7個變異紅葉杜仲葉片色素及活性成分分析

杜慶鑫 慶 軍 朱景樂 杜紅巖 杜蘭英*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，鄭州 450003； 2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，鄭州 450003)

7個變異紅葉杜仲葉片色素及活性成分分析

杜慶鑫1,2慶 軍1,2朱景樂1,2杜紅巖1,2杜蘭英1,2*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，鄭州 450003；2.國家林業(yè)局杜仲工程技術(shù)研究中心，鄭州 450003)

為探討不同變異類型紅葉杜仲葉片呈色機理及活性成分含量，以7個不同變異紅葉杜仲和綠葉杜仲為材料，對葉片顏色、色素分布、含量及活性成分含量進行測定分析。結(jié)果表明：7個變異紅葉杜仲葉片正面呈暗紅或紫紅色，柵欄組織呈紅色或暗紅色；背面顏色3、5和6號呈紅色，下表皮也呈紅色，1、2、4和7號為綠色，下表皮透明；7個變異紅葉杜仲葉片Ca、Cb和CT含量均低于對照杜仲葉片，而CCar、CF含量以及CCar/CT、CF/CT值均顯著高于對照葉片，葉片色素含量在7個紅葉杜仲間也存在一定差異；7個變異紅葉杜仲葉片5種活性成分含量均較高，且綠原酸、京尼平苷和總黃酮含量明顯高于對照杜仲葉片。葉片中CF分布、含量及CF/CT值是紅葉杜仲呈色差異的主要原因，高活性成分含量使其在藥用方面有很大的開發(fā)利用潛力。本研究可為觀賞兼藥用杜仲資源選育提供材料。

紅葉杜仲；葉片；色素；活性成分

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)為杜仲科(Eucommiaceae)杜仲屬(Eucommia)植物，是我國特有的名貴藥材樹種，同時可以改善生態(tài)環(huán)境，增加碳匯，具有很高的經(jīng)濟價值[1～2]。國內(nèi)外學(xué)者對杜仲育種、栽培及綜合利用技術(shù)進行了長期系統(tǒng)研究，極大地促進了杜仲產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，特別是杜仲葉片的開發(fā)利用日益受到重視，以杜仲葉片為原料在食品、保健品、飼料添加劑及化妝品等領(lǐng)域開發(fā)出的系列產(chǎn)品備受市場青睞[3～4]。為了加速我國葉用杜仲良種選育進程，更好地開發(fā)利用葉用杜仲資源，中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心選育出“華仲11號”、“華仲12號”及“密葉杜仲”葉用型杜仲良種[5]，西北農(nóng)林科技大學(xué)選育出“秦仲1～4號”葉、皮兼用型杜仲良種[6]。

紅葉杜仲是近年來發(fā)現(xiàn)的葉片變異型杜仲，其葉片呈紅色或紫紅色，樹形優(yōu)美，適應(yīng)性較強，是園林綠化的首選樹種之一；另一方面，紅葉杜仲葉片中活性成分含量對其藥用價值有重要影響。目前有關(guān)紅葉杜仲葉片結(jié)構(gòu)、色素及活性成分含量的研究較少。本文以7個不同變異紅葉杜仲和普通綠葉杜仲為材料，通過對葉片顏色、葉片結(jié)構(gòu)特征觀察以及葉片色素含量測定，探討其呈色差異的原因和機理，同時，對葉片中活性成分含量進行測定，進一步探究其藥用價值，以期為紅葉杜仲觀賞價值、藥用價值及新品種選育提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

試驗材料：7個不同變異的紅葉杜仲和普通綠葉杜仲葉片均采自中國林科院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心試驗基地一年生嫁接苗，低溫冷藏帶回實驗室進行拍照和徒手切片實驗；葉片色素和活性成分含量測定的樣品采用低溫干燥并研磨成粉。普通綠葉杜仲葉片為對照(CK)。

