基于轉(zhuǎn)錄組分析蘋果水楊酸特異響應(yīng)基因MdWRKY40的啟動(dòng)子鑒定

邱化榮，周茜茜，何曉文，張宗營(yíng)，張世忠，陳學(xué)森，吳樹(shù)敬

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基于轉(zhuǎn)錄組分析蘋果水楊酸特異響應(yīng)基因的啟動(dòng)子鑒定

邱化榮，周茜茜，何曉文，張宗營(yíng)，張世忠，陳學(xué)森，吳樹(shù)敬

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

探明水楊酸（SA）對(duì)蘋果葉片基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，鑒定SA信號(hào)途徑及其調(diào)控基因，為研究SA介導(dǎo)的抗病分子機(jī)制提供理論依據(jù)。生長(zhǎng)30 d的‘嘎啦’組培苗葉片用2 mmol?L-1水楊酸（SA）處理12 h，以CTRL（0.2%乙醇）處理作為對(duì)照，利用Illumina HiSeqTM 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)綜合的生物信息學(xué)分析（差異基因篩選、條件特異性分析、GO分類及KEGG富集分析等）篩選SA信號(hào)途徑的調(diào)控基因?？寺∈躍A特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動(dòng)子，利用蘋果細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，進(jìn)行啟動(dòng)子活性鑒定，確定對(duì)SA進(jìn)行特異性響應(yīng)的核苷酸序列。CTRL和SA處理分別獲得750 439 459 bp和751 596 153 bp的原始數(shù)據(jù)，分別有44.77%和43.88%與‘金冠’蘋果基因組完全匹配。獲得3 329個(gè)顯著性差異基因，包括苯丙烷類、類黃酮等次生代謝物生物合成途徑的相關(guān)基因（如木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶CAD、細(xì)胞色素P450、真菌抗性相關(guān)的β-1,3-葡聚糖酶等），調(diào)控植物病原菌互作途徑重要功能基因（鈣調(diào)蛋白CaM、抗病蛋白R(shí)PM1、熱激蛋白HSP90、WRKY轉(zhuǎn)錄因子等）以及33個(gè)條件特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因（NAC轉(zhuǎn)錄因子、NIMIN1、WRKY40、ERF轉(zhuǎn)錄因子等）。其中1 085個(gè)基因上調(diào)，2 244個(gè)基因下調(diào)。差異基因主要涉及細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和基因綁定、催化活性等；根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果，將SA響應(yīng)基因的啟動(dòng)子序列克隆到含有熒光素酶基因的表達(dá)載體中，置于熒光素酶基因的上游，轉(zhuǎn)化蘋果原生質(zhì)體細(xì)胞。SA處理的原生質(zhì)體細(xì)胞，熒光素酶的活性為未經(jīng)SA處理的20.6倍，而脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）對(duì)熒光素酶的活性沒(méi)有影響，說(shuō)明該啟動(dòng)子為蘋果中對(duì)SA進(jìn)行特異性響應(yīng)的啟動(dòng)子序列。不同區(qū)段的啟動(dòng)子片段對(duì)SA響應(yīng)能力不同，從翻譯起始位點(diǎn)ATG向上游500—1 000 bp只能響應(yīng)高濃度SA，而對(duì)低濃度SA不具有響應(yīng)能力，1 500 bp片段對(duì)高濃度SA響應(yīng)能力進(jìn)一步顯著增強(qiáng)，對(duì)低濃度SA響應(yīng)也有微弱提高；而長(zhǎng)度為2 000 bp的核苷酸片段無(wú)論對(duì)高濃度SA還是對(duì)低濃度SA都具有顯著響應(yīng)能力，且達(dá)到最強(qiáng)。與2 000 bp片段相比，2 500 bp的核苷酸片段沒(méi)有進(jìn)一步增強(qiáng)啟動(dòng)子片段對(duì)SA的響應(yīng)能力。超表達(dá)MdWRKY40蛋白對(duì)其自身的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。2 mmol·L-1SA處理所影響的基因主要參與了苯丙烷類、類黃酮的生物合成，植物病原菌互作及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。位于開(kāi)放閱讀框上游的2 500 bp核苷酸序列，為對(duì)SA進(jìn)行特異性響應(yīng)的核苷酸啟動(dòng)子序列。在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有顯著提高啟動(dòng)子對(duì)SA敏感性的未知核苷酸序列，另外，轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在反饋抑制機(jī)制。

SA；蘋果；轉(zhuǎn)錄組；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；植物病原菌互作

0 引言

【研究意義】蘋果是世界上栽培最廣泛的水果之一，因其味道鮮美，且富含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，深受人們喜愛(ài)。作為多年生木本植物，其產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)易受生物和非生物脅迫的影響，特別是病原菌侵害，給蘋果產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。水楊酸（salicylic acid，SA）作為一種植物激素，不僅能夠調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過(guò)程，而且在生物和非生物脅迫反應(yīng)中起到積極的調(diào)控作用[2]。研究表明SA在鼠李糖脂誘導(dǎo)的植物抗性反應(yīng)中處于中心位置，Sanchez等[3]通過(guò)對(duì)細(xì)菌中鼠李糖脂誘導(dǎo)的植物對(duì)活體營(yíng)養(yǎng)型病菌、腐生營(yíng)養(yǎng)型病菌及兼性寄生菌pv.的抗性研究發(fā)現(xiàn)，SA參與了這3種病菌的抗性，而乙烯僅僅參與了和pv.的抗性反應(yīng)，茉莉酸僅參與了對(duì)的抗性。外源SA處理能夠增強(qiáng)蘋果葉片對(duì)炭疽病的抗性[4]，在富士蘋果中過(guò)表達(dá)SA信號(hào)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子能夠提高對(duì)白粉病的抗性[5]。外源SA處理能夠誘導(dǎo)辣椒的抗疫病[6]，以及水稻幼苗對(duì)白葉枯病的抗性[7]。除此之外，SA還能夠提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性，如SA能夠誘導(dǎo)黃瓜中冷害響應(yīng)基因的表達(dá)，并減弱冷害脅迫對(duì)黃瓜的傷害，增強(qiáng)植物對(duì)冷害的抗性[8]。SA信號(hào)途徑對(duì)植物抗病抗逆性調(diào)控具有重要作用。雖然根據(jù)前人的研究結(jié)果，顯示SA在植物的抗病抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有舉足輕重的作用，但是，在蘋果這種多年生的高等植物中，SA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一直不清楚。利用RNA-seq探究SA對(duì)蘋果葉片轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，對(duì)解析SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】盡管SA在模式植物擬南芥中取得了很大的進(jìn)展，但在蘋果中，SA如何進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，依然知之甚少，蘋果SA 信號(hào)通路目前尚不明確。張計(jì)育等[9]構(gòu)建了SA處理湖北海棠的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并克隆了與病菌抗性相關(guān)的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因全長(zhǎng)。不同濃度SA處理對(duì)表達(dá)產(chǎn)生不同影響，高濃度SA促進(jìn)蘋果葉片中的表達(dá)，低濃度SA則抑制其表達(dá)[10]。外源SA提高了蘋果葉片中過(guò)氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）及苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性并誘導(dǎo)和的上調(diào)表達(dá)[11]。羅昌國(guó)等[12]克隆了調(diào)控富士蘋果白粉病抗性的關(guān)鍵基因，該基因表達(dá)受SA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。SA通過(guò)與靶蛋白互作發(fā)揮其功能，目前其調(diào)控途徑的靶蛋白在很大程度上還未知[13]。SA信號(hào)通路主要圍繞、轉(zhuǎn)錄因子（TGACA元件綁定因子）及病程相關(guān)蛋白基因等進(jìn)行研究。只在SA誘導(dǎo)條件下表達(dá)，是調(diào)控SA介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性（SAR）的關(guān)鍵基因。擬南芥突變體無(wú)法誘導(dǎo)的表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)病原菌的感病性[14]。研究表明TGA1-TGA7均可與NPR1互作，調(diào)控SA響應(yīng)基因[15-16]。NPR1增強(qiáng)TGA轉(zhuǎn)錄因子與防衛(wèi)基因啟動(dòng)子as-1元件的結(jié)合[17]。目前SA誘導(dǎo)植物抗病性研究主要利用不同植物和病原菌的互作。例如外源SA誘導(dǎo)顯著減弱了番茄維管束褐變及葉片黃萎現(xiàn)象，增強(qiáng)對(duì)鐮刀菌的抗性[18]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蘋果SA信號(hào)途徑研究較少，其信號(hào)通路和分子機(jī)制有待明確。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】RNA-seq是利用高通量測(cè)序研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的方法，本研究以SA處理的蘋果葉片為研究試材，采用RNA-seq的研究方法，以獲得在蘋果中響應(yīng)水楊酸的基因，構(gòu)建能夠?qū)A進(jìn)行特異性響應(yīng)的啟動(dòng)子鑒定體系，為深入研究SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試材料為‘嘎啦’組培苗葉片，組培苗于24℃，12 h/12 h光暗環(huán)境下培養(yǎng)30 d，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片、將其浸入2 mmol?L-1SA溶液中，24℃下處理12 h，濾紙吸干表面水分，液氮迅速冷凍，-80℃保存，以備RNA提??；以0.2%乙醇水溶液處理的葉片為對(duì)照。重復(fù)3次。

