原理以及孢子富集量的大小對(duì)微流控芯片通道尺寸進(jìn)行設(shè)置。根據(jù)光檢測(cè)原理和不同濃度孢子在富集區(qū)形成的光衰減特性，篩選具有高靈敏度特性的檢測(cè)光強(qiáng)。在以檢測(cè)光譜的靈敏度性能為目標(biāo)并綜合考慮線性度的基礎(chǔ)上，優(yōu)選檢測(cè)波長(zhǎng)。以水稻稻曲病菌孢子為檢測(cè)對(duì)象，進(jìn)行了自動(dòng)化微流控富集和光電檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：在光源光強(qiáng)1.1×104cd，波長(zhǎng)為650 nm時(shí)，利用所述檢測(cè)方法針對(duì)水稻稻曲病菌孢子檢測(cè)結(jié)果（相比與鏡檢值）誤差小于17.5%，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果建立相關(guān)系數(shù)為0.992 9的檢測(cè)模型，具有較好的線性度及可靠性。研究結(jié)果為便攜式作物病害檢測(cè)裝備的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

病害；靈敏度分析；模型；微流控芯片；真菌；光電檢測(cè)

0 引 言

稻曲病等作物真菌病害因其傳播速度快、危害大等問題已成為農(nóng)業(yè)工程領(lǐng)域面臨的世界性難題[1-2]。而目前，傳統(tǒng)的解決方式仍主要為粗放、盲目的噴灑農(nóng)藥，由此造成的農(nóng)藥殘留污染對(duì)人體健康造成了極大的危害[3-6]。因此，運(yùn)用智能化手段對(duì)病害傳播途徑中的真菌孢子進(jìn)行高效檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)作物病害早期預(yù)警已成為農(nóng)業(yè)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。

現(xiàn)階段真菌孢子的檢測(cè)手段主要有稱重法[8]、圖像法[9]。稱重法是通過大量沉積真菌孢子，并利用稱重傳感器實(shí)現(xiàn)定量計(jì)算的檢測(cè)方法，然而該方法缺少快速有效的富集手段，使得檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)，往往錯(cuò)過最佳施藥期，并且野外的復(fù)雜環(huán)境會(huì)對(duì)稱重精度產(chǎn)生較大影響。傳統(tǒng)的圖像法由肉眼觀察顯微圖像并計(jì)算孢子數(shù)量來完成，該方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、人力資源消耗大、自動(dòng)化程度低。而目前利用圖像法進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別真菌孢子個(gè)數(shù)技術(shù)也逐步出現(xiàn)，例如李小龍等[10]、齊龍等[11]利用圖像處理方法對(duì)捕捉好的孢子均實(shí)現(xiàn)孢子個(gè)數(shù)的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)；姜玉瑩等[12]將自動(dòng)對(duì)焦顯微鏡集成到孢子捕捉儀上實(shí)現(xiàn)捕捉數(shù)量的大概計(jì)數(shù)，但是這種方法依舊需要借助顯微鏡或高精度電子天平等昂貴的儀器進(jìn)行輔助檢測(cè)，因而無法在市面上推廣實(shí)施。此外，免疫法[13]、核酸檢測(cè)法[14]、微懸臂梁檢測(cè)法[15]等也是常見的微生物快速檢測(cè)法。免疫檢測(cè)利用抗原和抗體的特異性結(jié)合能夠較高精度實(shí)現(xiàn)特定微生物濃度的快速檢測(cè)。核酸檢測(cè)法利用分子擴(kuò)增技術(shù)也能夠大大減少檢測(cè)時(shí)間，并進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度。但上述方法往往需要特異性抗體或引物以及專業(yè)的人員及設(shè)備，難以實(shí)現(xiàn)野外實(shí)時(shí)檢測(cè)[16]。此外，關(guān)于病害真菌孢子的抗體提取研究尚不成熟。微懸臂梁檢測(cè)法則是一種通過在微懸臂梁表面修飾敏感材料或者受體分子達(dá)到對(duì)待檢目標(biāo)氣體或液體分子進(jìn)行吸附，從而利用微懸臂梁運(yùn)動(dòng)狀態(tài)變量標(biāo)定待檢物濃度的方法。如Nugaeva等[17]使用鍍金和未涂覆的硅微機(jī)械懸臂陣列快速定量檢測(cè)黑曲霉和釀酒酵母。該方法具有高精度與高靈敏度特點(diǎn)。但是微懸臂梁檢測(cè)法對(duì)檢測(cè)環(huán)境要求嚴(yán)格，難以適應(yīng)復(fù)雜的大田環(huán)境條件[18]。

隨著微納米技術(shù)加工工藝水平的發(fā)展，近年來微流控芯片技術(shù)因其尺度微小、具備微分離及富集等功能、光學(xué)性能好等[19-21]優(yōu)點(diǎn)已進(jìn)入農(nóng)藥殘留檢測(cè)[22-23]、水產(chǎn)致病菌檢測(cè)[24]等農(nóng)業(yè)工程相關(guān)領(lǐng)域。例如郭建江等[25]在微流控芯片中利用磁控富集等手段，實(shí)現(xiàn)超低濃度的水產(chǎn)致病菌的快速檢測(cè)。Wang等[19]通過在微流控芯片內(nèi)設(shè)計(jì)魚骨型富集區(qū)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高效捕捉，并采用光學(xué)手段實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。目前，在液體環(huán)境中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行富集和檢測(cè)手段較多[26-29]，然而課題所涉及的利用微流控芯片對(duì)空氣中的孢子進(jìn)行富集，并利用光學(xué)原理進(jìn)行檢測(cè)的研究還未見報(bào)道。

