長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1在胃癌患者中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響

申 彤 司君利 崔京遠(yuǎn) 亓玉琴 呂 梅

青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)一科1(266011) 急診科2 普外科3

長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1在胃癌患者中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響

申 彤1*司君利2崔京遠(yuǎn)3亓玉琴1#呂 梅1

青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院消化內(nèi)一科1(266011)急診科2普外科3

胃腫瘤； 長(zhǎng)鏈非編碼RNA； TUG1； p27； 細(xì)胞周期蛋白D1

胃癌是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一[1]，死亡率居所有癌癥的第二位[2]，大多數(shù)中晚期胃癌患者術(shù)后死于腫瘤復(fù)發(fā)[3]。因此，尋找一種較為有效的基因靶點(diǎn)從而早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷胃癌已成為目前臨床研究的重點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA可起癌基因或抑癌基因的作用，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，參與不同類(lèi)型腫瘤如乳腺癌的發(fā)生[4]。新近研究顯示，?；撬嵘险{(diào)基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)在膀胱腫瘤、非小細(xì)胞肺癌[5-6]等的發(fā)展中起重要調(diào)控作用，但其在胃癌中的臨床意義和生物學(xué)功能尚不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織及其相應(yīng)正常組織中TUG1、p27和cyclin D1的表達(dá)，旨在探討TUG1在胃癌中的作用并分析其對(duì)胃癌預(yù)后的影響，從而探討TUG1是否可作為胃癌較為敏感的分子學(xué)標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)，以期為判斷胃癌患者預(yù)后提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

收集2013年6月—2013年12月青島市市立醫(yī)院普外科行胃部手術(shù)的胃癌患者共48例，診斷均經(jīng)病理檢查確診，其中男28例，女20例，平均年齡(60.0±9.2)歲。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)全身化療、局部放療或其他抗腫瘤治療。取患者腫瘤組織及其相應(yīng)遠(yuǎn)端正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm處)，-80 ℃冰箱保存。參照2000年世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的分化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期，對(duì)胃癌的分化程度和分期進(jìn)行評(píng)估。本研究方案由青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，入選者或其家屬均取得知情同意。對(duì)48例胃癌患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪時(shí)間從術(shù)后開(kāi)始截至2016年12月31日。

二、主要試劑

cDNA合成試劑盒、2×Taq PCR MasterMix試劑盒、2×SYBR Green Mix(With ROX)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)Biomiga公司。GAPDH抗體、p27抗體、cyclin D1抗體均購(gòu)于美國(guó)AbSci公司。羊抗兔IgG購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

三、研究方法

1.qRT-PCR法：取100 mg凍存組織，Trizol抽提試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。TUG1引物上游：5’-TAG CAG TTC CCC AAT CCT TG-3’，下游：5’-CAC AAA TTC CCA TCA TTC CC-3’；以GAPDH作為內(nèi)參，引物上游：5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG ATT-3’，下游：5’-CGC TCC TGG AAG ATG GTG AT-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，并檢測(cè)其熔解曲線。采用2-ΔΔCt法計(jì)算樣品中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.蛋白質(zhì)印跡法：RIPA裂解液裂解組織，勻漿，保留上清液，獲得組織蛋白提取物，BCA法定量蛋白濃度。取70 μg蛋白樣品，行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4 ℃過(guò)夜。加入p27兔多克隆抗體(工作濃度1∶200)、cyclin D1兔多克隆抗體(工作濃度1∶200)和GAPDH兔多克隆抗體(工作濃度1∶1 000)孵育3 h；TBST洗滌3次后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(工作濃度1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌3次?；瘜W(xué)發(fā)光顯影并觀察結(jié)果。使用Quantity One圖像分析軟件，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、TUG1表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中TUG1 mRNA表達(dá)顯著高于相應(yīng)正常組織(6.18±0.19對(duì)5.09±0.16)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

根據(jù)TUG1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)，將48例胃癌患者分為T(mén)UG1高表達(dá)組(n=35)和TUG1低表達(dá)組(n=13)，發(fā)現(xiàn)TUG1表達(dá)與性別、年齡和腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)(表1)。