1.2 RNA提取及測(cè)序

利用天根公司的植物總RNA提取試劑盒（DP424）提取RNA（操作步驟見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。檢測(cè)合格后，經(jīng)DNase I處理，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，高溫條件下加入適量打斷試劑使其片斷化，再以片段mRNA為模板合成cDNA，經(jīng)過(guò)磁珠純化、末端修復(fù)、3′末端加堿基A、加測(cè)序接頭后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，完成文庫(kù)制備。Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlusRealTime PCR System進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量和產(chǎn)量檢測(cè)。測(cè)序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識(shí)別分析后得到原始測(cè)序序列，去除含接頭、含N比例大于10%、低質(zhì)量的序列后得到適合分析的數(shù)據(jù)。使用比對(duì)軟件BWA[19]和Bowtie[20]將數(shù)據(jù)比對(duì)‘金冠’蘋果基因組。

1.3 差異基因篩選、功能分析及條件特異性表達(dá)分析

差異基因篩選：利用RSEM工具進(jìn)行基因表達(dá)定量，表達(dá)定量結(jié)果以FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）為單位，F(xiàn)DR（false discovery rate）≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因?yàn)椴町惢?。將差異基因與Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后進(jìn)行注釋。

條件特異性表達(dá)分析：條件特異性表達(dá)分析通過(guò)幾種不同條件下差異基因的比較，鑒定在某種特定條件下才表達(dá)的基因。利用3種植物激素處理蘋果葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，對(duì)CTRL1（無(wú)菌水）、CTRL2（0.2%乙醇）、水楊酸（2 mmol?L-1SA）、1-氨基環(huán)丙烷羧酸（10 μmol?L-1ACC）、茉莉酸甲酯（100 μmol?L-1MeJA）這5個(gè)處理樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)其他兩類激素轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究結(jié)果，應(yīng)用如下統(tǒng)計(jì)學(xué)研究方法，得到SA特異性誘導(dǎo)表達(dá)的基因。其計(jì)算公式為：

其中，g為基因，i為樣品，x=ei(g)為基因g在樣品i中的數(shù)據(jù)數(shù)目，E(g)為基因g在所有樣品中數(shù)據(jù)數(shù)目。si為樣品i中所有數(shù)據(jù)數(shù)目，pi=si/∑isi。p≤0.05的基因定義為條件特異表達(dá)基因。

差異基因功能分析：所有SA處理得到的差異基因提交Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.geneontology.org/），用WEGO軟件[21]對(duì)其進(jìn)行GO功能分類分析。數(shù)據(jù)提交KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（kyoto encyclopedia of gene and genomes），以KEGG途徑為單位，Qvalue≤0.05的途徑定義為在差異基因中顯著富集的途徑，分析差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)途徑。

1.4 差異基因的qRT-PCR熒光定量分析

采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（Thermo公司）對(duì)1.2中RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以SYBRGreen染料進(jìn)行熒光定量PCR（qRT-PCR）分析。蘋果肌動(dòng)蛋白基因（序列號(hào)為GQ339778）作為內(nèi)參，基因表達(dá)倍數(shù)通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算。3次重復(fù)。差異基因的特異性引物由生工生物工程有限公司合成（詳細(xì)引物序列見(jiàn)表1）。

1.5 SA信號(hào)途徑特異性啟動(dòng)子的鑒定及其生物信息學(xué)分析

根據(jù)qRT-PCR分析結(jié)果，選定SA誘導(dǎo)上調(diào)最顯著的基因以及受SA誘導(dǎo)調(diào)控不顯著的基因，克隆其啟動(dòng)子序列，將啟動(dòng)子克隆到含有編碼熒光素酶基因的表達(dá)載體中，并置于熒光素酶基因之前，用以驅(qū)動(dòng)熒光素酶基因。采用PEG法轉(zhuǎn)化蘋果愈傷原生質(zhì)體，常溫表達(dá)3 h后，利用2 mmol?L-1SA、100 μmol?L-1MeJA、10 μmol?L-1ACC、10 μmol?L-1ABA、5 mmol?L-1EGTA（Ca2+螯合劑）分別處理3 h，收集原生質(zhì)體，加入裂解液，用酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，型號(hào)為VICTOR X4）測(cè)定LUC（熒光素酶，luciferase）和GUS值，分析LUC/GUS比值，鑒定SA途徑的特異性響應(yīng)啟動(dòng)子序列。表達(dá)載體構(gòu)建及原生質(zhì)體分離和轉(zhuǎn)化的詳細(xì)流程參見(jiàn)He等[22]的方法。