因此，論文將富集原理與光檢測(cè)原理相結(jié)合，通過設(shè)計(jì)具有孢子富集功能的微流控芯片和光電檢測(cè)系統(tǒng)，提出一種基于微流控芯片的水稻稻曲病真菌病害光電檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)超微濃度氣傳孢子的高效檢測(cè)。

1 系統(tǒng)設(shè)計(jì)

1.1 微流控芯片的設(shè)計(jì)與制作

在微流控芯片的設(shè)計(jì)中，首先根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)的大小以及微型氣泵的通量設(shè)定芯片進(jìn)樣通道的寬度，并據(jù)此確定真菌孢子運(yùn)動(dòng)速度，而后根據(jù)孢子由運(yùn)動(dòng)態(tài)到靜止態(tài)的臨界速度以及非目標(biāo)粒子的過濾量確定微流控芯片富集檢測(cè)區(qū)的最優(yōu)直徑。在進(jìn)入富集檢測(cè)區(qū)之前，真菌孢子所受的拖拉力應(yīng)大于真菌孢子所受摩擦力，以保證真菌孢子能夠抵達(dá)富集檢測(cè)區(qū)；當(dāng)孢子運(yùn)動(dòng)至富集檢測(cè)區(qū)時(shí)，孢子所受拖拉力應(yīng)小于孢子所受摩擦力，致使孢子停留在富集檢測(cè)區(qū)，且孢子根據(jù)其粒徑與質(zhì)量差異呈現(xiàn)分散排列。

為了滿足微流控光電檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)真菌孢子的捕捉檢測(cè)，設(shè)計(jì)了具有進(jìn)樣接口、進(jìn)樣通道、富集檢測(cè)區(qū)、電動(dòng)抽氣接口的4級(jí)陣列式微流控芯片。其中微流控通道結(jié)構(gòu)組成如圖1a所示：1為直徑為500m進(jìn)樣接口，在進(jìn)樣接口均接入方便采集空氣中真菌孢子的軟管，用于真菌孢子的采集進(jìn)樣。2為寬度為250m的進(jìn)樣通道。進(jìn)樣通道采用寬度固定、簡(jiǎn)約平緩的直通式設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)真菌孢子在通道內(nèi)的無障礙運(yùn)動(dòng)，并方便芯片清洗，提高芯片的再利用率。3為富集檢測(cè)區(qū)，富集檢測(cè)區(qū)設(shè)計(jì)為直徑為2000m的圓形腔室，此設(shè)計(jì)不僅實(shí)現(xiàn)孢子運(yùn)動(dòng)速度的緩降，使孢子有序排列于富集檢測(cè)區(qū)；還與光纖出射透鏡形成的圓形平行光斑相匹配，降低光源定位不準(zhǔn)或斑徑過大而引入的檢測(cè)干擾及噪聲。4為電動(dòng)抽氣接口，電動(dòng)抽氣接口接入微型氣泵管道，抽氣式設(shè)計(jì)相比吹氣式設(shè)計(jì)，減少了收集孢子時(shí)的泵內(nèi)損失。

1.孢子進(jìn)樣接口；2.進(jìn)樣通道；3.富集檢測(cè)區(qū)；4.電動(dòng)抽氣接口

1.Spore inlet; 2.Injection channel; 3.Enrichment detection zone; 4.Electric pumping inlet

圖1 微流控芯片

Fig.1 Microfluidic chip

試驗(yàn)利用熱壓法通過光刻、注塑、壓印、鍵合等工藝制作微流控芯片。如圖1b所示，由于使用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）材料作為蓋片，玻璃為鍵合基片，PDMS材料表面光滑平整、漫反射率低使得芯片的透光率高達(dá)95%，良好的透光性能夠保證光電檢測(cè)具有較好的靈敏度。圖1b中，微流控芯片為四級(jí)陣列式微流控芯片。

1.2 微流控檢測(cè)系統(tǒng)試驗(yàn)平臺(tái)創(chuàng)建

圖2為微流控芯片光電檢測(cè)系統(tǒng)平臺(tái)示意圖。試驗(yàn)所涉及設(shè)備包括HR2000+ES型光譜儀（美國(guó)海洋光學(xué)公司）、海洋光學(xué)HL-2000-HP-FHSA型精密光源（美國(guó)海洋光學(xué)公司）、光纖支架、發(fā)射光纖探頭、接收光纖探頭、微流控芯片、微型氣泵、電腦。

將微流控芯片放置在光電檢測(cè)支架上，發(fā)射光纖探頭一端與光源相連（將光源的光強(qiáng)與波長(zhǎng)調(diào)制最佳狀態(tài)），另一端安裝在檢測(cè)支架上方與微流控芯片的上表面相貼；檢測(cè)支架下方安裝接收光纖探頭，接收光纖探頭一端與微流控芯片下表面相貼，另一端與光譜儀相連，光譜儀輸出的信號(hào)可直接在電腦上顯示。另外，將通量為0.14 mL/min的微型氣泵連接到抽氣區(qū)，為微流控芯片收集空氣中的真菌孢子提供進(jìn)樣動(dòng)力。整個(gè)檢測(cè)過程保持在暗室的條件下進(jìn)行。

1.光源；2.光譜儀；3.微流控芯片；4.發(fā)射光纖探頭；5.接收光纖探頭；6.電腦；7.微型氣泵；8.孢子；9.軟管

1.3 試驗(yàn)材料與步驟

試驗(yàn)樣本水稻稻曲病菌孢子是2017年8月由江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)獲得，試驗(yàn)利用氣溶膠發(fā)生器可將孢子樣本制作成氣溶膠粒子，均勻釋放在單位體積為1L的容器中。試驗(yàn)采取標(biāo)準(zhǔn)采樣時(shí)間為5 min，利用顯微圖像法計(jì)算獲得平均孢子濃度為1.5×103個(gè)/mm2，則此濃度為標(biāo)準(zhǔn)單位樣品濃度，每隔5min進(jìn)行一次檢測(cè)。

