藍靛果鞣花酸超聲波輔助提取工藝的研究

王佳寧，馬永強，王 鑫，劉曉飛，2，張 宇

藍靛果鞣花酸超聲波輔助提取工藝的研究

王佳寧1，*馬永強1，王 鑫1，劉曉飛1，2，張 宇1

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150076；2.黑龍江省農業(yè)科學院食品加工研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

以黑龍江省勃利縣的藍靛果作為材料，采取超聲波輔助的方法提取藍靛果中的鞣花酸，并以鞣花酸得率為指標，通過單因素試驗和響應曲面法優(yōu)化最佳提取工藝，確定了最佳的鞣花酸提取條件。結果表明，藍靛果中的鞣花酸的最優(yōu)提取條件為料液比1∶33（g∶mL），提取溫度51℃，提取時間78 min，此時鞣花酸提取率為18.31%。

藍靛果；鞣花酸；超聲波輔助法；響應曲面法

藍靛果（Lonicera caerulea L.），屬藍靛果忍冬的變種。橢圓形漿果味道，酸甜可口、營養(yǎng)豐富，具有較高的藥用價值和保健功能，有著較大的開發(fā)潛力和廣闊的發(fā)展空間[1-2]。如今，藍靛果在國外主要分布于俄羅斯、日本及朝鮮北部等地區(qū)，國內則主要分布在東北、華北和西北等地，大、小興安嶺和長白山地區(qū)的野生資源貯量最大[3]，常生于高山林下、河岸或者沼澤灌木。

藍靛果中富含多種氨基酸、礦物質和維生素等物質，是一種營養(yǎng)價值非常高的漿果，并且其果實中還富含多種生物活性物質，如酚酸類物質、黃酮類物質及花色苷類物質等[4]，具有抗氧化功能，可抗腫瘤、抗衰老、預防心血管疾病、神經性等多種慢性疾病[5-7]，具有較高的醫(yī)用價值；還可以起到提高免疫力和調節(jié)血脂等作用，具有極高的藥用價值，這與其含有特定的多酚類化合物有關。

鞣花酸（Ellagic acid）是一種普遍存在于復雜的自然界的酚類物質，在很多果實組織中都能找到，是一種天然的多酚二內酯。它又被稱為六羥基聯(lián)苯二酸二內酯，是一種沒食子酸的二聚衍生物。鞣花酸具有的抗氧化和抗癌等活性，可廣泛應用于食品、藥品、醫(yī)藥等多個領域。另外，還具有凝血、抗細菌和抗病毒等作用，對人體免疫缺陷病毒也有一定的抑制作用，可抗癌變、抗誘變、抗突變[8]。

目前，鞣花酸常用的提取方法主要有3種，即溶劑浸提法、微波輔助法和超聲波輔助法。其中，溶劑浸提法存在提取率低、提取時間長等問題；微波輔助法可提高提取效率，但其熱效應對熱不穩(wěn)定的物質具有破壞作用，從而適得其反，使其提取率降低；超聲波輔助提取技術是一項現(xiàn)代高新技術手段，目前多用于天然產物的提取，與傳統(tǒng)提取法相比具有提取時間短、工作效率高等特點，并且可有效降低溫度對熱不穩(wěn)定物質的影響，這與微波輔助法相比，不僅可以提高產物的品質和產量[9-13]，還有較廣的應用范圍。

基于上述，試驗選用黑龍江省勃利縣的藍靛果作為原料，通過超聲波輔助提取方法對其中的鞣花酸進行提取，通過單因素試驗和響應曲面試驗選取最優(yōu)方案進行工藝優(yōu)化研究，確定最佳的提取工藝條件，旨在完善提取方法、提高提取效率，也為藍靛果中鞣花酸的開發(fā)和深加工及相關產品開發(fā)提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍靛果，產自黑龍江省勃利縣。

