實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)NG、UU和CT及MG結(jié)果分析

李美珠，楊潔飛，李啟欣

（佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)NG、UU和CT及MG結(jié)果分析

李美珠，楊潔飛，李啟欣

（佛山市第一人民醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

目的RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)淋病奈瑟菌（NG）、解脲脲原體（UU）、沙眼衣原體（CT）及生殖支原體（MG）結(jié)果。方法選擇我院2016年6月至2017年7月擬診為泌尿生殖道感染患者的宮頸或者尿道分泌物標(biāo)本426例，選擇培養(yǎng)法對(duì)UU、MG及NG病原體進(jìn)行檢測(cè)，選擇膠體金免疫層析法來(lái)對(duì)CT抗原進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)選擇RT-PCR來(lái)對(duì)NG、UU、 MG和CT的核酸進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果在病原體檢出陽(yáng)性率方面，RT-PCR檢測(cè)顯著高于金標(biāo)法或者培養(yǎng)法檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在對(duì)NG、UU、 MG和CT感染進(jìn)行檢查診斷，采用RT-PCR檢測(cè)NG、UU、MG和CT具有非常重要的作用，能對(duì)常規(guī)方法進(jìn)行有效補(bǔ)充，值得臨床推廣和應(yīng)用。

熒光定量PCR；淋病奈瑟菌；解脲脲原體；沙眼衣原體；生殖支原體

非淋菌性尿道炎和淋病是臨床中發(fā)生率較高的性傳播疾病，會(huì)引起女性盆腔炎、宮體炎、不孕、宮頸炎、輸卵管炎和男性前列腺炎、附睪炎、尿道炎等，除此之外還可能引起女性早產(chǎn)、流產(chǎn)和宮頸癌等，會(huì)嚴(yán)重危害患者的生命健康和安全[1]。泌尿生殖道感染的病原體主要為淋病奈瑟菌（NG）、解脲脲原體（UU）、沙眼衣原體（CT），生殖支原體（MG），而病原體常常表現(xiàn)為共同感染狀態(tài)。在臨床表現(xiàn)方面，非淋菌性尿道炎和慢性淋病比較類(lèi)似，臨床中常常不能有效明確診斷。在實(shí)際的臨床診斷中，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法存在一定的不足之處，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)快速發(fā)展和進(jìn)步的過(guò)程中，RT-PCR在臨床中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，該方法具有自動(dòng)化、定量、快速、特異、敏感等特點(diǎn)[2]。本研究主要分析了RT-PCR檢測(cè)NG、UU和CT及MG結(jié)果，現(xiàn)做如下總結(jié)。

1 一般資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院婦科和泌尿外科于2016年6月～2017年7月擬診為泌尿生殖道感染患者的宮頸或者尿道分泌物標(biāo)本425例，男女人數(shù)分別為190例、235例；患者年齡為20～63歲，平均年齡為（41.6±5.2）歲。標(biāo)本采集前應(yīng)對(duì)患者的外生殖器進(jìn)行清潔；在女性尿道口內(nèi)或者女性宮頸口內(nèi)插入無(wú)菌棉拭子，選擇5-10秒后，應(yīng)停留數(shù)秒，密閉無(wú)菌棉拭子，并及時(shí)送檢；男性患者也可以采集按摩后的前列腺液，將其放置在無(wú)菌管內(nèi)密閉，并及時(shí)送檢。

1.2 方法

①試劑選擇：選擇上海仁度生物科技有限公司的NG、UU、CT、MG核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒，選擇珠海黑馬生物工程有限公司的淋病奈瑟菌培養(yǎng)基，選擇珠海麗珠試劑有限公司的沙眼衣原體抗原檢測(cè)試劑盒、解脲脲原體，生殖支原體分離鑒定試劑盒為上海仁度生物科技有限公司所提供。

②RT-PCR檢測(cè)：將拭子標(biāo)本放入1ml生理鹽水浸泡貼壁擠干，取其中0.5ml+0.5尿樣保存液混合。取1.5ml的EP管，每個(gè)項(xiàng)目分別加入400ml混合液，加100ul核酸提取液，搖動(dòng)混合，60℃加熱5分鐘，放室溫10分，將EP管置于磁珠分離架，靜置5分鐘，棄上清，加1ml洗滌液搖混，靜置5分鐘棄上清，重復(fù)一次。吸盡上清液，將EP管移離磁珠裝置，加40ul反應(yīng)液搖動(dòng)混勻備用。吸30ul核酸提取液于微量反應(yīng)管中，再加2.5ul檢測(cè)液，60恒溫10分鐘，42℃平衡5分鐘，即刻加SAT酶10ul，即刻上機(jī)42℃恒溫?cái)U(kuò)增40分。結(jié)果判斷:dt:樣本S型曲線與閾值線交點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)(循環(huán)數(shù))即dt≤35的樣本為陽(yáng)性。dt無(wú)數(shù)值或≥40為陰性。。