首先，根據(jù)檢測(cè)需要利用AutoCAD軟件設(shè)計(jì)微流控芯片，并通過COMSOL Multiphysics 5.1仿真軟件對(duì)所設(shè)計(jì)的微流控芯片進(jìn)行仿真，得到滿足真菌孢子富集需求的微通道結(jié)構(gòu)后進(jìn)行微流控芯片的制作。將制作好的芯片通過軟管連接氣泵并搭建如圖2所示的系統(tǒng)檢測(cè)平臺(tái)。對(duì)樣本進(jìn)行吸氣采集試驗(yàn)，在100 min內(nèi)，分別每隔5 min采集一次試驗(yàn)數(shù)據(jù)。將未進(jìn)行吸氣采集時(shí)刻（即=0時(shí)刻）的透射光強(qiáng)作為入射光強(qiáng)（cd），=5 min及后續(xù)時(shí)刻測(cè)得的透射光強(qiáng)作為透射光強(qiáng)0（cd），此時(shí)，由于引起入射光強(qiáng)與透射光強(qiáng)0的差異性的唯一原因就是富集的病害孢子，因此，此方法可抵消因微流控芯片自身對(duì)光信號(hào)的反射或吸收所引起的誤差問題，具體系統(tǒng)設(shè)計(jì)試驗(yàn)流程如圖3所示。

圖3 系統(tǒng)設(shè)計(jì)試驗(yàn)流程圖

其次，試驗(yàn)利用搭建好的裝置在不同光源光強(qiáng)及波長(zhǎng)條件下對(duì)不同濃度的真菌孢子樣本進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)靈敏度與光源光強(qiáng)及波長(zhǎng)的關(guān)系確定最佳光源光強(qiáng)及波長(zhǎng)值。

最后，將檢測(cè)裝置光源參數(shù)調(diào)節(jié)到通過試驗(yàn)優(yōu)化得到的數(shù)值，建立真菌孢子濃度與吸光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2 工作原理

2.1 孢子富集原理

當(dāng)真菌孢子隨空氣氣流進(jìn)入微流控芯片通道時(shí)，通道對(duì)真菌孢子存在摩擦力f的作用，摩擦力f可表示為

式中為摩擦系數(shù)（本文中微流控芯片的靜摩擦系數(shù)為0.8，滾動(dòng)摩擦系數(shù)為0.34）；N是真菌孢子對(duì)芯片通道表面的壓力（N）；來流速度為真菌孢子提供一個(gè)拖拉力Fr[30]（N），當(dāng)Fr達(dá)到一定值時(shí)，孢子將克服靜摩擦的作用，改變?cè)嫉倪\(yùn)動(dòng)狀態(tài)隨氣流運(yùn)動(dòng)，由Stokes定律[31]可將拖拉力表示為：

式中為空氣的動(dòng)力黏度，N·s/m；p為真菌孢子粒徑，m，試驗(yàn)設(shè)置孢子直徑為6m；p為微顆粒中心處的氣流速度，m/s；為了改變真菌孢子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)并富集在富集檢測(cè)區(qū)內(nèi)，須將速度p控制在一定范圍內(nèi)。

當(dāng)空氣中的粒子運(yùn)行到富集檢測(cè)區(qū)時(shí)，由于富集檢測(cè)區(qū)域變大，真菌孢子速度變慢，此時(shí)拖拉力Fr不足以克服摩擦力，孢子便會(huì)停留在富集檢測(cè)區(qū)，這樣就實(shí)現(xiàn)了真菌孢子的富集。

2.2 光檢測(cè)原理

當(dāng)光束穿過含有粒子的介質(zhì)中，由于粒子具有散射和吸收作用，透射光強(qiáng)必定小于入射光強(qiáng)，衰減部分光強(qiáng)大小與粒子的大小和濃度有關(guān)，根據(jù)朗伯比爾定律[32]可知，入射光強(qiáng)度（）和透射光強(qiáng)度（0）滿足以下關(guān)系

式中（m）和（m）分別是顆粒尺寸分布的下限和上限，為粒子直徑隨機(jī)量（m），為粒子群的分布、是尺度參數(shù)的概率分布，為粒子直徑（m）。

而孢子的濃度v（個(gè)/m3）可表示為

將式（4）帶入式（3）可得濃度與出射光強(qiáng)和入射光強(qiáng)的關(guān)系

3 結(jié)果與分析

3.1 富集檢測(cè)區(qū)直徑優(yōu)選

微流控芯片結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)對(duì)實(shí)現(xiàn)真菌孢子的富集具有決定性的影響。根據(jù)目標(biāo)粒子進(jìn)入微流控芯片通道內(nèi)所需速度大小范圍以及所使用的微型氣泵的通量進(jìn)行計(jì)算，試驗(yàn)將進(jìn)樣通道固定設(shè)置為500m，確定真菌孢子運(yùn)動(dòng)的拖拉力，但此時(shí)富集檢測(cè)區(qū)內(nèi)的速度未知。為了使真菌孢子在富集檢測(cè)區(qū)內(nèi)有序富集，試驗(yàn)通過優(yōu)化富集檢測(cè)區(qū)的直徑大小，改變富集檢測(cè)區(qū)的速度分布，從而得到真菌孢子富集所需要的速度。

