表面復(fù)合修飾磁性顆粒固定化脂肪酶效能研究

趙 芬，胡 飛

（華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

表面復(fù)合修飾磁性顆粒固定化脂肪酶效能研究

趙 芬，胡 飛*

（華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

以表面復(fù)合修飾的納米超順磁性Fe3O4顆粒聚集體為載體固定胰脂肪酶，比較分析固定化脂肪酶的固載效能及酶學(xué)特性，研究了固定化及游離脂肪酶的最適溫度和pH值、不同環(huán)境下的操作穩(wěn)定性等應(yīng)用特性及基本動力學(xué)特征。結(jié)果表明：在室溫下脂肪酶質(zhì)量濃度為4.01 mg/mL時具有最大的固載酶量0.72 mg/10 mg，固定化脂肪酶最適作用pH為6，最適溫度35℃，與游離脂肪酶相比，對酸性環(huán)境pH的變化更敏感，但具有更廣泛的溫度耐受性。固定化脂肪酶催化水解Lineweaver-Burk曲線線性相關(guān)，米氏常數(shù)Km值為9.65 g/mL，遠(yuǎn)高于游離脂肪酶，親和性弱于游離脂肪酶。固定化脂肪酶重復(fù)催化反應(yīng)7次，相對酶活力仍剩余51.6%，半衰期為6.2次，重復(fù)操作較穩(wěn)定。

脂肪酶；磁性顆粒；固定化；酶效能

0 引言

固定化酶可回收利用且易于分離，與游離酶相比具有高效的催化性能以及更優(yōu)的環(huán)境適應(yīng)性，在工業(yè)生產(chǎn)中具有獨特而高效的應(yīng)用[1]。常用的固定化酶載體材料包括聚合物材料[2]、無機材料[3]和復(fù)合材料[4]等，載體材料在很大程度上與固定化酶的應(yīng)用功效密切相關(guān)。磁性納米顆粒作為一種固定化酶新載體，在添加磁場后可以分離固定化酶，具有顯著的回收和儲存優(yōu)勢。這種載體的核心由磁性納米顆粒聚集而成，通過分子修飾技術(shù)，可以在顆粒體系引入多種反應(yīng)性功能基團(tuán)，從而連接酶增強結(jié)構(gòu)，同時表面包覆有機或無機分子的殼，促進(jìn)酶的固定化和效能的發(fā)揮[5]。

脂肪酶（Lipase，三?；视王；饷福┠艽呋视腿ズ铣珊退?，廣泛應(yīng)用于食品、日用化工以及醫(yī)藥等方面[6]。然而，游離脂肪酶在較多應(yīng)用環(huán)境下存在催化效率較低、環(huán)境適應(yīng)性較苛刻、難以實現(xiàn)過程連續(xù)化等不足[7-8]。為了實現(xiàn)脂肪酶的高效利用，采用固定化技術(shù)是一種行之有效的途徑。

作者在表面復(fù)合修飾的磁性Fe3O4顆粒聚集體為載體固定化脂肪酶（來自豬胰）產(chǎn)品的基礎(chǔ)上，以游離脂肪酶為參照，比較分析了固定化脂肪酶的酶學(xué)特性及催化水解動力學(xué)特征，旨在為脂肪酶的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磁性Fe3O4顆粒聚集體載體材料：實驗室自制；戊二醛（V/V，25%）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯醇（PVA）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；豬胰脂肪酶、考馬斯亮藍(lán)G250：上海博奧科技有限公司，生物純；橄欖油：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，化學(xué)純。

1.2 主要儀器設(shè)備

pHS-25型酸度計：上海虹益儀器儀表有限公司；752N紫外可見分光光度計：廣州市化興科學(xué)儀器有限公司；BAS124S分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（德國）有限公司；PTFE水熱合成反應(yīng)釜：上海耀冠儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 表面復(fù)合修飾Fe3O4磁性納米顆粒聚集體載體材料

