福建省浙江紅花油茶遺傳多樣性的ISSR分析

宋倩倩 ，付茂旺 ，何藝凡 ，林文俊 ，陳 輝 *，鄭國華 ，李 煜

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建省油茶工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

福建省浙江紅花油茶遺傳多樣性的ISSR分析

宋倩倩1，2，付茂旺1，2，何藝凡1，2，林文俊1，2，陳 輝1，2*，鄭國華1，2，李 煜1，2

（1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建省油茶工程技術(shù)研究中心，福州 350002）

【目的】為福建省浙江紅花油茶的良種選育與充分開發(fā)利用提供參考?！痉椒ā恳愿＝ㄊ?3個居群198份浙江紅花油茶為實驗材料，對其進行遺傳多樣性的ISSR分子標記分析?！窘Y(jié)果】17個ISSR引物擴增出167條位點，其中多態(tài)性位點142條，平均多態(tài)位點百分率為85.03%。13個居群浙江紅花油茶的遺傳距離的變化范圍為0.1459～0.5094。通過遺傳距離進行聚類分析，可將13個天然居群的浙江紅花油茶分為4個大類。【結(jié)論】福建省不同地區(qū)的浙江紅花油茶遺傳多樣性豐富，居群間親緣關(guān)系差異明顯。

浙江紅花油茶；ISSR；遺傳多樣性；聚類分析

浙江紅花油茶（Camellia chekiangoleosa Hu），又名浙江紅山茶，是山茶科（Theaceae）紅山茶屬的常綠小喬木[1-2]。浙江紅花油茶含油率比普通油茶高出5%～10%，且油質(zhì)優(yōu)于普通油茶，是我國特有的木本油料樹種[3-4]。浙江紅花油茶是集庭院觀賞和食用雙重功能于一體的樹種，具有重要的經(jīng)濟價值，主要產(chǎn)于浙江、福建（北部）、江西（東部及中部）、湖南（南部）、安徽（南部），能夠在海拔600～1200 m的山區(qū)正常開花結(jié)果[1，5]。

分子標記技術(shù)是直接在DNA水平上反映出種間或種內(nèi)核苷酸序列多樣性的一種遺傳標記，具有數(shù)量多，多態(tài)性高、結(jié)果穩(wěn)定且重復(fù)性好等特點[6]。許多分析標記技術(shù)已被用來檢測植物的遺傳變異型性[7]。ISSR技術(shù)作為分子標記技術(shù)的一種，也被廣泛的應(yīng)用于植物種間和種內(nèi)的遺傳多樣性分析[8-9]。相關(guān)研究表明，ISSR分子標記技術(shù)可以有效地研究物種基因多態(tài)性[10]。且已在油茶的遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究方面得到廣泛的應(yīng)用[11-12]。ISSR分子標志技術(shù)在油茶種質(zhì)資源的研究中的廣泛應(yīng)用，為快速準確地鑒定油茶品種提供了理論基礎(chǔ)與技術(shù)平臺。

目前，浙江紅花油茶多處于野生或半野生的栽培狀態(tài)。但是，福建省是浙江紅花油茶的主要天然分布區(qū)之一，對于該地區(qū)浙江紅花油茶的遺傳多樣性研究尚未見報道。本文以福建省不同地理區(qū)域浙江紅花油茶為材料，利用ISSR分子標記技術(shù)研究福建省不同居群的浙江紅花油茶的遺傳多樣性，以期為浙江紅花油茶的保護以及分子輔助良種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為福建省13個居群198份浙江紅花油茶。樣株信息見表1。

表1 13個天然居群浙江紅花油茶信息Table 1 Information of 13 natural population of Camellia chekiangoleosa Hu

1.2 方法

1.2.1 ISSR－PCR擴增反應(yīng)體系的建立

采用改進的CTAB法提取基因組DNA，通過正交實驗方法對ISSR-PCR擴增反應(yīng)進行優(yōu)化，建立浙江紅花油茶的ISSR-PCR反應(yīng)體系與擴增程序。優(yōu)化后反應(yīng)體系如下：DNA（1.5 ng/μL)20μL，Taq酶（0.8 U/μL)1μL，引物（800μmol/L)1μL，dNTP（1.25mmol/L)1μL，Mg2+（1.0mmol/L)1μL。優(yōu)化后擴增程序如下：94℃預(yù)變性5min；40個循環(huán)為94℃變性30 s，退火溫度因引物而定，時間50 s，72℃延伸1.5min，最后72℃延伸8min，4℃保存。

1.2.2 數(shù)據(jù)分析

基于QuantityOne的圖像分析與人工計帶相結(jié)合的方式對ISSR分子標記的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析，統(tǒng)計擴增總位點數(shù)、多態(tài)性比率。根據(jù)Nei's（1978）的遺傳距離，進行聚類分析，生成親緣關(guān)系圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性分析

從進行擴增的90個浙江紅花油茶樣品中篩選出17個多態(tài)性豐富、重復(fù)性好的ISSR引物進行基因組DNA多態(tài)性檢測。共擴增出重復(fù)性好的位點167條，其中多態(tài)性位點142條，多態(tài)性比率達85.03%。17條ISSR引物產(chǎn)生的多態(tài)性位點詳見表2、圖1。