③NG、UU、MG培養(yǎng)：在巧克力色瓊脂平板中接種含NG的標(biāo)本，將其放置在二氧化碳恒溫箱中培養(yǎng)18-24小時(shí)，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。在UU液體選擇培養(yǎng)基中接種含UU的標(biāo)本，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)基的顏色從黃色變成紅色，不存在渾濁則表示陽(yáng)性。在改良SP-4液體培養(yǎng)基中接種含MG的標(biāo)本，將其放置在溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)，如果培養(yǎng)無(wú)沉淀，透明，顏色從山紅色轉(zhuǎn)變成黃色，則表示陽(yáng)性。

④金標(biāo)法檢測(cè)CT抗原：根據(jù)試劑盒說(shuō)明來(lái)對(duì)尿液標(biāo)本或者棉拭子標(biāo)本進(jìn)行處理，對(duì)抗原進(jìn)行提取，將5滴提取液滴在檢測(cè)塊的標(biāo)本窗上，15分鐘后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行讀取。如果結(jié)果窗不存在紅線，控制窗存在1條紅線則表示陰性，結(jié)果窗和控制窗均存在紅線則表示陽(yáng)性，結(jié)果窗和控制窗均不存在紅線則表示結(jié)果無(wú)效。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中組間數(shù)據(jù)資料對(duì)比采用t 檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料對(duì)比采用x2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

在病原體檢出陽(yáng)性率方面，RT-PCR檢測(cè)顯著高于金標(biāo)法或者培養(yǎng)法檢測(cè)（P＜0.05），如表1。

表1 檢測(cè)結(jié)果觀察（n）

3 討 論

NG、UU、CT、MG正常情況下不會(huì)導(dǎo)致全身性感染，所以在對(duì)泌尿生殖道感染進(jìn)行常規(guī)時(shí)間是診斷檢查時(shí)，不需要采用血清學(xué)方法來(lái)對(duì)血清中的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，而是采用抗原檢測(cè)或（和）病原體培養(yǎng)[3]。在對(duì)病原體進(jìn)行明確診斷時(shí)，CT細(xì)胞培養(yǎng)法和NG、UU培養(yǎng)基培養(yǎng)法是臨床金標(biāo)準(zhǔn)，然而卻存在一定的不足之處，如費(fèi)時(shí)、操作繁瑣、敏感性低、需要進(jìn)一步堅(jiān)定培養(yǎng)結(jié)果、容易被雜菌污染而對(duì)結(jié)果判斷造成影響等。CT是嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)的寄生微生物，在臨床檢測(cè)中不適合采用細(xì)菌培養(yǎng)，選擇金標(biāo)法對(duì)抗原進(jìn)行檢測(cè)，雖然操作簡(jiǎn)單方便、快速，但是敏感性較差[4]。MG的分離培養(yǎng)難度大，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求較高；臨床研究發(fā)現(xiàn)，MG可能導(dǎo)致女性生殖道炎癥和急慢性非淋菌性尿道炎，和非衣原體性非淋菌性尿道炎發(fā)生的關(guān)系非常密切。

RT-PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上所形成的，選擇熒光基團(tuán)來(lái)對(duì)特異性引物進(jìn)行標(biāo)記，在單管封閉下進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分析，PCR后不需要進(jìn)行電泳處理，選擇計(jì)算機(jī)來(lái)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，并自動(dòng)分析結(jié)果，能對(duì)臨床治療效果和病原體感染進(jìn)行準(zhǔn)確反映，其特點(diǎn)主要為重復(fù)性好、自動(dòng)化、不容易被污染、能定量、快速、特異性和敏感性高等。本研究中，在病原體檢出陽(yáng)性率方面，RTPCR檢測(cè)顯著高于金標(biāo)法或者培養(yǎng)法檢測(cè)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

總之，在對(duì)NG、UU和CT、MG感染進(jìn)行檢查診斷，采用RT-PCR檢測(cè)NG、UU、MG和CT具有非常重要的作用，能對(duì)常規(guī)方法進(jìn)行有效補(bǔ)充，值得臨床推廣和應(yīng)用。

[1] 羅 藝,徐文莉,張洪德等.泌尿生殖系感染患者尿液中沙眼衣原體、淋球菌、解脲脲原體感染分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,37(11):1486-1487,1491.

[2] 馬曉慧.612例泌尿系統(tǒng)感染患者檢測(cè) CT+NG+UU 感染情況分析[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2016,11(18):48-49.

[3] 范雪嬌,呂敏儀,孫 茜等.婦科疾病和不孕癥患者泌尿生殖道感染情況分析[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2017,38(10):1324-1326.

[4] 張志紅,張 娜,李小改等.泌尿系感染患者沙眼衣原體與淋病奈瑟菌和解脲脲原體感染及耐藥狀況調(diào)查[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2017,27(8):1717-1720.

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ISSN.2095-8803.2017.24.110.02