儀器：MICROTEK掃描儀(上海中晶科技有限公司)；低溫冷凍干燥機(LABCONCO)；恒溫水浴搖床(美國精騏)；OLYMPUS-BX51型光學(xué)顯微鏡(日本奧林巴斯)；JA-3003千分之一天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；Cary 300紫外-可見分光光度計(美國安捷倫)；Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津)；SPD-20A紫外檢測器(日本島津)；AG135型十萬分之一電子天平(METILER TOLEDO)；HT-300BQ型數(shù)控超聲波清洗器(濟寧恒通超聲電子設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 葉色及葉片結(jié)構(gòu)觀察

8份杜仲材料葉片均在成熟期采集，利用MICROTEK掃描儀對葉片正面、背面掃描并拍照，觀察葉色差異。葉片結(jié)構(gòu)觀察采用改進徒手切片法[7]，雙刀片緊壓并排切取葉片中部帶葉脈的部分，用濕毛筆輕輕從刀口取下，放入盛水培養(yǎng)皿中，挑選好的切片轉(zhuǎn)移至滴水的載玻片上，用顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 葉片色素含量測定

采用直接浸取法[8]提取葉綠素和類胡蘿卜素含量，稱量干燥葉片粉末0.100 g，加入80%丙酮10 mL，置于黑暗處浸取72 h，然后取上清液，分別測定445、644、662 nm處的吸光度值。采用直接法吸收光譜[9]測定花色苷含量，稱量干燥葉片粉末0.100 g，加入1% HCl甲醇溶液10 mL，置于32℃恒溫水浴搖床5 h，過濾，以1% HCl甲醇溶液定容到10 mL，分別測定530、657 nm處吸光度值。每份材料重復(fù)3次，葉片色素含量計算方法如下：

葉綠素a(Ca)=(9.78×A662-0.99×A644)V/(W1000)；

葉綠素b(Cb)=(21.4×A644-4.65×A662)V/(W1000)；

總?cè)~綠素(CT)=Ca+Cb；

類胡蘿卜素(CCar)=(4.69×A445)V/(W1000)-0.268×(Ca+Cb)；

花色苷(CF)=(A530-0.25×A657)V/(W1000)。

式中：A為吸光度值，C為色素濃度(mg·g-1)，V為提取液體積(mL)，W為樣品干質(zhì)量(g)。

1.2.3 葉片活性成分含量測定

采用AlCl3顯色法[10]測定葉片中總黃酮含量，采用HPLC法[11]測定葉片中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸及京尼平苷的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對結(jié)果進行初步分析，采用SPSS進行ANOVA分析和Duncan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片顏色及結(jié)構(gòu)差異

7個紅葉和對照杜仲葉片正面及背面顏色見圖1。1、2和4號杜仲葉片正面呈暗紅色，背面為綠色；7號杜仲葉片正面呈紫紅色，背面為綠色；3、5和6號杜仲葉片正面和背面均呈紫紅色， 5號杜仲葉脈也呈紅色。對照杜仲葉片正面和背面均為綠色。7個紅葉和對照杜仲葉片徒手切片觀測結(jié)果見圖2。8個杜仲葉片海綿組織均為綠色。1、2和4號杜仲葉片柵欄組織呈暗紅色，下表皮透明；7號杜仲葉片柵欄組織呈亮紅色，下表皮透明；3號杜仲葉片柵欄組織和下表皮呈淺粉色，顏色較淡；5和6號杜仲葉片柵欄組織和下表皮均呈亮紅色，顏色較深。對照杜仲葉片柵欄組織為為綠色，上下表皮透明。

圖1 杜仲葉片正面和背面顏色Fig.1 The front of blade and back of E.ulmoides leaves

圖2 杜仲葉片徒手切片圖(10×)Fig.2 Free-hand sections of E.ulmoides leaves(10×)