利用AutoCAD軟件繪制出5組富集檢測(cè)區(qū)直徑分別為：1 000、1 500、2 000、2 500、3 000m的芯片結(jié)構(gòu)圖，通過COMSOL Multiphysics 5.1仿真軟件對(duì)5組微流控芯片分別進(jìn)行仿真，分析通道內(nèi)的速度大小，所得芯片速度仿真分布圖如圖4所示，芯片內(nèi)速度最大值分布圖如圖5所示。

注：富集檢測(cè)區(qū)直徑為2 000 μm。

試驗(yàn)根據(jù)OEK方法[33-34]推算出的單個(gè)稻曲病菌孢子的質(zhì)量在pg級(jí)。以稻曲病孢子為檢測(cè)對(duì)象，令Fr大于f，取靜摩擦系數(shù)0.8對(duì)孢子克服摩擦力所需運(yùn)動(dòng)速度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示，當(dāng)芯片通道中速度大于0.346 m/s時(shí)孢子開始運(yùn)動(dòng)。而后孢子運(yùn)動(dòng)采用滾動(dòng)摩擦系數(shù)0.34對(duì)孢子受力情況進(jìn)行分析；令Fr小于f，即當(dāng)芯片通道速度小于0.138 m/s時(shí)，孢子由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)為靜止?fàn)顟B(tài)，滿足孢子富集需求。芯片根據(jù)孢子由靜止到運(yùn)動(dòng)和由運(yùn)動(dòng)到靜止所需速度對(duì)富集檢測(cè)區(qū)的直徑進(jìn)行設(shè)置，由此使檢測(cè)目標(biāo)停留在檢測(cè)區(qū)。并且水稻花粉質(zhì)量在17 ng左右，此時(shí)試驗(yàn)所采用的速度不足以使花粉進(jìn)入芯片，以此排除花粉對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾作用。

表1可看出測(cè)富集檢測(cè)區(qū)的速度值，富集檢測(cè)區(qū)的最小速度值隨直徑變大而減小。當(dāng)富集檢測(cè)區(qū)直徑為2000m時(shí)，富集檢測(cè)區(qū)的最小速度降至0.138 m/s，此時(shí)速度不僅滿足孢子停滯需求，還可以支持質(zhì)量及直徑小于真菌孢子的雜質(zhì)繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，降低雜質(zhì)的富集率，提高裝置檢測(cè)精度，降低檢測(cè)誤差；當(dāng)直徑為2500m時(shí)，富集檢測(cè)區(qū)的速度將降至0.107 m/s，此速度在滿足真菌孢子富集需求的同時(shí)，還會(huì)將質(zhì)量和直徑小于孢子的部分雜質(zhì)留在檢測(cè)富集區(qū)，增大檢測(cè)誤差。由此可知，當(dāng)直徑為2000m時(shí)，裝置檢測(cè)誤差最小，所以試驗(yàn)將富集檢測(cè)區(qū)的直徑設(shè)為2000m。圖5為富集檢測(cè)區(qū)以及富集檢測(cè)區(qū)出口收集試驗(yàn)后的狀態(tài)圖像。由圖5a可看出，孢子均勻留在檢測(cè)富集區(qū)；圖5b中無孢子或雜質(zhì)殘留跡象。進(jìn)一步驗(yàn)證了微流控芯片的科學(xué)性。

表1 富集檢測(cè)區(qū)不同直徑對(duì)應(yīng)不同的富集速度

注：富集檢測(cè)區(qū)直徑為2 000 μm，圖a、b均放大100倍。

3.2 光源光強(qiáng)及波長(zhǎng)篩選

試驗(yàn)利用光電檢測(cè)方法對(duì)基于微流控芯片的孢子濃度進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，系統(tǒng)條件參數(shù)主要包括光源光強(qiáng)及波長(zhǎng)。因此試驗(yàn)通過光譜儀對(duì)不同濃度的孢子樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，確定檢測(cè)系統(tǒng)的較佳光源參數(shù)。其中，試驗(yàn)將孢子濃度公式定義為富集區(qū)單位面積的孢子數(shù)。

3.2.1 光源光強(qiáng)

由于孢子是半透明物質(zhì)，光強(qiáng)過大或過小均會(huì)使檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度降低，只有確定最佳光強(qiáng)值，提高檢測(cè)系統(tǒng)靈敏度，才能有效提高孢子濃度檢測(cè)的準(zhǔn)確率。因此在利用光電檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)前，需先確定檢測(cè)光源的光強(qiáng)大小。

首先，試驗(yàn)選取收集時(shí)間為0、5、10、20、30、40、50、60、70、80 min分別對(duì)應(yīng)孢子濃度為0、1.5×103、3×103、6×103、9×103、1.2×104、1.5×104、1.8×104、2.1×104、2.4×104個(gè)/mm210組試驗(yàn)作為被測(cè)對(duì)象。其次，利用圖2所示檢測(cè)裝置檢測(cè)并記錄不同光強(qiáng)下不同濃度的孢子樣品對(duì)應(yīng)的透射光強(qiáng)值。最后，選取波長(zhǎng)為400，500，600，700 nm時(shí)，不同光強(qiáng)下不同濃度所對(duì)應(yīng)的透射光強(qiáng)值，并計(jì)算出在4組波長(zhǎng)值下在不同光強(qiáng)對(duì)應(yīng)的靈敏度值，從而確定最佳檢測(cè)光強(qiáng)。其中靈敏度定義為單位孢子濃度變化量導(dǎo)致透射光強(qiáng)的變化程度。試驗(yàn)選取光強(qiáng)作為橫坐標(biāo)，以靈敏度為縱坐標(biāo)，測(cè)得的靈敏度如圖6所示。