采用文獻(xiàn)[9]的方法，制備復(fù)合修飾納米超順磁性Fe3O4@SiO2-DES的磁性納米顆粒聚集體。

1.3.2 胰脂肪酶固定化

采用戊二醛交聯(lián)法固定化脂肪酶[10]，稱取10 mg磁性納米顆粒，洗滌并用磁鐵分離后分散在2 mL 4%(V/V)的戊二醛溶液中超聲波處理10 min，室溫下（25℃）振蕩交聯(lián)反應(yīng)1 h，取沉淀物用磷酸緩沖液洗滌至無游離戊二醛，分別加入4 mL質(zhì)量濃度為 0.5、1、2、3、4、10 g/L 的脂肪酶稀釋酶液，室溫下攪拌固定化3 h，磁性分離，取上清液檢測酶活力。

1.3.3 酶活力及固載量測定

測定上述不同濃度的固定化酶相對酶活力以及固載量，考察酶濃度對固定化脂肪酶活力及載體固載能力的影響。其中，酶濃度參照考馬斯亮藍(lán)法[11]測定。脂肪酶活力測定參照 GB/T 23535—2009的方法[12]，相對酶活力以同組試驗中酶活力最高值為100%，用測定值與最高值的百分比表示。

固載量（mg/10 mg）=（CO-CL）×V，

式中：V為酶液體積，CO為初始酶濃度，CL為固定化后酶濃度。

1.4 復(fù)合修飾磁性納米顆粒聚集體固定化脂肪酶的酶學(xué)特性

1.4.1 最適pH值和pH穩(wěn)定性

以25%（V/V）橄欖油乳化液為底物[13]，分別取10 mg固定化脂肪酶于pH值4～9的磷酸緩沖液中40℃水浴，保溫2 h后降至室溫，測定酶活力，研究酶的pH穩(wěn)定性以及最適pH值。同時取游離脂肪酶做相同處理，作為對比。

1.4.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

以25%（V/V）橄欖油乳化液為底物，分別取10 mg固定化脂肪酶于pH值7.5的磷酸緩沖液中，在30～55℃的水浴下，保溫2 h后降至室溫，測定酶活力，研究酶的溫度穩(wěn)定性以及最適溫度。同時取游離脂肪酶做相同處理，作為對比。

1.4.3 固定化脂肪酶催化水解的基本動力學(xué)

以橄欖油乳化液為底物，分別配制PVA體積分?jǐn)?shù)為 0.2、0.25、0.3、0.4、0.5（對應(yīng)質(zhì)量濃度分別為 0.46、0.37、0.27、0.23、0.18 g/mL） 的底物溶液，在適宜的pH和溫度下測定底物濃度變化。根據(jù)酶催化水解 Lineweaver-Burk理論[14]， 由 1/V=（Km/Vmax）（1/[S]）+1/Vmax，可得動力學(xué)特征參數(shù)。其中，V為酶催化速率，Vmax為酶被底物飽和時的反應(yīng)速率，Km為米氏常數(shù)，[S]為底物濃度。

1.4.4 固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性

固定化脂肪酶在pH值7.5的磷酸緩沖液中40℃下，以25%（V/V）橄欖油乳化液為底物催化反應(yīng)15 min，磁性分離后測定酶活力。經(jīng)過磁性分離的固定化脂肪酶再重復(fù)上述條件下的催化反應(yīng)，循環(huán)催化7個批次，每次結(jié)束后均測定酶活力。以首次酶活力為100%，其他值與最高值的相對百分比為相對酶活力，評價固定化酶的重復(fù)使用性[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化脂肪酶的酶活力及固載量測定

6組脂肪酶的質(zhì)量濃度分別為 0.42、0.60、0.84、1.20、1.64、4.01 mg/mL，由圖 1 可知，在質(zhì)量濃度為0.42、0.60 mg/mL時，酶的固載量分別為0.072、0.22 mg/10 mg，相應(yīng)的相對酶活力分別為29.59%、36.22%。脂肪酶的質(zhì)量濃度0.42～1.64 mg/mL時，固載量隨酶質(zhì)量濃度逐漸越大，相對酶活力隨固載量的增加而增加，在質(zhì)量濃度高于1.20 mg/mL時，固載量隨質(zhì)量濃度而增加的速度變緩，質(zhì)量濃度4.01 mg/mL時具有最大的相對酶活力和固載酶量0.72 mg/10 mg?？紤]固定化酶的穩(wěn)定性及應(yīng)用成本等因素，脂肪酶固定化選擇質(zhì)量濃度1.0～2.0 mg/mL為宜。