鞣花酸標準品、無水乙醇、鹽酸、丙酮、蒸餾水等。

1.2 儀器與設備

FW177型中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產品；FA1104B型電子天平，上海越平科學儀器有限公司產品；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；722型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司產品；TDL80-2B型高速離心機，上海安亭科學儀器廠制造產品。

1.3 材料的預處理

取速凍藍靛果鮮果，將其平鋪于干燥盤中，置于恒溫干燥箱中于30℃下干燥24 h，使其失去大部分水分，調高溫度至40℃，藍靛果含水量達到8%，用中草藥粉碎機打碎，備用。

1.4 標準曲線的繪制

1.4.1 對照溶液

準確稱取0.010 0 g鞣花酸標準品，在攪動下，緩慢滴加4 mL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液，待鞣花酸溶解后，用去離子水稀釋，定容至100 mL作為標準溶液，待用。

1.4.2 標準溶液的光譜特性

準確吸取1.4.1中的標準溶液10 mL，加水稀釋至200 mL，用紫外分光光度計在室溫下測定吸光度（蒸餾水作參比）。

1.4.3 標準曲線

分別吸取1.4.1中的標準溶液1，5，10，15，20 mL于200 mL容量瓶中，加水稀釋，定容至刻度線，配成質量濃度為 0.5，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL對照品稀釋液，并于波長357 nm處測定吸光度值，重復測定3次，取其平均值。以鞣花酸的質量濃度（ρ）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5 鞣花酸得率的測定

利用如下公式計算鞣花酸得率（P）：

式中：m——提取的鞣花酸總質量，mg；

M——樣品總質量，mg。

1.6 不同溶劑對鞣花酸提取率的影響

分別稱量3份1.3中經預處理后的樣品粉末1.00 g，并分別置于3個燒杯中。在溫度60℃，超聲波功率300 W條件下，料液比1∶30（g∶mL） 分別加入等體積的乙醇、丙酮和鹽酸，提取50 min，并在轉速4 000 r/min條件下離心10 min；減壓抽濾，獲得澄清液體，分別量取提取液0.5 mL，置于各個比色管中，加入25 mL丙酮，搖勻，測定其吸光度（357 nm），計算鞣花酸總質量并進行比較。

1.7 超聲波輔助法提取鞣花酸工藝研究

根據1.6中的試驗結果和相關文獻，明確后續(xù)試驗的提取溶劑為體積分數(shù)為80%的丙酮-水溶液。并進一步研究提取溫度、超聲波作用時間、料液比對超聲波輔助提取藍靛果中鞣花酸得率的影響，調節(jié)提取溫度為40，50，60，70，80℃；超聲時間為20，30，40，50，60 min；料液比為 1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）。測定其吸光度（357 nm），并計算藍靛果中鞣花酸得率。

1.8 響應曲面試驗

在上述試驗的基礎上，以80%的丙酮-水溶液為提取溶劑，選取料液比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）3個因素為自變量，以藍靛果中鞣花酸得率為響應值（Y），根據試驗設計方法進行響應面分析試驗，并通過Design Expert 8.06軟件對試驗數(shù)據進行分析，得出藍靛果中鞣花酸提取的最優(yōu)方案。

響應面分析因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平設計

2 結果與分析

2.1 標準曲線

鞣花酸標準曲線見圖1。

圖1 鞣花酸標準曲線

此標準曲線的線性回歸方程為：

Y=0.054 5X-0.000 9，R2=0.997.