構(gòu)建該基因的MBP融合表達(dá)載體pMAL-gene- 2HA，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并進(jìn)行純化，用于后續(xù)研究。利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)測(cè)序質(zhì)量評(píng)估及差異基因、條件特異表達(dá)基因的篩選

對(duì)照和SA處理分別得到750 439 459 bp和751 596 153 bp測(cè)序數(shù)據(jù)，其中，71.72%和71.29%定位于蘋果基因組，44.77%和43.88%的序列與‘金冠’蘋果基因組數(shù)據(jù)[23]中的基因完全匹配（表2）。結(jié)果表明：共篩選到3 329個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1 085個(gè)，下調(diào)基因2 244個(gè)（圖1）。

在本轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究中，除對(duì)SA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究外，還對(duì)ACC（乙烯合成前體物質(zhì)）、MeJA（茉莉酸甲酯）的轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行對(duì)比與統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算，篩選到蘋果基因組中33個(gè)只被SA誘導(dǎo)的特異表達(dá)基因（圖2），包括轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000252435）、轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000263349）、（MDP0000280322）、鋅指結(jié)構(gòu)基因（MDP0000289278）、轉(zhuǎn)錄因子（MDP0000830129）以及未知功能基因等（表3）。

左圖：橫坐標(biāo)表示CTRL樣品表達(dá)量的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示SA樣品表達(dá)量的對(duì)數(shù)值。橙色三角代表上調(diào)基因，藍(lán)色方塊代表下調(diào)基因，褐色圓點(diǎn)代表非顯著差異基因。右圖：1代表上調(diào)基因，2代表非顯著差異基因，3代表下調(diào)基因

表1 用于qRT-PCR分析的基因及引物

2.2 差異基因的GO分類

GO分析將差異基因分為參與生物過(guò)程、細(xì)胞成分和分子功能3部分（圖3）。參與生物過(guò)程差異基因分為16類，其中細(xì)胞過(guò)程（cellular process，54.2%）、代謝過(guò)程（metabolic process，78.4%）所占比例最多，其次為單細(xì)胞過(guò)程（single-organism process，33.6%）。細(xì)胞成分中，細(xì)胞（cell，64.1%）、細(xì)胞組分（cell part，64.1%）所占比例最多，其次為膜結(jié)構(gòu)（membrane，39.6%）以及細(xì)胞器（organelle，33%）。分子功能的綁定（binding，55.4%）、催化活性（catalytic activity，77%）差異基因所占比例最多，其次為轉(zhuǎn)運(yùn)活性（transporter activity，7.2%）、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性（molecular transducer activity，3.6%）以及核酸綁定轉(zhuǎn)錄因子活性（nucleic acid binding transcription factor activity，2.2%）等。

圖2 條件特異表達(dá)基因的篩選

表2 樣品與‘金冠’蘋果基因組序列的比對(duì)結(jié)果

表3 SA誘導(dǎo)的條件特異表達(dá)基因

1：生物相；2：生物調(diào)節(jié)；3：細(xì)胞組分組織或生物形成；4：細(xì)胞過(guò)程；5：發(fā)育過(guò)程；6：免疫系統(tǒng)過(guò)程：；7：定位；8：代謝過(guò)程；9：多細(xì)胞有機(jī)體過(guò)程；10：生物過(guò)程積極調(diào)控；11：生物過(guò)程調(diào)控；12：復(fù)制；13：復(fù)制過(guò)程；14：刺激反應(yīng)；15：信號(hào)；16：?jiǎn)我簧镞^(guò)程；17：細(xì)胞；18：細(xì)胞成分；19：胞外區(qū)：；20：胞外區(qū)部分；21：大分子復(fù)合物；22：膜；23：膜附著腔；24：膜組分；25：細(xì)胞器；26：細(xì)胞器部分；27：抗氧化活性；28：綁定；29：催化活性；30：酶調(diào)節(jié)器活性；31：分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；32：核酸綁定轉(zhuǎn)錄因子活性；33：蛋白綁定轉(zhuǎn)錄因子活性；34:受體活性；35：結(jié)構(gòu)分子活性；36：轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性

2.3 差異基因KEGG富集分析及受SA影響的次生代謝基因

通過(guò)KEGG富集分析，確定差異基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)途徑。根據(jù)≤0.01，找到30個(gè)與整個(gè)基因組背景相比顯著富集的途徑（圖4）。KEGG分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因顯著富集途徑主要有4個(gè)，其中代謝途徑差異基因608個(gè)，占29.49%；次生代謝物質(zhì)合成途徑411個(gè)，占19.93%；植物-病原菌互作途徑235個(gè)，占11.4%；植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑182個(gè)，占8.83%。

1：次生代謝的生物合成；2：代謝途徑；3：果糖和甘露醇代謝；4：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；5：維生素B6代謝；6：晝夜節(jié)律；7：光合作用-天線蛋白；8：脂肪酸代謝；9：類黃酮生物合成；10：卟啉和葉綠素代謝；11：甘油酯代謝；12：類胡蘿卜素生物合成；13：丙酮酸代謝；14: 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸退化；15：油菜素內(nèi)酯生物合成；16：谷胱甘肽代謝：17：半乳糖代謝：18：糖酵解和糖質(zhì)新生；19：苯丙素的生物合成；20：亞麻酸代謝；21：維生素C代謝；22：植物-病原菌互作；23：其他多糖降解；24：萜類化合物生物合成；25：ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；26：糖胺聚糖降解；27：二羧酸代謝；28：類單萜生物合成；29：半胱氨酸和蛋氨酸代謝；30：氨基糖和核苷酸糖代謝

1：代謝途徑；2：次生代謝生物合成；3：植物病原菌互作；4：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