圖1 酶質(zhì)量濃度對固定化酶酶活力及固載量的影響Fig.1 Effect of lipase mass concentrate on activity and loading content of immobilized enzyme

2.2 最適pH值和pH穩(wěn)定性

由圖2可知，固定化脂肪酶的最適pH值為6，游離酶的最適pH值為7。偏離最適pH值時兩者的活力均急劇下降，但固定化酶在峰值曲線左端活力下降幅度更顯著，在pH 5時只能保持約50%的相對活力。說明脂肪酶經(jīng)固定化后，酶作用時最適pH環(huán)境向酸性端轉(zhuǎn)移，且對pH值變化更為敏感。

由圖3可知，固定化酶和游離脂肪酶在不同pH值緩沖溶液保溫2 h后降溫，游離脂肪酶相對活力變化平緩，尤其在pH值5～9范圍內(nèi)具有優(yōu)良的pH穩(wěn)定性。固定化脂肪酶活力下降明顯，說明其在儲藏或保持狀態(tài)下對酸堿的耐受性較差。這是因為復(fù)合修飾的顆粒載體固定化脂肪酶對酶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，部分酸堿敏感性中心對酸堿更為敏感，當(dāng)pH值發(fā)生改變時，酶的活性發(fā)生較大改變。

圖2 pH對游離酶和固定化酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on relative activity of free and immobilized lipase

圖3 游離酶和固定化酶的pH穩(wěn)定性Fig.3 The pH stability of free and immobilized lipase

2.3 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

由圖4可知，固定化脂肪酶和游離脂肪酶在35℃和40℃時相對酶活力最大。在35～55℃范圍內(nèi)，固定化脂肪酶相對酶活力變化較平緩，最低可保持在66.0%以上，遠(yuǎn)高于游離脂肪酶的28.2%。在低于35℃或40℃時，兩種酶的相對活力均急劇下降，說明兩種酶適合作用在較高溫度范圍內(nèi)，其中固定化脂肪酶的作用溫度適應(yīng)范圍更廣。

由圖5可知，在20～55℃的范圍內(nèi)保溫處理后降溫，固定化脂肪酶在各溫度下的相對酶活均高于游離脂肪酶，隨溫度升高固定化脂肪酶酶活力下降較游離脂肪酶緩慢。在55℃時仍有29.4%的相對活力，而游離脂肪酶此時基本失活，說明脂肪酶經(jīng)固定化處理后熱穩(wěn)定性提高，這主要是由于酶和載體結(jié)合使酶的天然構(gòu)象難于伸展打開，從而提高了固定化酶的熱穩(wěn)定性[16]，實用價值頗高。

圖4 溫度對游離酶和固定化酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on relative activity of free and immobilized lipase

圖5 游離酶和固定化酶活力的溫度穩(wěn)定性Fig.5 The temperature stability of freeand immobilized lipase

2.4 酶催化水解基本動力學(xué)

固定化脂肪酶和游離脂肪酶催化水解V-[S]曲線及Lineweaver-Burk曲線如圖6和圖7所示，水解特征方程及參數(shù)如表1所示。

由圖6和圖7可知，固定化和游離脂肪酶的酶解速度在底物質(zhì)量濃度0.18～0.46 g/mL范圍內(nèi)均隨底物質(zhì)量濃度增加而增加，速率勻速增長，近似線性相關(guān)。游離脂肪酶的催化水解速率略高于固定化脂肪酶，但當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度較高時（0.46 g/mL），固定化脂肪酶的水解速率非常接近游離脂肪酶，表明在較高的底物濃度時固定化酶會有更好的性能體現(xiàn)。