2.2 聚類分析

本文根據(jù)Nei（1978）的遺傳距離公式，計算13個居群間遺傳距離，見表3。并利用居群間的遺傳距離，對13個居群的浙江紅花油茶做UPGMA聚類分析，得出親緣關(guān)系圖譜，如圖2所示。13個居群浙江紅花油茶的遺傳距離在0.1459～0.5094之間。根據(jù)聚類圖，可將13個天然居群的浙江紅花油茶聚為4大類：第Ⅰ大類為XP、PCⅡ、PCⅢ；第Ⅱ大類為ZRⅢ、GT；第Ⅲ大類為 ZRⅠ、ZRⅡ、MH、SNⅡ；第Ⅳ大類為 SNⅠ、TN 、JL、PCⅠ。

3 討論與結(jié)論

17個ISSR引物共擴增出167個位點。擴增的167個位點中有25個為供試材料所共有，占總位點比例的14.97%，表明在種水平上13個天然居群的浙江紅花油茶具有穩(wěn)定性。擴增位點最多的是引物14，位點數(shù)為 14；擴增位點最少的是引物 3、5、10、15，均為8個位點。引物9、13的多態(tài)位點百分率最高，均為100%；引物12的多態(tài)位點百分率最低，僅為66.67%。

根據(jù)遺傳距離來進行的聚類分析具有權(quán)威性和科學(xué)性[13]。杜明鳳等[14]應(yīng)用ISSR分子標記技術(shù)對13個種源的馬尾松開展遺傳多樣性研究，結(jié)果表明群體間的遺傳距離與地理距離之間存在顯著相關(guān)

性，遺傳變異主要分布于群體內(nèi)，群體間已出現(xiàn)了明顯的遺傳分化。周蘭英[15]等運用ISSR技術(shù)對98個油茶種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明地域距離越遠，居群間遺傳距離越大，地理隔離是構(gòu)成油茶遺傳多樣性的重要基礎(chǔ)。謝薈[16]對黎蒴與廣寧紅花油茶進行遺傳多樣性SRAP分析，根據(jù)遺傳距離進行的聚類分析能夠?qū)⒉煌乩砭嚯x區(qū)分開。

表2 17條ISSR-PCR引物擴增結(jié)果Table 2 The result of amplifying by 17 primers

圖1 引物ISSR-45擴增圖譜Figure 1 Map of bands amplified by ISSR-45

表3 浙江紅花油茶13個天然居群間的遺傳距離Table 3 Genetic distance among 13 geographic populations

圖2 基于居群間遺傳距離的聚類分析Figure 2 The gathers analysis based on result of and genetic distance

ISSR分子標志技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于油茶種質(zhì)資源的研究。謝云等[17]運用ISSR分子標記技術(shù)對7個浙江紅花油茶居群的210個個體進行遺傳多樣性分析，篩選出21條引物，共擴增出384個位點，其中多態(tài)性位點372個，結(jié)果表明居群間的遺傳分化低于居群內(nèi)部，居群間的地理距離與遺傳一致度存在一定相關(guān)性。劉楊等[18]運用ISSR分子標記技術(shù)對55份油茶資源進行遺傳多樣性研究，篩選出13條引物，共擴增出110個位點，其中多態(tài)性位點107個，結(jié)果表明不同油茶資源遺傳多樣性較高，其中海南種源的油茶親緣性較高，但仍有地區(qū)差異性。彭繼慶[19]等利用ISSR分子標記技術(shù)對博白大果油茶進行遺傳多樣性研究，結(jié)果表明博白大果油茶種水平具有較高的遺傳多樣性，種群的變異主要來自種群內(nèi)部，種群間分化程度較低。

本研究從198份90個浙江紅花油茶樣品中篩選17個具有重復(fù)性和多態(tài)性好的引物，對福建省13個居群的浙江紅花油茶進行ISSR分子標記分析，結(jié)果表明各地區(qū)之間的差異明顯，說明浙江紅花油茶種源間親緣關(guān)系差異較大、多態(tài)性豐富。根據(jù)聚類分析，居群間的遺傳距離與實際地理距離關(guān)系不顯著，但部分同一地區(qū)的居群聚為一類表明其在地理分布上的一致性，故不能僅根據(jù)居群的實際地理距離判定浙江紅花油茶的親緣關(guān)系。已有研究表明，浙江紅花油茶天然居群間的親緣關(guān)系受基因遺傳與地理環(huán)境的共同作用[20]，所以對于浙江紅花油茶居群間的遺傳距離與實際地理距離之間的關(guān)系研究還有待深入。該實驗結(jié)果為研究福建省浙江紅花油茶的居群間的親緣關(guān)系提供了參考，也為福建省浙江紅花油茶的良種選育與種質(zhì)資源的開發(fā)與利用提供了材料依據(jù)。

［1］莊瑞林.中國油茶［M］.北京：中國林業(yè)出版社，2012：71-72.