植物次生代謝途徑在植物抵抗生物與非生物脅迫反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)在次生代謝合成途徑中，SA上調(diào)基因124個(gè)，下調(diào)基因287個(gè)（圖5）。在24個(gè)上調(diào)比率≥5的基因中（表4），5個(gè)苯丙烷生物合成途徑基因，8個(gè)類黃酮合成途徑基因，3個(gè)花青苷生物合成途徑基因，4個(gè)維生素代謝途徑涉及基因，說(shuō)明SA主要調(diào)控苯丙烷和類黃酮生物合成途徑。涉及苯丙烷生物合成途徑的基因包括羥基脯氨酸富集糖蛋白（MDP0000180381），甘露醇脫氫酶（MDP0000164361、MDP0000609114）和肉桂醇脫氫酶CAD（MDP0000448602、MDP0000858930），其中甘露醇脫氫酶通過(guò)調(diào)節(jié)甘露醇的合成增強(qiáng)植物的抗性[24]，其上調(diào)表達(dá)為研究SA增強(qiáng)抗性的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。木質(zhì)素是植物細(xì)胞壁的一部分，增強(qiáng)了細(xì)胞壁的韌性，同時(shí)增強(qiáng)植物對(duì)脅迫反應(yīng)的抵抗能力。肉桂醇脫氫酶CAD作用于整個(gè)木質(zhì)素合成途徑的最后一步，在木質(zhì)素合成中起到關(guān)鍵作用[25]。本研究中SA誘導(dǎo)CAD的上調(diào)表達(dá)，間接表明SA增強(qiáng)植物抵抗脅迫反應(yīng)的能力，為研究SA誘導(dǎo)植物抗性的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。苯丙氨酸解氨酶PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，參與植物木質(zhì)素、類黃酮等次生代謝物質(zhì)的生物合成，其活性在SA誘導(dǎo)下呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)[26]。本研究中SA未誘導(dǎo)PAL（MDP0000787168，-3.03）的上調(diào)，與前人研究結(jié)果不一致[11]，很可能是因?yàn)镾A處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致PAL活性下降。在類黃酮生物合成途徑中，莨菪堿雙加氧酶（MDP0000472462、MDP0000183313、MDP0000229093），細(xì)胞色素P450家族（MDP0000221432、MDP0000196375），異黃酮羥化酶（MDP0000138677、MDP0000165503），黃酮醇合成酶（MDP0000130244）被SA誘導(dǎo)顯著上調(diào)。其中細(xì)胞色素P450一方面參與植物次生代謝的生物合成，一方面參與代謝解毒功能。維生素代謝途徑中的醛酮類還原酶（MDP0000804510、MDP0000046192、MDP0000158194、MDP0000246999）在SA誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著提高，它們也是植物中重要的解毒酶，在植物的非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[27]。SA調(diào)控花青苷的生物合成，其中3-氧-葡萄糖苷5-氧-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（MDP0000229280、MDP0000545122、MDP0000506825）在SA誘導(dǎo)下顯著上調(diào)。β-1,3-葡聚糖酶降解真菌細(xì)胞壁，有直接攻擊病原真菌的潛在能力[28]，在本研究中，SA誘導(dǎo)β-1,3-葡聚糖酶（MDP0000254363）的顯著上調(diào)，同時(shí)SA誘導(dǎo)上調(diào)細(xì)胞色素P450（MDP0000196375），該基因調(diào)控油菜素內(nèi)酯的生物合成。

表4 次生代謝生物合成途徑中的上調(diào)基因（表達(dá)比率≥5）

1：苯丙烷生物合成；2：類黃酮生物合成；3：油菜素內(nèi)酯生物合成；4：花青苷生物合成；5：萜類生物合成；6：維生素代謝

1: Phenylpropanoid biosynthesis; 2: Flavonoid biosynthesis; 3: Brassinosteroid biosynthesis; 4: Anthocyanin biosynthesis; 5: Terpenoid backbone biosynthesis; 6: Vitamin metabolism

2.4 植物病原菌互作途徑中受SA影響的抗病相關(guān)基因

在進(jìn)化過(guò)程中，植物與病原菌的較量也在自然選擇過(guò)程中不斷改進(jìn)，使植物形成了復(fù)雜的防御機(jī)制。植物的抗性分為基礎(chǔ)抗性和主動(dòng)抗性?；A(chǔ)抗性在病原菌入侵前就已存在，是植物抵抗病原菌的第一道防線，如植物本身的氣孔、皮孔、角質(zhì)層等。主動(dòng)抗性是病原菌突破基礎(chǔ)抗性后激發(fā)的第二道防御系統(tǒng)，即免疫反應(yīng)，激活一系列防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)，此過(guò)程需要轉(zhuǎn)錄因子等重要抗性功能基因的調(diào)控。其中植物與病原菌互作途徑在早期抵抗病原菌入侵中發(fā)揮重要作用。

本研究植物-病原菌互作途徑中被SA誘導(dǎo)61個(gè)基因上調(diào)，174個(gè)基因下調(diào)（圖5）。分析得到了該途徑中調(diào)控幅度較大的抗病相關(guān)基因（表5）。其中MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)在植物與病原菌互作過(guò)程中具有重要意義。MPK4能夠負(fù)調(diào)控植物的系統(tǒng)獲得抗性（SAR）。研究表明擬南芥突變體SA合成量提高，表達(dá)增強(qiáng)，表現(xiàn)出組成性的系統(tǒng)獲得抗性（SAR），提高了植物對(duì)病原菌的抗性[29]。利用外源SA對(duì)丹參處理2 h后能夠誘導(dǎo)及MAPK級(jí)聯(lián)途徑上游基因上調(diào)表達(dá)[30]，擬南芥被SA誘導(dǎo)且負(fù)調(diào)控SA介導(dǎo)的植物抗病反應(yīng)[31]。本研究中SA誘導(dǎo)MAPK級(jí)聯(lián)途徑上游基因（MDP0000431417）上調(diào)，但對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)影響。調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄因子與下游靶蛋白啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控防衛(wèi)基因表達(dá)以及植物抗毒素的積累[32]。本研究SA對(duì)無(wú)影響，但下游轉(zhuǎn)錄因子被SA顯著誘導(dǎo)表達(dá)，包括與調(diào)控防衛(wèi)基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子MDP0000754989、MDP0000228304、MDP0000175240、MDP0000767097等。與MPK3/6相比，MPK4下游的轉(zhuǎn)錄因子MDP0000263349、MDP0000253189、MDP0000300712調(diào)控比率較大（表5）。由此推測(cè)，SA更側(cè)重于調(diào)控MPK4下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

植物病原菌互作途徑中上調(diào)趨勢(shì)較為明顯的還有抗病蛋白受體基因（MDP0000774112），（MDP0000300920），熱激蛋白基因（MDP0000254260），此外，鈣調(diào)蛋白（MDP0000785886）同樣被SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

熱激蛋白HSP90是一種高度保守且在脅迫反應(yīng)中大量積累的蛋白，通常以分子伴侶的形式與靶蛋白形成復(fù)合物調(diào)控生物抗性反應(yīng)[33]。核酸綁定和寡聚化域類受體（NLRs）感知不同病原菌的受體蛋白，病原菌受體的識(shí)別觸發(fā)植物防衛(wèi)反應(yīng)，伴隨一系列細(xì)胞程序性死亡，即過(guò)敏反應(yīng)[34]。RPM1屬于NLRs家族成員，擬南芥中HSP90對(duì)于NLRs的積累是必需的[35]。

表5 植物病原菌互作途徑調(diào)控基因（表達(dá)比率≥3）

HSP90與抗病蛋白R(shí)PM1結(jié)合，可通過(guò)改變分子伴侶活性改變RPM1的分子功能。本研究SA處理誘導(dǎo)（MDP0000254260）和（MDP0000774112）的上調(diào)，為研究SA增強(qiáng)植物抗病性的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