圖6 光強(qiáng)優(yōu)化效果圖

由圖6可知，當(dāng)光源光強(qiáng)設(shè)置為1.1×104cd時(shí)，試驗(yàn)所搭建的基于富集微流控芯片的水稻菌病害光電檢測(cè)裝置靈敏度最高。

3.2.2 波 長(zhǎng)

波長(zhǎng)不同，試驗(yàn)的透射光強(qiáng)不同。只有找到最佳波長(zhǎng)才能準(zhǔn)確的反映孢子濃度和透射光強(qiáng)的關(guān)系。首先，試驗(yàn)設(shè)定光源光強(qiáng)值為1.1×104cd，以氣泵工作10 min為間隔對(duì)應(yīng)的真菌孢子濃度作為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)并保存試驗(yàn)數(shù)據(jù)。其次，以光源波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以透射光強(qiáng)為縱坐標(biāo)，建立不同孢子濃度在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)檢測(cè)濃度的分布圖，如圖7所示。當(dāng)<1.5×103個(gè)/mm2時(shí)，光強(qiáng)試驗(yàn)檢測(cè)曲線出現(xiàn)嚴(yán)重合狀態(tài)，非線性程度較高，無法試現(xiàn)定量檢測(cè)，因此依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度測(cè)量可得孢子在10 min富集條件下的檢出限為1.5×103個(gè)/mm2。

由圖7可知，對(duì)水稻稻曲病真菌孢子檢測(cè)時(shí)，不同孢子濃度下不同波長(zhǎng)值所對(duì)應(yīng)的透射光強(qiáng)的不同，并且透射光強(qiáng)隨孢子濃度的增大而減小。為了獲取最佳檢測(cè)波長(zhǎng)值，試驗(yàn)選取波長(zhǎng)值在450～750 nm，間隔為50 nm的波長(zhǎng)進(jìn)行線性相關(guān)系數(shù)及波長(zhǎng)靈敏度的分析。波長(zhǎng)與檢測(cè)精度和檢測(cè)靈敏度的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表2所示。

圖7 不同孢子濃度在不同波長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)的透射光強(qiáng)

由表2計(jì)算結(jié)果可知：在不同的波長(zhǎng)條件下，透射光強(qiáng)與孢子濃度呈線性關(guān)系，波長(zhǎng)為650 nm時(shí)系統(tǒng)測(cè)量形成的線性關(guān)系變化均勻顯著，此時(shí)建立的線性關(guān)系更加真實(shí)有效的反映空氣中的真菌孢子濃度。因此，此時(shí)系統(tǒng)的檢測(cè)波長(zhǎng)靈敏度最高為1.18×10-2cd/(個(gè)/mm2)，并且此時(shí)線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.995 3，符合系統(tǒng)檢測(cè)需求。因此，系統(tǒng)選擇650 nm為檢測(cè)光源的較佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

表2 波長(zhǎng)與靈敏度的對(duì)應(yīng)關(guān)系表

3.3 性能分析與驗(yàn)證

論文以水稻稻曲病菌孢子標(biāo)準(zhǔn)樣品為研究對(duì)象，利用固定目標(biāo)對(duì)提出的基于富集微流控芯片的水稻稻曲病菌病害光電檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)朗伯比爾定律可知，吸收系數(shù)與稻曲病菌孢子的物質(zhì)屬性有關(guān)，所采用的吸收波長(zhǎng)為稻曲病的特征吸收峰，對(duì)于其他類型病害，可以進(jìn)一步篩選特征吸收峰。如果特征吸收峰有重合，則可采用雙峰或者多峰復(fù)合建模，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定目標(biāo)的定量檢測(cè)，也可利用該方法消除粒徑相似物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。此外，由于病害疫情的爆發(fā)同時(shí)需要?dú)夂?、溫度、濕度等多重因素的影響，因此，試?yàn)數(shù)據(jù)需結(jié)合環(huán)境條件才能實(shí)現(xiàn)對(duì)病害疫情的準(zhǔn)確判斷。論文以稻曲病菌孢子為檢測(cè)對(duì)象得到檢測(cè)曲線如圖8所示，從圖中可以看出，吸光度值隨著孢子濃度值的增大而增大，近似呈線性關(guān)系。經(jīng)線性擬合后得出對(duì)應(yīng)的線性模型為：=6.147e-6+0.05188，線性相關(guān)系數(shù)為0.992 9，線性度較好，因此只需根據(jù)對(duì)應(yīng)的孢子吸光度值的大小即可計(jì)算出對(duì)應(yīng)的孢子濃度值。

圖8 孢子濃度與吸光度關(guān)系圖

為了驗(yàn)證系統(tǒng)檢測(cè)的科學(xué)性與準(zhǔn)確性，首先利用微流控芯片對(duì)水稻稻區(qū)病孢子進(jìn)行富集試驗(yàn)；而后對(duì)富集好的微流控芯片進(jìn)行光電檢測(cè)及鏡檢，驗(yàn)證系統(tǒng)準(zhǔn)確性。

試驗(yàn)主要通過將稻曲病孢子（直徑5～6m，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供）、稻瘟病孢子（直徑2～2.5m，江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院提供）、空氣中雜質(zhì)（含PM2.5、PM10等物質(zhì)）3種稻田環(huán)境主要組成物質(zhì)進(jìn)行混合，模擬水稻種植環(huán)境，對(duì)試驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行誤差檢測(cè)試驗(yàn)。試驗(yàn)利用氣溶膠發(fā)生器將稻曲病孢子、稻瘟病孢子、空氣中的雜質(zhì)3種物質(zhì)（分別取0.5 g）制備成質(zhì)量濃度為1.5 g/L的氣溶膠粒子，而后利用微流控芯片分別對(duì)制備氣溶膠粒子進(jìn)行為時(shí)30 min的收集試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，最后經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)得到的富集試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 系統(tǒng)驗(yàn)證分析表