［2］祈承經(jīng)，湯庚國.樹木學(xué)（第二版）［M］.中國林業(yè)出版社，2010：304-305.

［3］楊軍，邱日紅，趙文進，等.浙江紅花油茶種質(zhì)資源及開發(fā)利用［J］.現(xiàn)代園藝，2012（9）：12-13.

［4］何方，胡芳名.經(jīng)濟林栽培學(xué)（第二版）［M］.中國林業(yè)出版社，2010：279-280.

［5］劉曲，高煥章，姚小華，等.低海拔地區(qū)浙江紅花油茶無性系樹體性狀變異研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（5）：1105-1108.

［6］蹇黎.分子標記在藥用蘭科植物研究中的應(yīng)用［J］.種子，2015，34（2）：51-53.

［7］靳曉麗，田新會，杜文華.基于ISSR分子標記的鷹嘴豆遺傳多樣性分析［J］.中國草地學(xué)報，2015，37（3）：19-25.

［8］趙謙，杜虹，莊東紅.ISSR分子標記及其在植物研究中的應(yīng)用［J］.2007，5（f11）：123-129.

［9］HAMZA H，BENABDERRAHIM M A，ELBEKKAY M，et al.Investigation of genetic variation in Tunisian date palm（Phoenix dactylifera L.）cultivars using ISSR marker systems and their relationwithfruitcharacteristic［sJ］.TurkishJournalofBiology，2012，18（3）：196-198.

［10］QI S S，F(xiàn)AN Y，GONG Z N，et al.Genetic diversity of Shiraia bambusicola from East China assessed using ISSR makers［J］.Biochemical Systematics and Ecology，2015（59）：239-245.

［11］周蘭英，王湘南，陳永忠，等.油茶種質(zhì)遺傳多樣性的分子標記技術(shù)與EST 文庫構(gòu)建［J］.生命科學(xué)研究，2012，16（6）：557-565.

［12］董斌，李榮喜，黃永芳，等.分子標記在油茶研究中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報2015，31（6）：74-80.

［13］SUN L，ZHENG Y ，Yuan，et al.Genetic diversity of Atractylodes macrocephala by ISSR［J］.China journal of Chinese materia edica，2013，37（22）：3381-3385.

［14］杜明鳳，丁貴杰.不同種源馬尾松ISSR遺傳結(jié)構(gòu)及影響因素分析［J］.廣西植物，2016，36（9）：1068-1075.

［15］周蘭英.油茶種質(zhì)資源多樣性的ISSR分析［D］.湖南師范大學(xué)，2014，

［16］謝薈.黎蒴與廣寧紅花油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性研究［D］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［17］謝云，李紀元，范正琪，等.浙江紅山茶總DNA提取及ISSR-PCR引物篩選［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（25）：15210-15212.

［18］劉揚，彭赟，賀瑞，等.基于ISSR標記的海南油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性分析［J］.分子植物育種，2016（2）：517-523.

［19］彭繼慶，曹福祥，范海燕.博白大果油茶遺傳多樣性的ISSR研究［J］.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報，2013，33（7）：62-66.

［20］劉子雷，姚小華，楊水平，等.浙江紅花油茶果實經(jīng)濟性狀變異的研究［J］.西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，29（4）：83-88.

ISSR Analysis of Genetic Diversity of Camellia chekiangoleosa Hu in Fujian Province

SONG Qian-qian1，2，F(xiàn)U Mao-wang1，2，HE Yi-fan1，2，LIN Wen-jun1，2，CHEN Hui1，2*，ZHENG Guo-hua1，2，LI Yu1，2
（1.College of Forestry，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University；2.Camellia Engineering Technology Research Center，F(xiàn)uzhou 350002，China）

【Objective】The objective of this study was to provide a reference for fully exploiting and utilizing the germplasm resources of Camellia chekiangoleosa Hu in Fujian province.【Method】The genetic diversity of 13 populations of C.chekiangoleosa in Fujian Province was analyzed by ISSR molecular marker technique.【Results】The results showed that 17 primers were obtained and 167 loci were amplified;in addition，polymorphic loci was 142 and the average percentage of polymorphic loci was 85.03%.The genetic distance of 13 populations of C.chekiangoleosa in Fujian province ranged from 0.7451 to 0.9402.The 13 populations of C.chekiangoleosa in Fujian province were divided into four groups by cluster analysis based on genetic distance.【Conclusion】The genetic diversity of C.chekiangoleosa in different areas of Fujian Province was rich and the genetic relationship among populations was significant.

Camellia chekiangoleosa Hu；ISSR；Genetic Diversity；Cluster analysis

S664.2

A

1000-2650（2017）03-0370-05

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.03.013

2017-03-06

福建省科技重大專項(2013NZ0001-1)；福建省科技廳平臺建設(shè)項目(2010N2001）；高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20123515110010)共同資助。

宋倩倩，碩士研究生。*責(zé)任作者：陳輝，教授、博士、博士生導(dǎo)師，主要研究經(jīng)濟林培育。E-mail：zjchchenh@163.com。

（本文審稿：陳盛相；責(zé)任編輯：鞏艷紅；英文編輯：徐振鋒）