2.5 差異基因qRT-PCR熒光定量分析

選定24個(gè)差異表達(dá)基因（15個(gè)上調(diào)基因，9個(gè)下調(diào)基因）進(jìn)行qRT-PCR分析。如圖6所示，15個(gè)上調(diào)基因中，除（MDP0000868782，1.7倍）誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)較弱，其他基因均被SA誘導(dǎo)顯著上調(diào)。（MDP0000263349，4 615倍）、（MDP0000226971，3 241倍）、鈣調(diào)蛋白（MDP0000785886，3 219倍）和類固醇還原酶（MDP0000383328，1 293倍）上調(diào)倍數(shù)最顯著，其次為（MDP0000280322，572倍）、（MDP0000254260，359倍）等，抗病蛋白基因（MDP0000774112，128倍）、（MDP0000300920，112倍）也被SA誘導(dǎo)上調(diào)。9個(gè)下調(diào)基因中，（MDP0000277999）、（MDP0000711379）、（MDP0000138686）、（MDP0000256492）下調(diào)趨勢(shì)較明顯。（MDP0000710349）、（MDP0000247896）和（MDP0000232344）雖然調(diào)控趨勢(shì)不明顯，但轉(zhuǎn)錄組分析其調(diào)控比率均≤1.5，表明SA對(duì)這3個(gè)基因的調(diào)控較弱。綜上所述，qRT-PCR結(jié)果表明各基因表達(dá)與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，只是在差異倍數(shù)上與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有所差別。

2.6 蘋果中SA特異性響應(yīng)啟動(dòng)子的鑒定

為進(jìn)一步研究蘋果對(duì)SA的響應(yīng)機(jī)制，本研究利用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性進(jìn)行分析。選定SA特異性響應(yīng)基因作為研究對(duì)象，克隆了該基因的啟動(dòng)子序列：從該基因開(kāi)放閱讀框起始位點(diǎn)ATG，向上游2 500 bp的核苷酸序列（圖7）。以蘋果中對(duì)SA不敏感的基因（MDP0000710349）的啟動(dòng)子（圖8）及擬南芥中對(duì)細(xì)菌鞭毛蛋白進(jìn)行響應(yīng)的（At2g19190）的啟動(dòng)子（圖9）[36]為參考對(duì)照，檢測(cè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性。

熒光素酶活性分析表明，能夠?qū)A進(jìn)行響應(yīng)（圖10-A）。結(jié)果表明，經(jīng)SA處理，其熒光素酶活性為未經(jīng)SA處理的20.6倍；也能夠被SA誘導(dǎo)激活，但是，誘導(dǎo)倍數(shù)顯著低于；而另一基因（MDP0000710349）啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶，經(jīng)SA處理后其活性僅為未處理的2.29倍，說(shuō)明該片段對(duì)SA不具有或僅具有微弱的響應(yīng)能力。

對(duì)基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)序列中存在ABA/MeJA/GA/SA響應(yīng)順式作用元件、病菌響應(yīng)元件、防衛(wèi)脅迫響應(yīng)元件等（圖7）。但是，進(jìn)一步應(yīng)用該啟動(dòng)子序列的研究表明，除SA外，其他激素不能夠引起該啟動(dòng)子片段的響應(yīng)（圖10-B），說(shuō)明該片段是對(duì)SA進(jìn)行特異性響應(yīng)的啟動(dòng)子序列。同時(shí)，對(duì)和的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子序列含有4個(gè)SA響應(yīng)元件位點(diǎn)（圖9），而啟動(dòng)子序列中不含SA響應(yīng)元件（圖8）。

為進(jìn)一步精細(xì)區(qū)分界定啟動(dòng)子中對(duì)SA響應(yīng)的順式作用元件，分別克隆了從開(kāi)放閱讀框的翻譯起始位點(diǎn)ATG向上游500 bp、1 000 bp、1 500 bp、2 000 bp的核苷酸序列，并構(gòu)建到表達(dá)載體中置于熒光素酶編碼基因的上游，轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，檢測(cè)對(duì)SA的響應(yīng)能力。研究表明，500 bp、1 000 bp的核苷酸序列，不具有對(duì)低濃度SA（0.2 mmol?L-1）的響應(yīng)能力，而在1 500 bp時(shí)，對(duì)SA表現(xiàn)出微弱響應(yīng)，但與1 000 bp相比，二者在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著；而長(zhǎng)度達(dá)到2 000 bp時(shí)，顯著提高了熒光素酶活性，為未用SA處理的4.1倍，分別是500 bp、1 000 bp時(shí)SA處理?xiàng)l件下熒光素酶活性的2.3倍、3.3倍。說(shuō)明，在1 000 bp—2 000 bp間具有顯著提高SA響應(yīng)能力的核苷酸序列。而2 000 bp、2 500 bp的核苷酸序列在響應(yīng)SA的水平上，不具有顯著差異（圖10-C，左）。

應(yīng)用高濃度的SA處理，同樣證明了這一結(jié)論。用0.5 mmol?L-1SA處理原生質(zhì)體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)500 bp、1 000 bp的核苷酸序列即具有對(duì)SA的響應(yīng)能力，熒光素酶活性分別為未用SA處理的4.2倍、3.3倍，500 bp、1 000 bp二者響應(yīng)能力處于同一水平。而長(zhǎng)度為1 500 bp時(shí)，熒光素酶活性進(jìn)一步升高，為未用SA處理的7.4倍，與1 000 bp、500 bp核苷酸序列相比，具有顯著差異。核苷酸序列長(zhǎng)度增加到2 000 bp時(shí)，對(duì)SA響應(yīng)能力進(jìn)一步增強(qiáng)，熒光素酶活性升高倍數(shù)為11.5倍，與1 500 bp核苷酸序列相比，具有顯著差異。該研究結(jié)果說(shuō)明，在1 000 bp—1 500 bp及1 500—2 000 bp，具有增強(qiáng)SA響應(yīng)能力的順式作用元件。而2 000—2 500 bp，在對(duì)SA響應(yīng)的熒光素酶活性變化上，沒(méi)有進(jìn)一步提高（圖10-C，右）。

圖6 差異基因的qRT-PCR分析

圖7 MdWRKY40啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

結(jié)合低濃度（0.2 mmol?L-1）與高濃度（0.5 mmol?L-1）SA的研究結(jié)果可以看出，從ATG開(kāi)始向上游500 bp的核苷酸序列已具有對(duì)SA的響應(yīng)能力，但是，該區(qū)段不能響應(yīng)低濃度SA，而在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp，尤其是后者，具有顯著增強(qiáng)蘋果細(xì)胞對(duì)SA敏感性的未知核苷酸序列。

2.7 MdWRKY40轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在反饋抑制機(jī)制

研究表明，一些重要的轉(zhuǎn)錄因子存在自我催化或反饋抑制的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，以達(dá)到快速響應(yīng)外界信號(hào)或及時(shí)阻抑過(guò)高表達(dá)的目的，前者如調(diào)控蘋果果實(shí)著色的重要轉(zhuǎn)錄因子[37]與歐芹[38]，后者如擬南芥中調(diào)控植物衰老進(jìn)程的重要轉(zhuǎn)錄因子[39]。

為探究是否存在自我調(diào)控機(jī)制，將35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的MdWRKY40蛋白與Promoter- WRKY40-Luciferase在原生質(zhì)體中進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。共轉(zhuǎn)后的熒光素酶活性僅為對(duì)照的35%，Western blot顯示MdWRKY40蛋白在原生質(zhì)體中成功表達(dá)，其分子量為37 kD（圖10-D），說(shuō)明MdWRKY40蛋白的表達(dá)對(duì)其自身RNA水平的轉(zhuǎn)錄具有反饋抑制作用。