檢測(cè)結(jié)果由表3所示，利用針對(duì)稻曲病孢子富集試驗(yàn)設(shè)置速度為0.346 m/s進(jìn)行富集試驗(yàn)。結(jié)果證明：試驗(yàn)可過濾掉絕大多數(shù)的空氣干擾物，富集的稻曲病孢子占收集物的85%以上，比較鏡檢值和檢測(cè)模型測(cè)得粒子數(shù)值，結(jié)合系統(tǒng)檢測(cè)模型誤差值可看出，論文建立的基于水稻稻曲病菌孢子的檢測(cè)模型誤差小于17.5%。符合裝置檢測(cè)要求。

4 結(jié) 論

1）提出一種基于富集微流控芯片的水稻真菌病害光電檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)集孢子進(jìn)樣、富集檢測(cè)、氣體出氣于一體的微流控芯片。

2）并對(duì)芯片微通道尺寸及進(jìn)氣速度進(jìn)行優(yōu)化，富集的稻曲病孢子占收集物的85%以上，降低空氣中無關(guān)物質(zhì)的富集，從而降低系統(tǒng)檢測(cè)誤差。

3）對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)的光源參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，檢測(cè)光源光強(qiáng)為1.1×104cd，波長(zhǎng)為650 nm時(shí)，根據(jù)吸光度與水稻稻曲病孢子濃度的關(guān)系建立檢測(cè)模型，檢測(cè)線性度達(dá)0.992 9，檢測(cè)模型誤差值小于17.5%，滿足檢測(cè)要求。

基于富集微流控芯片的水稻稻曲病菌病害光電檢測(cè)方法為便攜式病害預(yù)警系統(tǒng)的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。對(duì)于尺度、質(zhì)量相近的物質(zhì)干擾問題有待進(jìn)一步解決。

[1] 王文斌，張榮勝，羅楚平，等. 中國(guó)主要稻區(qū)稻曲病菌的生物學(xué)特性及群體遺傳多樣性[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47(14)：2762－2773. Wang Wenbin, Zhang Rongsheng, Luo Chuping, et al. Biological characteristics and genetic diversity of ustilaginoidea virens from rice regions in China[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2014, 47(14): 2762－2773. (in Chinese with English abstract)

[2] 俞咪娜，陳志誼，于俊杰，等. 來源于同一穗不同稻曲球的稻曲病的致病性及遺傳多樣性[J]. 植物病理學(xué)報(bào)，2013，43(6)：561－573.

Yu Mina, Chen Zhiyi, Yu Junjie, et al. Genetic diversity and pathogenicity of Ustilaginoidea virens isolated from different rice false smut balls of a diseased spike[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2013, 43(6): 561－573. (in Chinese with English abstract)

[3] Block E K, Lacher T E, Brewer L W, et al. Population responses of peromyscus resident in iowa cornfields treated with the organophosphorus pesticide COUNTER?[J]. Ecotoxicology, 1999, 8(3): 189－200.

[4] 傅澤田，祁力鈞. 國(guó)內(nèi)外農(nóng)藥使用狀況及解決農(nóng)藥超量使用問題的途徑[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，1998，14(2)：7－12. Fu Zetian, Qi Lijun. Over-use of pesticide and approaches to reduce pesticide dosage[J] Transaction of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 1998, 14(2): 7－12. (in Chinese with English abstract)

[5] Sugeng A J, Beamer P I, Lutz E A, et al. Hazard-ranking of agricultural pesticides for chronic health effects in Yuma County, Arizona.[J]. Science of the Total Environment, 2013, 463(5): 35－41.

[6] Wahid F Abdoel, Wickliffe J Wilson, M Van Sauers A, et al Presence of pesticide residues on produce cultivated in Suriname[J]. Environmental Monitoring and Assessment, 2017, 189(6), DOI: 10.1007/s10661-017-6009-0.

[7] 楊燕，何勇. 基于高光譜圖像的稻瘟病抗氧化酶值早期預(yù)測(cè)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013，29(20)：135－141. Yang Yan, He Yong. Early prediction of antioxidant enzyme value of rice blast based on hyper-spectral image[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(20): 135－141. (in Chinese with English abstract)

[8] Chan, Bin-Da, Icoz, Kutay, Huang, Wanfeng, et al. On-demand weighing of single dry biological particles over a 5-order-of-magnitude dynamic range[J]. Lab On a Chip, 2014, 14(21): 4188－4196.

[9] 李儀芳，楊冠玲，李豐果，等. 大氣PM2.5顯微圖像的處理與分析[J]. 光電工程，2005，32(11)：54－58.

Li Yifang, Yang Guanling, Li Fengguo, et al. Processing and analysis for micrograph of PM2.5 in atmosphere[J]. Opto-Electronic Engineering, 2005, 32(11): 54－58. (in Chinese with English abstract)

[10] 李小龍，馬占鴻，孫振宇，等. 基于圖像處理的小麥條銹病菌夏孢子模擬捕捉的自動(dòng)計(jì)數(shù)[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2013，29(2)：199－206.

Li Xiaolong, Ma Zhanhong, Sun Zhenyu, et al. Automatic counting for trapped urediospores ofsp. tritici based on image processing[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(2): 199－206. (in Chinese with English abstract)

[11] 齊龍，蔣郁，李澤華，等. 基于顯微圖像處理的稻瘟病菌孢子自動(dòng)檢測(cè)與計(jì)數(shù)方法[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2015，31(12)：186－193.