通過Lineweaver-Burk曲線擬合回歸線性方程，同時獲取特征參數(shù)Km。由表1可知，游離脂肪酶和固定化脂肪酶的Km值分別為1.92、9.65 g/mL，固定化脂肪酶的Km值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于游離脂肪酶，說明固定化酶的親和力低于游離酶。這是由于酶分子經(jīng)固定化后不能自由運動，載體的存在增大了酶周圍的空間位阻，從而使固定化酶的親和力降低[17]。

圖6 固定化酶和游離酶的V-[S]曲線Fig.6 V-[S]curves of free and immobilized enzyme

圖7 固定化酶和游離酶的1/V-1/[S]曲線Fig.7 Lineweaver-Burk curves of free and immobilized enzyme

表1 固定化脂肪酶和游離脂肪酶的催化水解模型及特征參數(shù)Table 1 Mathematical models and parameters of immobilized lipase and free lipase hydrolysis

2.5 固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性

以殘余酶活的負(fù)對數(shù)與重復(fù)使用次數(shù)作圖，直線的斜率即為酶失活常數(shù)。由圖8可知，固定化脂肪酶經(jīng)重復(fù)催化反應(yīng)7次后，酶活力下降較平穩(wěn)，最終仍有51.6%的相對酶活力。根據(jù)擬合方程，酶失活速率常數(shù)為0.111 7，操作半衰期為6.2次，誤差小于0.46%。因此，脂肪酶經(jīng)復(fù)合修飾磁性納米顆粒聚集體固定化后，與載體的結(jié)合較好，不易脫落導(dǎo)致酶活降低，重復(fù)操作使用較穩(wěn)定[18]。

圖8 固定化酶的循環(huán)操作穩(wěn)定性Fig.8 The recycle stability of immobilized enzyme

3 結(jié)論

采用表面復(fù)合修飾的納米超順磁性Fe3O4顆粒為載體固定脂肪酶，以游離脂肪酶為參照，較系統(tǒng)地研究了固定脂肪酶的固載效能及酶學(xué)特性，以及不同環(huán)境下的操作穩(wěn)定性和基本動力學(xué)特征。研究結(jié)果表明：固載量隨酶質(zhì)量濃度增大而增大，在本試驗的脂肪酶質(zhì)量濃度梯度下，酶質(zhì)量濃度為4.01 mg/mL時具有最大的固載酶量0.72 mg/10 mg。固定化脂肪酶在pH值6、35℃的條件下具有最大的酶活力，與游離脂肪酶相比，對酸性環(huán)境pH的變化更敏感，在儲藏或保持狀態(tài)下對酸堿的耐受性較差，但具有更廣泛的溫度耐受性。固定化脂肪酶活力在底物質(zhì)量濃度0.18～0.46 g/mL范圍內(nèi)隨底物質(zhì)量濃度增加而勻速增加，Lineweaver-Burk曲線線性相關(guān)，米氏常數(shù)Km值為9.65 g/mL，遠(yuǎn)高于游離脂肪酶，親和性弱于游離脂肪酶。固定化脂肪酶在較高的底物質(zhì)量濃度時具有更好的催化速度，固定化脂肪酶重復(fù)催化反應(yīng)7次，相對酶活力仍剩余51.6%，半衰期為6.2次，重復(fù)操作較穩(wěn)定。

［1］李麗娟，馬貴平，趙林果.固定化酶載體研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2015（11）:105-113.

［2］吳漢福，杜海良，龔曉瑩，等.用于酶固定化的高分子載體材料研究進(jìn)展［J］.云南化工，2008，35（3）:46-48.

［3］王建芝.功能化磁性納米材料的制備及其固定化酶的研究［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2015.

［4］田程程.新型多功能納米復(fù)合材料的合成及其催化性能研究［D］.上海：華東理工大學(xué)，2014.

［5］劉健.多功能磁性納米復(fù)合材料的合成、表征及其在生物檢測和催化反應(yīng)中的應(yīng)用［D］.蘭州：蘭州大學(xué)，2014.