圖8 MdChiB-1啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

在本研究中，還克隆了的開(kāi)放閱讀框序列，構(gòu)建到含有MBP融合蛋白表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，成功得到WRKY40誘導(dǎo)蛋白（MBP蛋白分子量為40 kD，加上WRKY40后，總的蛋白分子量約為77 kD，圖10-E），為解析該蛋白在SA信號(hào)途徑的功能奠定了生化基礎(chǔ)。

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析篩選到SA介導(dǎo)抗病信號(hào)途徑的重要功能基因

由于SA調(diào)控蘋果抗病的分子機(jī)制尚不明確，SA信號(hào)途徑的關(guān)鍵基因尚未找到，本研究利用外源SA處理蘋果葉片，構(gòu)建SA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，探討SA處理后差異表達(dá)基因、基因富集通路的變化，尋找SA調(diào)控抗病反應(yīng)的關(guān)鍵基因。對(duì)照和SA處理測(cè)序數(shù)據(jù)可靠，覆蓋率高，適合用于數(shù)據(jù)分析。（nonexpressor of PR genes 1）是SA信號(hào)途徑的關(guān)鍵調(diào)控因子[40]。擬南芥和小麥過(guò)量表達(dá)能夠增強(qiáng)二者對(duì)病原菌的抗性[41]。Chai等[42]的研究表明，利用0.1 mmol?L-1SA處理擬南芥離體葉片2 d，轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)倍數(shù)為對(duì)照的3倍，處理4 d，的表達(dá)提高到9倍，而在本研究中，未檢測(cè)到SA處理后蘋果（MDP0000292425）基因表達(dá)的變化，一方面可能與SA處理濃度（2 mmol·L-1）與取樣時(shí)間（12 h）有關(guān)；另一方面，在SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，作為SAR（系統(tǒng)獲得抗性）的分子開(kāi)關(guān)，其泛素化降解啟動(dòng)SAR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，而旁系同源基因和作為SA的受體，介導(dǎo)了泛素化降解[43]。在本研究中（MDP0000868782）被SA處理誘導(dǎo)表達(dá)（表達(dá)比率為1.7）。因此，推測(cè)在表達(dá)水平上不受調(diào)控，而主要發(fā)生在蛋白水平上。表達(dá)與SA處理濃度及時(shí)間的關(guān)系，以及與SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系，需要進(jìn)一步研究。

圖9 FRK1啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

NIMIN1（MDP0000280322）是NPR1的互作蛋白，負(fù)調(diào)控表達(dá)[44-45]。本研究（MDP0000280322）被SA誘導(dǎo)顯著上調(diào)（其表達(dá)比率為6.56），是SA誘導(dǎo)的條件特異表達(dá)基因之一，且（MDP0000711379，-1.14）的轉(zhuǎn)錄水平同時(shí)降低，因此推測(cè)蘋果與擬南芥負(fù)調(diào)控的分子機(jī)制一致。其在蘋果中的具體功能尚不清楚，需要進(jìn)行后續(xù)研究。

在本研究中，一些調(diào)控次生代謝的基因也能夠被SA誘導(dǎo)上調(diào)，其中包括葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，該基因在煙草中同樣被SA所誘導(dǎo)表達(dá)[46-47]。研究表明，病菌通過(guò)分泌甘露醇到質(zhì)外體來(lái)抑制活性氧介導(dǎo)的的宿主防衛(wèi)反應(yīng)，植物中的甘露醇脫氫酶通過(guò)將病菌分泌的甘露醇轉(zhuǎn)變?yōu)楦事短?，從而增?qiáng)植物的抗病反應(yīng)，本研究中甘露醇脫氫酶基因被SA誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，這與Cheng等[48]的研究一致。肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，SA上調(diào)CAD的表達(dá)，在甘薯和茶樹(shù)中同樣證實(shí)了這一觀點(diǎn)[49-50]。表明不同物種之間SA響應(yīng)次生代謝途徑的保守性很強(qiáng)。SA對(duì)次生代謝的調(diào)控，是調(diào)控植物抗性的一個(gè)非常重要的方面。

A：SA處理各啟動(dòng)子的LUC/GUS比值；B：各種激素處理MdWRKY40啟動(dòng)子的LUC/GUS比值；C：MdWRKY40啟動(dòng)子的不同區(qū)段對(duì)不同濃度SA處理的LUC/GUS比值，0.2 mmol?L-1 SA（左）、0.5 mmol?L-1 SA（右）；D：MdWRKY40蛋白超表達(dá)對(duì)LUC/GUS比值的影響；E：MdWRKY40誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001

研究中還發(fā)現(xiàn)了參與活性氧途徑代謝的基因，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中，還有一種重要的次生代謝產(chǎn)物活性氧（ROS），對(duì)觸發(fā)過(guò)敏反應(yīng)至關(guān)重要[51]。呼吸爆發(fā)氧化酶（Respiratory burst oxidase homologues，Rboh）是植物活性氧（ROS）的主要生產(chǎn)者[52]，PTI（pattern triggered immunity）和ETI（effector triggered immunity）均能調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)，但ETI能夠更強(qiáng)更快速的引起局部過(guò)敏反應(yīng)[53]。SA處理下調(diào)呼吸爆發(fā)氧化酶（Rboh）的轉(zhuǎn)錄水平，表明PTI途徑中由ROS引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)被抑制，同時(shí)SA誘導(dǎo)蘋果中（MDP0000254260）和（MDP0000774112）的上調(diào)，激發(fā)ETI途徑中抗病基因介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，對(duì)于SA誘導(dǎo)蘋果抗病性的調(diào)控機(jī)制指明了研究方向。SA對(duì)非生物脅迫起到正面調(diào)控作用。研究表明SA處理顯著降低蘋果幼苗內(nèi)ROS水平，提高抗氧化酶活性，降低膜脂過(guò)氧化水平，從而減輕低氧脅迫對(duì)植株的傷害，其調(diào)控機(jī)制尚不明確[54]。本研究中SA誘導(dǎo)呼吸爆發(fā)氧化酶Rboh下調(diào)，為SA能夠增強(qiáng)蘋果對(duì)低氧脅迫的抗性提供了分子證據(jù)。