證明該曲線線性關系良好，在鞣花酸含量為0～12 μg時呈線性關系，可用于計算鞣花酸的含量。

2.2 不同試劑對藍靛果鞣花酸提取率的影響

不同試劑對藍靛果鞣花酸提取率的影響見圖2。

圖2 不同試劑對藍靛果鞣花酸提取率的影響

由圖2可知，不同試劑對藍靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05）影響。由試驗結果可看出丙酮提取鞣花酸的提取率較高，用超聲提取法測得的鞣花酸提取率為16.32%，鹽酸的提取效果較弱，為10.31%。通過比較3種提取劑對于藍靛果中鞣花酸的提取率，即丙酮對于鞣花酸的提取效果最佳。而且相對于其他的溶劑而言，丙酮最不易與水解鞣質反應。因此選擇丙酮作為溶劑對鞣花酸進行提取[14]。

2.3 超聲輔助法單因素試驗

2.3.1 料液比對藍靛果提取率影響的結果

料液比對藍靛果鞣花酸提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對藍靛果鞣花酸提取率的影響

由圖3可知，料液比對藍靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05） 影響。料液比在1∶20～1∶40，鞣花酸提取率呈上升趨勢，因為溶劑較多，可增加與物料的表面積接觸，加快了目標物質的溶出。在料液比1∶40之后，鞣花酸提取率呈下降趨勢，由于料液比的增加會溶解出更多的其他物質，這不僅浪費有機試劑還引入了雜質[15]。綜合經濟成本及后續(xù)進行的濃縮處理等因素的考慮，故可確定料液比單因素的最佳條件為1∶40。因此，選擇料液比1∶30～1∶50，進行后續(xù)響應面優(yōu)化試驗。魏征等人[16]的研究結果表明，當料液比為1∶30時，利用超聲波提取圓葉葡萄中鞣花酸和總酚的效果最好，此結論與試驗結果相近。

圖4 超聲波提取溫度對鞣花酸提取率的影響

2.3.2 超聲波提取溫度對藍靛果鞣花酸提取率的影響超聲波提取溫度對鞣花酸提取率的影響見圖4。由圖4可知，超聲波提取溫度對藍靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05）影響。鞣花酸提取率隨著超聲波提取溫度的升高而增加，較高的溫度可以加快藍靛果中鞣花酸的溶出速率，有利于鞣花酸的浸透、溶解[17]，鞣花酸提取率在50℃時達到峰值10.63%。繼續(xù)加熱后提取效果反而下降，這可能是藍靛果中的鞣花酸的對熱不穩(wěn)定性，當提取溫度過高時，鞣花酸的分子結構被破壞，導致其損失，使得提取率有所降低[19]。鄧小莉等人[18]對石榴皮鞣花酸得率研究的結果顯示，在超聲波功率200 W，提取時間30 min的條件下，最適的提取溫度60℃，這與試驗趨勢整體相同，結果接近。

2.3.3 提取時間對藍靛果鞣花酸提取率的影響結果

提取時間對鞣花酸提取率的影響見圖5。

圖5 提取時間對鞣花酸提取率的影響

由圖5可知，提取時間對藍靛果中鞣花酸提取率具有顯著（p＜0.05） 影響。當提取時間為20 min時，藍靛果中鞣花酸提取率較低，這是因為提取時間較短時，鞣花酸與丙酮水溶液接觸不夠充分。當提取時間增加，藍靛果中的鞣花酸提取率隨之增加，并在50 min時提取率達到最大（11.00%）。隨后，鞣花酸提取率隨提取時間的增加而下降，可能此時的藍靛果鞣花酸因較長時間暴露在空氣中，部分已氧化分解，使其得率下降。

2.4 超聲波輔助提取鞣花酸的響應面優(yōu)化試驗結果

2.4.1 響應模型的建立與分析

響應面分析方案及結果見表2。

響應曲面分析法是一種統(tǒng)計學試驗設計，是從含有多個影響因素及其交互作用的系統(tǒng)中，尋找最佳方案的統(tǒng)計方法，最常被使用的是Box-Behnken設計[20]。 利用Design Expert 8.06軟件對表2試驗數(shù)據結果進行二次多項式回歸擬合分析，得到藍靛果中鞣花酸提取率（Y） 對編碼自變量A，B，C的回歸模型方程為：

表2 響應面分析方案及結果

Y=15.76+1.09A+0.89B+0.72C-0.80AB+1.36AC-0.77BC-2.29A2-0.79B20.28C2.