Qi Long, Jiang Yu, Li Zehua, et al. Automatic detection and counting method for spores of rice blast based on micro image processing[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(12): 186－193. (in Chinese with English abstract)

[12] 姜玉英，羅金燕，羅德平，等. 遠(yuǎn)程控制病菌孢子捕捉儀對(duì)小麥氣傳病害的監(jiān)測(cè)效果[J]. 植物保護(hù)，2015(6)：163－168.

Jiang Yuying, Luo Jinyan, Luo Deping, et al. Monitoring effect of remote-controlled spore trap on wheat aero-borne diseases[J]. Plant Protection, 2015(6): 163－168. (in Chinese with English abstract)

[13] Zhang Y, Yang J, Lu Y, et al. A competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay for the rapid detection of deoxynivalenol: development and application in agricultural products and feedstuff[J]. Food and Agricultural Immunology, 2017, 28(3): 516－527.

[14] Ricchi M, Bertasio C, Boniotti MB, et al. Comparison among the quantification of bacterial pathogens by qPCR, dPCR, and cultural methods[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8, DOI: 10.3389/fmicb.2017.01174.

[15] 王軍軍，謝海芬，周嘉，等. 微懸臂梁在化學(xué)及生物傳感器中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 微電子學(xué)，2004，34(5)：493－496.

Wang Junjun, Xie Haifen, Zhou Jia, et al. Development of microcantilever-based chemical and biological sensors[J]. Microelectronics, 2004, 34(5): 493－496. (in Chinese with English abstract)

[16] Yang Fan, Wang Guoping, Xu Wenxing, et al. A rapid silica spin column-based method of RNA extraction from fruit trees for RT-PCR detection of viruses[J]. Journal of Virological Mehhods, 2017, 247: 61－67.

[17] Nugaeva N, Gfeller K Y, Backmann N, et al. Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2005, 21(6): 849－856.

[18] 李鵬，李昕欣，王躍林. 用于化學(xué)氣體檢測(cè)的壓阻檢測(cè)式二氧化硅微懸臂梁傳感器[J]. 傳感技術(shù)學(xué)報(bào)，2007，20(10)：2174－2177.

Li Peng, Li Xinxin, Wang Yuelin. Piezeoresistive silicon dioxide microcantilever sensor for chemical gas detection[J]. Journal of Transduction Technology, 2007, 20(10): 2174－2177. (in Chinese with English abstract)

[19] Wang S Q, Sohrabi S, Xu J, et al. Geometry design of herringbone structures for cancer cell capture in a micro?uidic device[J]. Microfluidics and Nanofluidics, 2016, 20(11), DOI: 10.1007/s10404-016-1813-3.

[20] Lopez-Munoz, Gerardo A, Estevez M, et al. A label-free nanostructured plasmonic biosensor based on Blu-ray discs with integratedmicrofluidics for sensitive biodetection[J]. Biosensors & Bioelectronics, 2017, 96: 260－267.

[21] 楊寧，張榮標(biāo)，徐佩鋒，等. 基于微流控芯片的乳膠免疫凝集光電檢測(cè)方法[J]. 儀器儀表學(xué)報(bào)，2013，34(6)：1395－1400.

Yang Ning, Zhang Rongbiao, Xu Peifeng, et al. Latex immunoagglutination photoelectric detection method based on microfluidic chip[J]. Journal of Instrument & Instrumentation, 2013, 34(6): 1395－1400. (in Chinese with English abstract)

[22] 楊寧，李振，毛罕平，等. 基于紙基微流控芯片的農(nóng)藥殘留光電檢測(cè)方法[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2017，33(3)：294－299.

Yang Ning, Li Zhen, Mao Hanping, et al. Pesticide photoelectricdetection method based on paper microfluidic chip[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(3): 294－299. (in Chinese with English abstract)

[23] Guo Yemin, Liu Xianfu, Sun Xia, et al. A PDMS microfluidic impedance immunosensor for sensitive detection of pesticide residues in vegetable real samples[J]. International Journal of Electrochemical Science, 2015, 10(5): 4155－4164.

[24] Zhou Qianjin, Wang Lei, Chen Jiong, et al. Development and evaluation of a real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a microfluidic disc chip (on-chip LAMP) for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacteria in aquatic animals[J]. Joural of Microbiological Methods, 2014, 104: 26－35.

[25] 郭建江，張榮標(biāo)，楊寧，等. 基于磁控分離的水產(chǎn)致病菌微流控檢測(cè)方法[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2015，46(4)：277－281.

Guo Jianjiang, Zhang Rongbiao, Yang Ning, et al. Aquaculture pathogens detection based on microfluidic system with magnetic isolation[J]. Journal of Agricultural Machinery, 2015, 46(4): 277－281. (in Chinese with English abstract)

[26] Yu Xu, Xia Yiqiu, Tang Yi, et al. A Nanostructured microfluidic immunoassay platform for highly sensitive infectious pathogen detection[J]. Small, 2017, 13(24): UNSP 1700425.

[27] Kulasinghe Arutha, Thao Huynh Phuoc Tran, Blick Tony, et al. Enrichment of circulating head and neck tumour cells using spiral microfluidic technology[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 42517.

[28] Todenhoefer Tilman, Park Emily Sunyong, Duffy Simon, et al. Microfluidic enrichment of circulating tumor cells in patients with clinically localized prostate cancer[J]. Urologic Oncology Seminars & Original Investigations, 2016, 34(11): 483.e9－483.e16.