研究表明持續(xù)的MAPK級(jí)聯(lián)途徑的激活有助于激發(fā)SA誘導(dǎo)的大部分響應(yīng)基因的表達(dá)[55]。本研究SA誘導(dǎo)了蘋果MAPK級(jí)聯(lián)途徑頂端基因的上調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，但對(duì)及則無(wú)轉(zhuǎn)錄水平的影響。對(duì)差異基因進(jìn)行條件特異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)SA特異性誘導(dǎo)了33個(gè)差異基因的表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄因子、、、轉(zhuǎn)錄因子等，這在之前蘋果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析中未見(jiàn)報(bào)道。33個(gè)特異表達(dá)基因?yàn)榻沂維A途徑的特異性生物過(guò)程提供了理論依據(jù)，其中的轉(zhuǎn)錄因子及植物病原菌互作相關(guān)蛋白，在SA誘導(dǎo)的植物抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Pandey等[56]的研究表明水稻中多種轉(zhuǎn)錄因子參與抗病反應(yīng)，例如、和在稻瘟病菌的侵染過(guò)程中表現(xiàn)為差異性表達(dá)，白葉枯菌能夠誘導(dǎo)和的特異性表達(dá)，并與和互作從而負(fù)調(diào)控XA21介導(dǎo)的抗病反應(yīng)[57-58]，本研究誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子在蘋果抗病反應(yīng)的具體功能尚不清楚，仍需進(jìn)行深入研究。

從本研究轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)可以看出，SA顯著調(diào)控，次生代謝合成基因，活性氧代謝基因以及轉(zhuǎn)錄因子家族基因表達(dá)，SA廣泛參與了對(duì)于蘋果系統(tǒng)抗性中各個(gè)過(guò)程的調(diào)控，其中，對(duì)每一方面的調(diào)控方式和作用位點(diǎn)，需要在本研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步應(yīng)用分子以及生化手段進(jìn)行揭示。

3.2 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)與SA信號(hào)途徑

啟動(dòng)子負(fù)責(zé)對(duì)外界誘導(dǎo)條件的響應(yīng)，在本研究中只克隆了2 500 bp的核苷酸序列，有可能在上游序列中，仍然含有進(jìn)一步提高對(duì)SA進(jìn)行響應(yīng)的特異性元件。為擬南芥中對(duì)細(xì)菌鞭毛蛋白flg22的22個(gè)氨基酸序列進(jìn)行強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)的基因，是細(xì)菌鞭毛蛋白響應(yīng)的指示性基因[36]，在蘋果基因組中并未找到的同源基因，但是，將-LUC轉(zhuǎn)化于蘋果細(xì)胞中，經(jīng)SA處理，發(fā)現(xiàn)升高10.1倍，說(shuō)明在蘋果細(xì)胞中啟動(dòng)子序列仍然能夠被識(shí)別，這不僅表明蘋果細(xì)胞與擬南芥細(xì)胞中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的保守性，同時(shí)也說(shuō)明，在蘋果細(xì)胞中，SA信號(hào)途徑具有影響PTI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力，說(shuō)明SA在植物抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，具有重要的作用。在的啟動(dòng)子中，發(fā)現(xiàn)了對(duì)SA進(jìn)行響應(yīng)的4個(gè)序列元件，暗示的啟動(dòng)子除了能夠?qū)?xì)菌鞭毛蛋白flg22進(jìn)行響應(yīng)外，還能夠?qū)A進(jìn)行響應(yīng)，而試驗(yàn)結(jié)果也表明的啟動(dòng)子可以響應(yīng)SA，與生物信息學(xué)分析結(jié)果相一致。

啟動(dòng)子序列通常包含多種順式作用元件，確定對(duì)信號(hào)應(yīng)激反應(yīng)起關(guān)鍵作用的順式作用元件對(duì)理解細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)極為重要。在本研究中，通過(guò)不同區(qū)段克隆的方式，發(fā)現(xiàn)在1 000—2 000 bp，存在增強(qiáng)SA信號(hào)響應(yīng)能力的作用元件。生物信息學(xué)分析表明，在1 000 bp以內(nèi)，存在3個(gè)響應(yīng)SA的順式作用元件，其中500 bp以內(nèi)含有2個(gè)，500—1 000 bp含有1個(gè)（圖7），這與500 bp的核苷酸序列已具有對(duì)SA的響應(yīng)能力的試驗(yàn)結(jié)果相一致，但是，500 bp、1 000 bp對(duì)SA的響應(yīng)能力沒(méi)有區(qū)別，說(shuō)明這3個(gè)順式元件可能功能上具有重疊。同時(shí)，該區(qū)段不能響應(yīng)低濃度SA，而當(dāng)核苷酸序列長(zhǎng)度增長(zhǎng)到2 000 bp時(shí)，具有了對(duì)低濃度SA的響應(yīng)能力，說(shuō)明，在1 000—2 000 bp，含有進(jìn)一步增強(qiáng)SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的作用元件。將這一區(qū)段一分為二，即1 000—1 500 bp、1 500—2 000 bp，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)區(qū)段在高濃度SA時(shí)，都能夠顯著增強(qiáng)SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，說(shuō)明在這兩個(gè)區(qū)段中，分別具有提高對(duì)SA敏感性的作用元件，而在低濃度SA時(shí)，只有從1 000 bp增加到2 000 bp時(shí)，才能顯著提高蘋果細(xì)胞對(duì)SA的敏感性，說(shuō)明這兩個(gè)區(qū)段的SA順式作用元件具有累積與加和效應(yīng)。在啟動(dòng)子的研究中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)，多個(gè)元件具有累積效應(yīng)，元件拷貝數(shù)目的不同會(huì)對(duì)啟動(dòng)子響應(yīng)的強(qiáng)度和誘導(dǎo)性產(chǎn)生不同的影響[59]。生物信息學(xué)分析表明，在1 000—1 500 bp存在2個(gè)茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（TGACG），1 500—2 000 bp存在3個(gè)病菌響應(yīng)元件（ACGTG）、2個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)元件（AACGAC）和1個(gè)W-box（TTGAC），并未預(yù)測(cè)到SA的響應(yīng)元件，說(shuō)明在這一區(qū)段中，可能存在增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)SA敏感性的未知核苷酸序列。