表1 胃癌組織中TUG1表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

二、p27、cyclin D1蛋白表達(dá)及其相關(guān)性

蛋白質(zhì)印跡法顯示，胃癌組織中p27蛋白表達(dá)明顯低于正常組織，cyclin D1蛋白表達(dá)明顯高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

Pearson相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中p27蛋白表達(dá)與cyclin D1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.897，P<0.01)。

三、TUG1表達(dá)與p27、cyclin D1表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，胃癌組織中TUG1表達(dá)與p27表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730，P<0.01)，而與cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(r= 0.809，P<0.01)。

組別例數(shù)p27cyclinD1胃癌組織480．1709±0．02120．3417±0．0271正常組織480．3087±0．02520．2417±0．0173

四、TUG1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier分析顯示，TUG1低表達(dá)組和高表達(dá)組的中位生存時(shí)間分別為34個(gè)月和23個(gè)月，TUG1高表達(dá)的胃癌患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖1)。

圖1 TUG1表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系(Kaplan-Meier法)

討 論

在人類(lèi)基因組中，超過(guò)98%的基因不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[7]，但可被轉(zhuǎn)錄，生成非編碼RNA。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子的總稱(chēng)，因其無(wú)法編碼蛋白質(zhì)[8]，長(zhǎng)期被認(rèn)為是基因組學(xué)的“噪音”[9]。近年發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA因在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多層面調(diào)控基因表達(dá)[10]而獲得了越來(lái)越多的關(guān)注，其不但與個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)，還對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起至關(guān)重要的作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1位于人染色體 22q12.2，長(zhǎng)約7.1 kb，廣泛存在于人體各種器官和細(xì)胞中，是視網(wǎng)膜和神經(jīng)組織增殖必需的調(diào)控基因[11]。大量文獻(xiàn)[5-6]顯示，TUG1對(duì)膀胱腫瘤、非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生起關(guān)鍵作用，但其在胃癌中的相關(guān)研究甚少。抑癌基因p27位于人染色體12p13，其表達(dá)產(chǎn)物p27蛋白是一種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑(CDKI)，通過(guò)抑制cyclin-CDKs的活性，阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而阻礙腫瘤的發(fā)生[12]。cyclin D1為一種重要的細(xì)胞周期正調(diào)控因子，其表達(dá)上調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期失衡從而發(fā)生惡性增殖[13]。有研究[14]表明，多梳蛋白抑制復(fù)合體2(PRC2)中EZH2可催化H3K27甲基化，進(jìn)而抑制抑癌基因的表達(dá)。而Huang等[15]的研究表明在肝細(xì)胞癌中，TUG1能與PRC2復(fù)合物的EZH2、SUZ12結(jié)合并集中至抑癌因子KLF2啟動(dòng)子區(qū)，從而促進(jìn)肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。關(guān)于在胃癌組織中，TUG1是否通過(guò)PRC2途徑抑制p27蛋白表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示在胃癌組織中TUG1表達(dá)明顯高于相應(yīng)正常組織，表明TUG1可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步分析TUG1表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)與胃癌患者的性別、年齡和腫瘤大小無(wú)關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)，表明TUG1可能與胃癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，胃癌組織TUG1表達(dá)與p27表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而與cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)，提示TUG1可能通過(guò)抑制p27表達(dá)、促進(jìn)cyclin D1表達(dá)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)，TUG1高表達(dá)的胃癌患者生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)者，表明檢測(cè)TUG1表達(dá)可作為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，本研究通過(guò)檢測(cè)胃癌組織中TUG1、p27、cyclin D1的表達(dá)并分析其與胃癌臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系，表明TUG1可能通過(guò)p27/cyclin D1途徑誘導(dǎo)胃癌的發(fā)生，且高表達(dá)TUG1可能促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響患者預(yù)后。因此，TUG1有望作為一個(gè)潛在的胃癌分子標(biāo)記物，為判斷胃癌患者預(yù)后提供重要的理論依據(jù)。

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(2017-05-30收稿；2017-07-25修回)

ExpressionofLongNon-codingRNATUG1anditsEffectonPrognosisofPatientsWithGastricCancer

SHENTong1,SIJunli2,CUIJingyuan3,QIYuqin1,LüMei1.