［6］李陽，韋偉，曹茜，等.脂肪酶固定化新材料［J］.中國糧油學(xué)報，2014，29（7）:122-127.

［7］王華，王瑩，詹長娟，等.脂肪酶固定化工藝優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)研究［J］.食品研究與開發(fā)，2015，36（21）:118-123.

［8］VAIDYA B K，INGAVLE G C，PONRATHNAM S，etal.Immobilization ofCandida rugosa lipase on poly （allylglycidylether-coethylene glycoldimethacrylate） macroporous polymer particles［J］.Bioresource Technology，2008，99（9）:3623-3629.

［9］孫寧，胡飛.超順磁性顆粒表面復(fù)合修飾及用于固定化 α-淀粉酶載體的效果［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2016，32（11）:290-294.

［10］ LING G，WEI H，TANG S，et al.A novel deep eutectic solvent for biodiesel preparation using a homogeneous base catalyst［J］.Chemical Engineering Journal，2015，259:647-652.

［11］祖昕，杜凱，曹方，等.有機溶劑處理提高固定化脂肪酶活性及穩(wěn)定性［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2016（1）:89-94.

［12］江慧芳，王雅琴，劉春國.三種脂肪酶活力測定方法的比較及改進(jìn)［J］.化學(xué)與生物工程，2007 ，24（8）:72-75.

［13］劉娟，楊楠楠，姜愛莉.固定化脂肪酶的制備及其酶學(xué)性質(zhì)的研究［J］.中國油脂，2013，38（1）:44-47.

［14］張樹政.酶制劑工業(yè)（上）［M］.北京:科學(xué)出版社，1984:375-377.

［15］ DANDAYUDHAM R，RAMANVK，VENKATESH R，etal.Magnetic nano-particlesas versatile carriers for immobilization of laccase［J］.Research Journal of Engineering &Technology，2013，4（4）:279-283.

［16］SAGIROGLU A.Conversion of sunflower oil to biodieselby alcoholysis using immobilized lipase［J］.Artificial Cells Blood Substitutes and Biotechnology，2008，36（2）:138-149.

［17］王苗苗，李群艷，韋奇，等.介孔 SiO2/Fe3O4中空磁性微球的漆酶固定化［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2013，34（2）:299-305.

［18］孫寧，胡飛.表面復(fù)合修飾納米超順磁性材料固定化α-淀粉酶性能研究［J］.食品工業(yè)科技，2017（2）：231-234.

PERFORMANCE OF LIPASE IMMOBILIZED BY SURFACE COMPOSITE MODIFIED MAGNETIC PARTICLE AGGREGATES

ZHAO Fen，HU Fei
（School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The immobilized enzyme is recyclable and easy to separate，which has high catalytic performance and better environment adaptability compared with the free enzyme. The application performance of immobilized and free lipase were investigated in the present study. Lipase was immobilized by the method of covalent linkage with the composite-modified nano-superparamagnetic Fe3O4particle aggregates as the carrier. The optimum temperature，pH value，the operation stability and the basic kinetics of the afforded immobilized lipase were compared with the free lipase respectively. The results showed that the maximum loading amount of immobilized enzyme was 0.72 mg/10 mg when the lipase concentration was 4.01 mg/mL at room temperature，and the optimum pH and temperature were 6 and 35 ℃. respectively. Compared with free lipase，immobilized lipase was more sensitive to the pH in acid environment，but had a wider range of temperature tolerance. The Lineweaver-Burk curve of immobilized lipase catalyzed hydrolysis was linear correlation. Km value of immobilized lipase was 9.65 g/mL，which was much higher than that of free lipase，and the affinity was weaker than free lipase. The relative activity of immobilized enzyme （lipase）was still remaining 51.6% after 7 times recycle use，the half-life period was 6.2 times and the repetitive operation was stable.

lipase；magnetic particle；immobilization；enzymatic property

TS 201.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

1673-2383(2017)05-0011-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.006.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-10-30 9:36:32

2017-04-06

趙芬（1994—），女，湖南張家界人，碩士研究生，研究方向為谷物化學(xué)。

*通信作者