[29] Tang Man, Wen Congying, Wu Lingling, et al. A chip assisted immunomagnetic separation system for the efficient capture and in situ identification of circulating tumor cells[J]. Lab on a Chip, 2016, 16(7): 1214－1223.

[30] 鐘劍，吳超，黃銳. 微顆粒黏附力測(cè)試的空氣動(dòng)力學(xué)模型[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，43(1)：287－292.

Zhong Jian, Wu Chao, Huang Rui. Aerodynamic measurement model of micro-particle adhesion force[J]. Journal of Central South University: Natural Science Edition, 2012, 43(1): 287－292. (in Chinese with English abstract)

[31] Bin Y, Zhang M C, Dou B L, et al. Discrete particle simulation and visualized research of the gas-solid flow in an internally circulating fluidized bed[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2003, 42: 214－221.

[32] Buzzi Olivier, Yuan Shengyang, Routley Benjamin. Development and validation of a new near-infrared sensor to measure polyethylene glycol(PEG) concentration in water[J]. Sensors, 2017, 17(6), DOI: 10.3390/s17061354.

[33] Zhao Y, Lai H S, Zhang G, et al. Rapid determination of cell mass and density using digitally controlled electric field in a microfluidic chip[J]. Lab on A Chip, 2014, 14(22): 4426－4434.

[34] Zhao Y, Lai H S, Zhang G, et al. Measurement of single leukemia cell’s density and mass using optically induced electric field in a microfluidics chip[J]. Biomicrofluidics, 2015, 9(2): 022406.

Photoelectric detection method for false smut fungal spore based on enrichment microfluidic chip

Yang Ning1,2, WangPan1, ZhangRongbiao1※, Xu Peifeng1, Sun Jun1, Mao Hanping2

(1.212013,; 2.212013,)

The fungal disease of false smut is research focus, which can spread around within short time and cause much loss of rice yield. However, there hasn’t been any effective detection and prediction method. For this reason, we designed a set of sample interface, injection channel, enrichment detection area, electric pumping interface in one of the microfluidic chips. The sample interface is connected to the hose for the collection of fungal spores. The injection channel adopts the simple and gentle straight-through design with a fixed width, in order to achieve the barrier-free movement of the fungal spores in the channel, making it easy to clean the chip, and thus improving the recycle rate of the chip. The enrichment detection area is designed as a circular chamber. This design not only slows the drop rate of the spores, which therefore makes the spores arranged in the enrichment detection area efficiently, but it also matches the circular parallel light spot formed by the fiber output lens. In this way, we can reduce the interference and noise introduced by positioning the light source inaccurately and too large spot diameter. Electric suction interface accesses micro-pump pipeline, and compared to the inflatable design, the pumping design reduces the loss in the pump during the collection of spores. In order to make the fungal spores be arranged in the enrichment detection area correctly, the sample channel width was set in the experiment and the diameter of the enrichment detection area was optimized to meet the needs of fungal spore enrichment speed. The experimental results showed that the enriched detection zone had the best enrichment effect when the diameter was 2 000m. Then, a photoelectric detection system based on microfluidic chip was established in this paper. When the spore concentration of microfluidic chip was detected by photoelectric detection method, the system condition parameters mainly included light intensity and wavelength. Therefore, different concentrations of spores were tested by the spectrometer, and the results were analyzed to determine the optimal light source parameters of the detection system. The experiment was performed at the Jiangsu University Laboratory in April 2017, and the spores used in the experiment were obtained in the artificial climate room in Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry. We used the spectrometer, fiber and other structures to build the experimental platform for light intensity and wavelength optimization. According to the principle of light detection and the characteristics of light attenuation formed by different concentrations of spores in the enrichment area, the detection intensity with high sensitivity was screened. Taking the detection of the sensitivity performance of the spectrum as the target and considering the linearity, the detection wavelength was determined; the best light intensity was at 1.1×104cd and the best wavelength was 650 nm. Finally, with strawberry grey mold spores as the object, we conducted an automated microfluidic chip enrichment and photoelectric detection experiment, and established a curve of spore concentration and absorbance based on the principle of enrichment and photo-detection. The experimental results showed that the detection method we proposed had a linear correlation coefficient of 0.992 9. The method of photoelectric detection of false smut fungal disease based on microfluidic chip realizes the efficient detection of spores concentration, which provides a theoretical foundation for the development of portable false smut disease detection equipment.

diseases; sensitivity analysis; models; microfluidic chip; fungal; photoelectric detection

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.020

S124.3

A

1002-6819(2017)-20-0161-08

2017-07-14

2017-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金（61673195, 31701324）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）（蘇政辦發(fā)[2011]6號(hào)）；中國(guó)博士后特別資助項(xiàng)目(2015T80512)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK20140550）

楊 寧，河南人，講師，博士，主要從事微傳感與自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)。212013。Email：yangn@ ujs.edu.cn

※通信作者：張榮標(biāo)，江蘇人，教授，博士，主要從事計(jì)算機(jī)智能檢測(cè)技術(shù)、信號(hào)信息處理、無線傳感網(wǎng)絡(luò)。Email：zrb@ujs.edu.cn

楊 寧，王 盼，張榮標(biāo)，徐佩鋒，孫 俊，毛罕平. 基于富集微流控芯片的稻曲病菌孢子光電檢測(cè)方法[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2017，33(20)：161－168. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.020 http://www.tcsae.org

Yang Ning, Wang Pan, Zhang Rongbiao, Xu Peifeng, Sun Jun, Mao Hanping. Photoelectric detection method for false smut fungal spore based on enrichment microfluidic chip[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2017, 33(20): 161－168. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2017.20.020 http://www.tcsae.org