2.2 葉片光合色素含量差異

供試杜仲葉片色素含量見表1。7個紅葉和對照杜仲葉片色素含量均存在極顯著差異(P<0.01)。對照杜仲葉片Ca、Cb和CT含量均為最高，且Cb含量顯著高于7個紅葉杜仲Cb含量，7個紅葉杜仲中，5號杜仲葉片Ca、Cb和CT含量均為最低，且顯著低于其它6個紅葉杜仲葉片。對照杜仲葉片CCar和CF含量最低，且顯著低于7個紅葉杜仲CCar含量，6號杜仲葉片CCar(0.81 mg·g-1)和CF(0.95 mg·g-1)含量最高，其次是7號(0.66和0.89 mg·g-1)。2、5、6和7號杜仲葉片Car/CT值顯著高于其他杜仲葉片；5號杜仲葉片CF/CT值最大，且顯著高于其它杜仲葉片，其次是6和7號；8個杜仲葉片中，CF/CT值均比Car/CT值大。

表1 杜仲葉片色素含量

注：**表示P<0.01水平上差異顯著，數(shù)值后面同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note:**means significant difference atP<0.01,different letters in the same column behind value mean significant difference(P<0.05),the same as below.

表2 杜仲葉片活性成分含量

2.3 葉片活性成分含量差異

供試杜仲葉片活性成分含量見表2。7個紅葉和對照杜仲葉片活性成分含量均存在極顯著差異(P<0.01)。對照杜仲葉片桃葉珊瑚苷(29.94 mg·g-1)和京尼平苷酸(11.13 mg·g-1)含量最高，且顯著高于7個紅葉杜仲葉片含量，1號和6號杜仲葉片桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸含量也較高；5號杜仲葉片綠原酸含量達到了74.76 mg·g-1，顯著高于其他杜仲葉片，其次是3號(63.24 mg·g-1)；京尼平苷含量以5號(1.82 mg·g-1)和4號杜仲葉片(1.81 mg·g-1)最高，且顯著高于其他6個杜仲葉片中含量；1號杜仲葉片總黃酮含量(28.37 mg·g-1)最高，且顯著高于其他7個杜仲葉片中含量；總活性成分含量以5號杜仲葉片(119.45 mg·g-1)最高，其次是1號(107.54 mg·g-1)和3號(106.11 mg·g-1)。

3 討論

葉片細(xì)胞色素種類、分布及含量是影響彩葉植物葉片呈色的重要因素，同時，光照、溫度、礦質(zhì)營養(yǎng)及水分等環(huán)境因子對葉色變化也有重要影響[12]。本研究試驗材料均取自同一地點，立地及管理條件相一致，因此，葉片呈色差異可能是受色素種類、分布及含量的影響。李亞蒙等[13]研究發(fā)現(xiàn)，葉片中花色苷的分布對葉片呈色有重要的影響，葉片不同組織中，花色苷的分布范圍存在差異，導(dǎo)致葉片外觀上呈現(xiàn)一定的差異。本研究通過對7個變異紅葉和1個綠葉(CK)杜仲葉片解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，1、2、4和7號杜仲葉片花色苷集中分布于柵欄組織中，但是分布范圍有一定的差異，2和7號分布范圍較廣，其葉片顏色相對于1、4號顏色較深；3、5和6號杜仲葉片花色苷在柵欄組織中分布較多，下表皮也有有少量分布，因此葉片正面和背面均呈現(xiàn)紅色。對照杜仲葉片花色苷分布少，且柵欄組織和海綿組織葉綠素較多，故葉片正面、背面均呈綠色。