1DepartmentofGastroenterologyⅠ,2DepartmentofEmergency,3DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedQingdaoMunicipalHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,ShandongProvince(266011)

QI Yuqin,Email:17863939736@163.com

Stomach Neoplasms; Long Non-Coding RNA; TUG1; p27; Cyclin D1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.003

*Email:448037357@qq.com

#本文通信作者，Email:17863939736@163.com

背景：近年胃癌的發(fā)生率呈逐步上升的趨勢(shì)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA牛磺酸上調(diào)基因1(TUG1)對(duì)胃癌的發(fā)生、發(fā)展可能起有一定的作用。目的研究TUG1在胃癌組織中的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響，并進(jìn)一步探討TUG1與p27蛋白、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)的相關(guān)性。方法收集2013年6月—2013年12月青島市市立醫(yī)院48例手術(shù)切除的胃癌組織及其相應(yīng)遠(yuǎn)端正常組織，采用qRT-PCR法檢測(cè)TUG1 mRNA表達(dá)，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)p27、cyclin D1蛋白表達(dá)，并分析其與TUG1表達(dá)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法分析TUG1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中TUG1 mRNA表達(dá)顯著高于相應(yīng)正常組織(6.18±0.19對(duì)5.09±0.16，P<0.05)，且其表達(dá)與性別、年齡、腫瘤大小無(wú)關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度和TNM分期有關(guān)(P<0.01)。胃癌組織中p27蛋白表達(dá)顯著低于正常組織(0.170 9±0.021 2對(duì)0.308 7±0.025 2，P<0.01)，cyclin D1蛋白表達(dá)顯著升高(0.341 7±0.027 1對(duì)0.241 7±0.017 3，P<0.01)，且p27蛋白表達(dá)與cyclin D1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.897，P<0.01)。胃癌組織中TUG1表達(dá)與p27表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.730，P<0.01)，與cyclin D1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.809，P<0.01)。TUG1高表達(dá)的胃癌患者生存時(shí)間明顯低于TUG1低表達(dá)者(P<0.05)。結(jié)論長(zhǎng)鏈非編碼RNA TUG1可能通過(guò)p27/cyclin D1途徑在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起癌基因的作用，通過(guò)檢測(cè)TUG1表達(dá)對(duì)判斷胃癌患者預(yù)后具有潛在的價(jià)值。

Background:The incidence of gastric cancer is gradually rising in recent years,long non-coding RNA taurine up-regulated gene 1 (TUG1) may have certain effects on the occurrence and progression of gastric cancer.AimsTo study the expression TUG1 in gastric cancer tissue and its effect on prognosis of patients with gastric cancer,and study the correlation between TUG1 and p27,cyclin D1.MethodsSurgically resected gastric cancer tissues and corresponding distal normal tissues of 48 gastric cancer patients from June 2013 to December 2013 at Qingdao Municipal Hospital were collected.qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of TUG1,and its relationship with clinicopathological features was analyzed.Protein expressions of p27 and cyclin D1 were determined by Western blotting,and correlation with expression of TUG1 was analyzed.Kaplan-Meier was used to analyze the relationship between expression of TUG1 and prognosis.ResultsThe mRNA expression of TUG1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in corresponding normal tissues (6.18±0.19vs.5.09±0.16,P<0.05),and was not correlated with gender,age,tumor size,but correlated with lymph node metastasis,tumor differentiation and TNM staging (P<0.01).The protein expression of p27 was significantly decreased in gastric cancer tissues than in normal tissues (0.170 9±0.021 2vs.0.308 7±0.025 2,P<0.01),while protein expression of cyclin D1 was significantly increased (0.341 7±0.027 1vs.0.241 7±0.017 3,P<0.01),and the expression of p27 was negatively correlated with expression of cyclin D1 in gastric cancer tissues (r=-0.897,P<0.01).The expression of TUG1 was negatively correlated with expression of p27 (r=-0.730,P<0.01),and was positively correlated with expression of cyclin D1 (r=0.809,P<0.01) in gastric cancer tissues.The median survival time was shorter in gastric cancer patients with high-expressed TUG1 than in patients with low-expressed TUG1 (P<0.05).ConclusionsLong non-coding RNA TUG1 plays a role of cancer gene in the development of gastric cancer through p27/cyclin D1 pathway.Detection of expression of TUG1 has important significance on the prediction of prognosis of gastric cancer patients.