在植物中一些具有重要功能的轉(zhuǎn)錄因子具有自我催化或自我抑制機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，MdWRKY40蛋白能夠抑制自身基因的轉(zhuǎn)錄，這種自我抑制模式與擬南芥中調(diào)控衰老的關(guān)鍵基因的表達(dá)模式相同。Robatzek等[39]發(fā)現(xiàn)，將WRKY6蛋白在擬南芥細(xì)胞中超表達(dá)，其自身的轉(zhuǎn)錄活性降低12倍。這種反饋抑制機(jī)制可能有效阻止了由自身基因的過(guò)量表達(dá)而導(dǎo)致的植物早衰。在本研究中發(fā)現(xiàn)能夠快速高效響應(yīng)SA，說(shuō)明是抗性信號(hào)物質(zhì)SA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)重要基因，該基因的反饋抑制作用，可能及時(shí)阻止了自身過(guò)量表達(dá)對(duì)植物帶來(lái)的危害。筆者實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建植物穩(wěn)定超表達(dá)載體，進(jìn)行轉(zhuǎn)化蘋果愈傷和蘋果植株，對(duì)其基因功能進(jìn)行進(jìn)一步研究。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)廣泛應(yīng)用于植物的基因功能、亞細(xì)胞定位、蛋白互作及瞬時(shí)表達(dá)等方面，可以高效準(zhǔn)確的解析植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是分子生物學(xué)和生物化學(xué)研究的有效手段[60]。不同植物原生質(zhì)體技術(shù)的成功應(yīng)用，促進(jìn)了植物基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)功能的研究。例如，水稻中利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)成功得到了MYBS3的亞細(xì)胞定位性質(zhì)[61]。擬南芥中利用原生質(zhì)體研究了不同基因的表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[62]及蛋白互作情況[63]等。本研究利用蘋果愈傷的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)首次鑒定了在蘋果中對(duì)SA進(jìn)行特異性響應(yīng)的啟動(dòng)子序列，即（MDP0000263349）的啟動(dòng)子序列，為蘋果這種多年生木本植物中開(kāi)展相關(guān)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究提供了穩(wěn)定的鑒定體系，也為以后獲得更多特異途徑的靶標(biāo)基因與調(diào)控基因提供了可能。大腸桿菌中成功誘導(dǎo)WRKY40蛋白的表達(dá)，為研究WRKY結(jié)構(gòu)域的結(jié)合元件以及鑒定下游的靶基因奠定了生化基礎(chǔ)。的啟動(dòng)子序列中包含各種激素響應(yīng)元件、防衛(wèi)脅迫響應(yīng)元件等，表明可能調(diào)控多種激素和脅迫反應(yīng)過(guò)程。作為SA信號(hào)途徑的特異性啟動(dòng)子，SA響應(yīng)元件在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中占主導(dǎo)地位，圖8中3個(gè)位點(diǎn)的SA響應(yīng)元件對(duì)于是否存在功能冗余，可對(duì)3個(gè)SA響應(yīng)元件進(jìn)行缺失突變，利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)一步鑒定其關(guān)鍵調(diào)控元件。

SA調(diào)控的途徑復(fù)雜而精細(xì)，在植物抗性反應(yīng)中起到顯著作用[64-66]。目前蘋果中關(guān)于SA誘導(dǎo)抗病的分子機(jī)制尚不完善。與模式植物相比，蘋果中SA誘導(dǎo)的途徑更為復(fù)雜，是蘋果抗病的重要機(jī)制之一。分析SA誘導(dǎo)蘋果葉片轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)差異，利于更好的理解SA信號(hào)途徑與植物病原菌互作的分子機(jī)制。本研究的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)及啟動(dòng)子的克隆，為SA在蘋果中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用RNA-Seq技術(shù)獲得了水楊酸（SA）誘導(dǎo)蘋果葉片轉(zhuǎn)錄水平的差異基因，包括次生代謝、植物病原菌互作途徑相關(guān)基因以及33個(gè)條件特異表達(dá)基因。利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)鑒定了SA特異性響應(yīng)基因（MDP0000263349）的啟動(dòng)子序列，在1 000—1 500 bp及1 500—2 000 bp具有顯著提高啟動(dòng)子對(duì)SA敏感性的未知核苷酸序列，另外，MdWRKY40轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在反饋抑制機(jī)制，為蘋果中SA信號(hào)途徑的研究奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Identification ofpromoter Specific Response to Salicylic Acid by Transcriptome Sequencing

QIU HuaRong, ZHOU QianQian, HE XiaoWen, ZHANG ZongYing, ZHANG ShiZhong, CHEN XueSen, WU ShuJing

(College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University/State Key Laboratory of Crop Biology, Tai'an 271018, Shandong)

In order to explain the theoretical basis for disease resistance molecular mechanism mediated by SA, the influence of transcriptional regulation of apple leaves response to salicylic acid was studied, and the SA signaling pathway and its regulated genes were identified.The leaves of tissue culture apple ‘gala’ seedling growing under 24℃ for 30 d were treated with 2 mmol?L-1SA (0.2% ethanol treatment as control) for 12 h. Then the transcriptome libraries was constructed by using Illumina HiSeqTM 2000 sequencing technique, and the regulated genes of SA signaling pathway were screened by integrated bioinformatics analysis which included differential genes screening, condition specificity analysis, GO classification and KEGG enrichment analysis. The promotor of the gene which was specific response to SA was cloned and promotor activity was identified by using protoplast transformation technique. The specific response of different nucleotide fragment of promotor was verified.The original data of 750 439 459 and 751 596 153 bp sequences was obtained from CTRL and SA treatment samples, Which were 44.77% and 43.88% perfect match with the ‘golden delicious’ apple genome sequence, respectively. The transcriptome data of SA treated samples suggested that 3 329 genes were significantly expressed, including the genes related to biosynthesis of secondary metabolites pathway (the key enzyme of lignin synthetic pathway CAD, cytochrome P450, β-1,3-glucanase related to fungal resistance), the important functional genes involved in plant-pathogen pathway (calmodulin CaM, disease resistance protein RPM1, heat shock protein HSP90, WRKY transcription factors) and 33 condition specificity genes (NAC transcription factors, NIM1, WRKY40, Ethylene responsive factors and so on). Among them, 1 085 genes were up-regulated and 2 244 genes were down-regulated. Differentially expressed genes were participated in cellular process, metabolic process, binding, catalytic activity and so on. According to the transcriptome data, the promotor ofwas cloned into the expression vector and placed in the upstream of the luciferase gene. After transforming the vector to apple protoplasts, the luciferase activity of SA treated samples was 20.6 times of the control samples, and the SA treated samples did not affected by ABA, JA or ACC, only showed the specific response to SA. The results suggested that the promotor sequence was specially response to SA in apple. Different segments of the promoter with different response ability to SA. The region 500-1 000 bp of the promoter, which located in the upstream of the WRKY40 transcription start site ATG, only was response to high concentrations of SA and no response to low concentrations of SA. For 1 500 bp sequence, the response ability to high SA concentrations was enhanced significantly, but just slightly increased with low SA concentration. The length of the 2 000 bp nucleotide fragment had a significant response to both the high and low concentrations of SA and achieved the strongest ability level. Compared to 2 000 bp fragment, the 2 500 bp fragment didn’t show further enhanced response to SA. Overexpression of the MdWRKY40 protein inhibited its own transcription.The DEGs obtained under 2 mmol?L-1SA treatment in apple leaves were involved in biosynthesis of phenylpropanoid and flavonoid, plant-pathogen interaction and plant hormone signal transduction pathways. The 2 500 bp nucleotide promotor sequence upstream of WRKY40 open reading frame was specific response to SA. There were unknown nucleotide sequences between 1 000-1 500 bp and 1 500-2 000 bp that significantly enhanced the sensitivity of the promoter response to SA, and the transcription regulation ofexisted a feedback suppression mechanism.

SA; apple; transcriptome; signaling transduction; plant-pathogen interaction

2017-05-07；接受日期：2017-08-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31272132）、山東省泰山學(xué)者工程啟動(dòng)基金（tshw20120712）

邱化榮，E-mail：qiu516@126.com。通信作者陳學(xué)森，Tel：0538-8249338；E-mail：chenxs@sdau.edu.cn。通信作者吳樹(shù)敬，Tel：0538-8246220；E-mail：wushujing666@163.com