張敏等[14]研究發(fā)現(xiàn)，葉片顏色受CCar/CT值和CF/CT值綜合影響，2個比值均較小時，葉片呈綠色；當(dāng)CF/CT值增加占優(yōu)勢時，葉片呈紅色或紫紅色；當(dāng)CCar/CT值增加占優(yōu)勢時，葉片呈黃色。本研究中，通過對7個紅葉和1個綠葉(CK)杜仲葉片葉綠素、類胡蘿卜素和花色苷的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)紅葉杜仲葉片花色苷含量、CCar/CT值以及CF/CT值都顯著高于對照杜仲葉片，而葉綠素含量顯著低于對照杜仲葉片，且紅葉杜仲葉片CF/CT值較CCar/CT值高，占據(jù)優(yōu)勢，是紅葉杜仲葉片呈色的主要原因。該結(jié)論與胡敬志在楓香因CF/CT值較高而使葉片呈紅色的研究相一致[15]。此外，5、6和7號杜仲葉片花色苷含量以及CF/CT值明顯高于其他紅葉杜仲，因此其葉片顏色較其他杜仲葉片深，呈現(xiàn)紫紅色。

杜仲葉片已被2005版《中國藥典》(一部)收錄為杜仲藥材，通過對杜仲葉片中活性成分含量測定，發(fā)現(xiàn)7個紅葉杜仲葉片各活性成分及總活性成分含量均較高，具有較高的藥用價值。1、3、5和7號杜仲葉片總活性成分含量明顯高于其他杜仲葉片。紅葉杜仲葉片綠原酸、京尼平苷、總黃酮含量均明顯高于對照杜仲葉片，其中，3和5號杜仲葉片綠原酸含量是對照杜仲葉片的2倍多，含量極高，開發(fā)利用價值很大。紅葉杜仲葉片中較高的活性成分含量有助于提高杜仲藥材的品質(zhì)。在今后葉用杜仲育種及栽培工作中，應(yīng)加大對紅葉杜仲的研究，充分發(fā)揮紅葉杜仲具有的獨特的觀賞價值和藥用價值。

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National “twelve five” scienticific and technological project(2012BAD21B0502)

introduction：DU Qing-Xin(1991—),male,Master,Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry.

date:2017-01-06

PigmentsandActiveIngredientsinLeavesofSevenEucommiaulmoidesVariation-types

DU Qing-Xin1,2QING Jun1,2ZHU Jing-Le1,2DU Hong-Yan1,2DU Lan-Ying1,2*

(1.Non-timber Forest Research and Development Center of Chinese Academy of Forestry,Zhengzhou 450003；2.The Eucommia Engineering Research Center of National Forestry Administration,Zhengzhou 450003)

The experiment was conducted to investigate the formation reasons for different colors and the active ingredients content of red leafEucommiaulmoidesvariation-types. With seven red leafE.ulmoidesvariation-types and one green leafE.ulmoides, the color, pigments distribution and content, and active ingredients content in leaf were determined. The front of blade was dark red or purple red of seven red leafE.ulmoidesvariation-types, and the palisade tissue was red or dark red. The backs of No.3, 5 and 6 were red with red lower epidermis, and those of No.1, 2, 4 and 7 were green with transparent lower epidermis. The contents ofCa,CbandCTin seven red leaf were lower than those of in control check leaf, whileCCar,CFcontent and the value ofCCar/CTandCF/CTwere significantly higher than those of in control check leaf, and there were the differences of pigment content between seven red leaf. Five kinds of active ingredients content were high in seven red lea, and the contents of chlorogenic acid, geniposide, and total flavonoids were higher than those of in control check. The distribution and content ofCFand the value ofCF/CTwere the main reasons for different colors of seven red leaf, and the high content of active ingredients made it of great potential in the utilization of medicine. This study would provide materials for ornamental and medicineE.ulmoidesresources.

red leafEucommiaulmoidesvariation-types;leaf;pigments;active ingredients

國家“十二五”科技支撐計劃(2012BAD21B0502)

杜慶鑫(1991—)，男，碩士研究生，主要從事杜仲育種與栽培。

* 通信作者： E-mail：dly371@126.com

2017-01-06

* Corresponding author：E-mail：dly371@126.com

Q949.751.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.019