回歸方程方差分析見表3。

由表3可知，回歸模型具有極高顯著性（p＜0.000 1），并且失擬項p=0.972 7＞0.05不顯著。該方程的校正決定系數(shù)（R2Adj）為0.907 4，R2=0.959 5，表明該模型的擬合度較好，試驗誤差小。因此，該模型能夠反映響應值鞣花酸提取率（Y）的變化，可利用該回歸模型方程對超聲波輔助提取藍靛果中鞣花酸的工藝條件進行預測和分析。結合表3中的p值可知，二次項A2對鞣花酸提取率有顯著影響（p＜0.05）；C、AC和B2的p值均小于0.01，故它們對鞣花酸提取率有非常顯著的影響，其他因素影響不顯著。根據F值進一步可知，各個因素對超聲波輔助提取藍靛果中的鞣花酸提取率影響順序為提取時間（C） ＞提取溫度（B） ＞料液比（A）。

表3 回歸方程方差分析

2.4.2 響應面優(yōu)化

各因素交互作用對鞣花酸提取率影響的響應面和等高線見圖6。

圖6 各因素交互作用對鞣花酸提取率影響的響應面和等高線

由圖6可知，變化的響應曲面和疏密程度不同的等高線可以直觀地反映超聲波輔助提取試驗中的料液比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C） 之間交互作用對藍靛果中鞣花酸提取率的影響，若等高線呈近似正圓形時，則表示兩兩因素交互作用不顯著；若呈橢圓形或馬鞍形時，則表示兩兩因素交互作用顯著[21-22]。

結合以上響應曲面的分析結果，使用Design Expert 8進行最優(yōu)條件選擇，確定最佳藍靛果中鞣花酸提取工藝參數(shù)如下：料液比1∶33.8，提取溫度51.1℃，提取時間53.7min，鞣花酸提取率的預測值為18.532 9%。為檢查考證試驗設計所得結果的可靠性，采取上述工藝參數(shù)進3次重復性試驗，根據實際操作的情況，對最佳提取工藝參數(shù)進行以下調整：料液比1∶33，提取溫度51℃，提取時間54 min。在此條件下，3次測得的藍靛果中鞣花酸提取率均值為18.31%，與預測值差異不顯著，說明建立的回歸方程能真實準確地反映上述3個因素對鞣花酸提取率的影響，證明該工藝條件可行。

3 結論

超聲波輔助法提取藍靛果中的鞣花酸具有更加節(jié)省時間、節(jié)約能源、生產成本低等優(yōu)點。通過單因素考查及Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗設計，得到藍靛果中的鞣花酸最優(yōu)提取工藝為料液比1∶33（g/mL），提取溫度51℃，提取時間54 min，在此條件下對藍靛果中的鞣花酸進行提取，最終提取率為18.31%。

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Study on Ultrasonic-assisted Extraction of Ellagic Acidfrom Lonicera edulis

WANG Jia'ning1，*MA Yongqiang1，WANG Xin1，LIU Xiaofei1，2，ZHANG Yu1
（1.College of Food Engineering Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang 150076，China；2.Food Processing Institute，Helongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086，China）

Selected from Heilongjiang Province Boli County of Lonicera edulis as a material.The optimum extraction process was optimized by single factor experiment and response surface method，and the optimum extraction conditions of ellagic acid were determined by ultrasonic assisted method.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the ratio of material to liquid 1∶33（g∶mL），the extraction temperature 51 ℃ and the extraction time 78 min.The yield of ellagic acid was 18.31%.

lonicera caerulea L.；ellagic acid；ultrasonic-assisted method；response surface methodology

TQ914.1

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.040

1671-9646（2017） 10b-0038-05

2017-08-25

黑龍江省應用技術研究與開發(fā)設計項目（GC13B204）。

王佳寧（1993— ），女，碩士，研究方向為食品科學。

*通訊作者：馬永強（1963— ），男，碩士，教授，博士生導師，研究方向為天然產物。