西藏地區(qū)雪層杜鵑遺傳多樣性的AFLP分析

徐靜靜 趙 冰* 張良英 申惠翡 李厚華

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，楊陵 712100； 2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，林芝 860114)

西藏地區(qū)雪層杜鵑遺傳多樣性的AFLP分析

徐靜靜1趙 冰1*張良英2申惠翡1李厚華1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，楊陵 712100；2.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，林芝 860114)

采用AFLP技術(shù)對西藏地區(qū)雪層杜鵑(Rhododendronnivale)5個天然種群135份材料進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳分化研究。篩選得出的6對引物共擴(kuò)增產(chǎn)物273條DNA片段，擴(kuò)增多態(tài)位點百分率為85.71%。5個雪層杜鵑種群的遺傳多樣性指標(biāo)表現(xiàn)了相似的變化趨勢，Nei基因多樣性指數(shù)(h)和Shannon信息指數(shù)(I)的變化趨勢一致，均為工布江達(dá)縣種群<米林種群<嘎隆拉種群<色季拉山種群<紅拉山種群。POPGENE分析結(jié)果表明雪層杜鵑在物種水平(PPL=85.71%，I=0.415 1，h=0.273)具有較高的遺傳多樣性，種群水平(PPL=62.26%，I=0.280 3，h=0.184 1)的遺傳多樣性較低。AMOVA分析結(jié)果表明36%的遺傳變異存在于種群間，64%的遺傳變異存在于種群內(nèi)，雪層杜鵑種群間的遺傳分化系數(shù)(Gst=0.324)與AMOVA分析得到的遺傳變異分布結(jié)果一致。UPGMA聚類結(jié)果說明雪層杜鵑的遺傳距離與地理距離和海拔高度沒有明顯的相關(guān)性。綜合分析，引起雪層杜鵑的遺傳變異的原因可能是地理環(huán)境不同和種群的生境類型差異。最后就雪層杜鵑的合理開發(fā)和保護(hù)提出建議。

西藏；雪層杜鵑；遺傳多樣性；AFLP；種群

西藏及其周邊地區(qū)是世界上高山植物最豐富的地區(qū)，為野生杜鵑花資源提供了最好的生態(tài)環(huán)境，與云南和四川共同形成了杜鵑花世界分布中心[1～2]。雪層杜鵑(Rhododendronnivale)是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(Rhododendron)的常綠小灌木，枝葉具有特殊的芳香氣味，主要分布于海拔3 200～5 490 m的灌叢中，是西藏分布較廣泛的杜鵑花類型之一，也是分布到林區(qū)最外緣的主要杜鵑花種群之一[3]。目前，有關(guān)西藏地區(qū)雪層杜鵑的研究較少，相關(guān)研究主要集中于植物群落研究[4]和化學(xué)成分研究[3]，然而對雪層杜鵑遺傳多樣性研究未見報道。雪層杜鵑不僅具有分布范圍廣、海拔高的優(yōu)點，而且具有較高的觀賞價值，可用于林緣配植，對雪層杜鵑的遺傳多樣性的研究對該種質(zhì)的開發(fā)利用和資源保護(hù)具有重要意義。

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是物種多樣性的基礎(chǔ)[5]。物種的遺傳多樣性水平可以直觀反映該物種的繁殖力和環(huán)境適應(yīng)力，研究植物遺傳多樣性對植物種質(zhì)資源的保護(hù)和開發(fā)利用具有重要的指導(dǎo)作用[6～7]，不同物種的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)差異很大。因此，制定一個物種的保護(hù)和開發(fā)策略需要以該物種的遺傳多樣性研究為理論前提[7]。此外，研究物種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)可以確定該物種的觀賞特征與基因型關(guān)系，為快速培育新品種奠定基礎(chǔ)[8]。有研究表明植物遺傳多樣性水平受多種因素綜合影響，如生命形式、分類地位以及地理環(huán)境等[5,9]。目前研究地理因素對杜鵑花種群遺傳多樣性的影響成為杜鵑花遺傳多樣性研究的熱點之一。國內(nèi)對杜鵑花遺傳多樣性和遺傳分化的研究起步較晚，近年來關(guān)于杜鵑花種群遺傳多樣性的研究主要集中于秦嶺地區(qū)杜鵑花種群的遺傳多樣性[7,10～11]、井岡山地區(qū)[12]、長白山[9,12]等，西藏地區(qū)杜鵑花遺傳多樣性研究尚未見報道。

目前AFLP標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被用于研究杜鵑花屬種群遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和種間遺傳分化中，并且證明了不同種質(zhì)資源可能具有不同的遺傳關(guān)系[7]。為此本研究利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)分析了西藏地區(qū)雪層杜鵑種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，并且結(jié)合種群生境條件和資源特點提出了雪層杜鵑的開發(fā)和保護(hù)建議，旨在從分子水平上研究雪層杜鵑種內(nèi)不同地域種群間的遺傳多樣性和遺傳分化，為雪層杜鵑種質(zhì)資源的科學(xué)保護(hù)提供理論依據(jù)，并為合理開發(fā)利用該杜鵑花資源、培育適應(yīng)高原環(huán)境的杜鵑花新品種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雪層杜鵑在西藏地區(qū)廣泛分布，選擇有代表性的5個種群。根據(jù)種群規(guī)模隨機(jī)選取25～35株個體采樣，采樣個體間相距5米防止采集無性繁殖植株，采集樣本地理生態(tài)因子狀況如表1。選取當(dāng)年生新鮮幼嫩葉片，硅膠干燥儲存于-80℃冰箱中。

表1 供試材料資源特點及來源

1.2 基因組DNA的提取

使用北京天根生化科技有限公司提供的植物基因組DNA試劑盒提取樣本總DNA，利用紫外分光光度計(Bio-RAD SmartspecMT3000)檢測DNA濃度，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。將DNA稀釋至50 ng·μL-1后保存于-20℃冰箱中備用。

1.3 AFLP試驗

試驗參照Vos等[13]的方法進(jìn)行。試驗所需引物和MseⅠ和EcoRⅠ接頭由北京奧科生物科技有限公司合成，限制性內(nèi)切酶MseⅠ、EcoRⅠ和T4DNA連接酶由Thermo Fisher公司提供，所有反應(yīng)都在Eppendorf PCR儀上進(jìn)行。

1.3.1 酶切與連接

本試驗采用酶切和連接共同反應(yīng)的方法，使用25 μL反應(yīng)體系：2.5 μL基因組DNA(50 ng·μL-1)，2.5 μL 10×Tango buffer，0.5 μLEcoRⅠ(10 U·μL-1，Thermo，China)，0.5 μLMseⅠ(10 U·μL-1，Thermo，China)，0.2 μL T4DNA ligase(10 U·μL-1，Thermo，China)，0.5 μLEcoRⅠ接頭(5 pmol·μL-1)，0.5 μLMseⅠ接頭(50 pmol·μL-1)，0.5 μL ATP(10 mmol·μL-1)和17.3 μL ddH2O，使混合物在37℃條件下反應(yīng)3 h。產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產(chǎn)物稀釋10倍備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

預(yù)擴(kuò)增使用20 μL反應(yīng)體系：5 μL酶切連接后模板DNA，4.4 μL ddH2O，10 μL Taq premix(TaKaRaTaqTMVersion 2.0，TaKaRa Biotech.，Dalian Co.，Ltd.，China)和分別0.3 μL E-0、M-0引物(50 ng·μL-1)。反應(yīng)程序：首先94℃預(yù)變性2 min；然后進(jìn)行22個循環(huán)的下列反應(yīng)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將產(chǎn)物稀釋10倍備用。

選擇擴(kuò)增反應(yīng)使用20 μL反應(yīng)體系：5 μL預(yù)擴(kuò)增后模板DNA，4 μL ddH2O，10 μL Taq premix(TaKaRaTaqTMVersion 2.0,TaKaRa Biotech.,Dalian Co.,Ltd.,China)和分別0.5 μL E-、M-引物(50 ng·μL-1)。反應(yīng)程序：首先94℃預(yù)變性4 min；其次進(jìn)行12個循環(huán)的下列反應(yīng)94℃預(yù)變性30 s，65～56℃退火30 s(退火溫度每循環(huán)降低0.7℃)，72℃延伸1 min；然后進(jìn)行24個循環(huán)的下述反應(yīng)94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸8 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物檢測

本試驗采用聚丙烯酰氨凝膠電泳法檢測選擇擴(kuò)增產(chǎn)物，銀染法觀察電泳圖譜。按1:2的比例混合加樣緩沖液和選擇擴(kuò)增產(chǎn)物，在PCR儀中95℃變性8 min后迅速放置在冰上防止復(fù)性，變性產(chǎn)物用于電泳檢測。電泳裝置為DXY-12型電腦三恒多用電泳儀和64孔北京六一電泳槽。取4.5 μL變性產(chǎn)物，在1 200 V恒定電壓下電泳90 min，銀染后在X線膠片觀察等下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將電泳譜帶信息轉(zhuǎn)化成(0,1)二元矩陣，觀察電泳圖譜同一位點上有無DNA條帶，有條帶記為1，無則記為0。在假定Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)下，使用POPGENE1.32[14]分析種群遺傳多樣性參數(shù)：多態(tài)性位點百分比(PPL)，有效等位基因數(shù)(Ne)，Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)，Shannon信息指數(shù)(I)，遺傳分化系數(shù)(Gm)和基因流(Nm)。利用NTSYSpc 2.10[15]軟件根據(jù)種間遺傳距離進(jìn)行非加權(quán)算數(shù)平均聚類分析(UPGMA)，構(gòu)建種間聚類樹形圖。采用GenAlEx 6.5[16]軟件對種群的遺傳分化進(jìn)行AMOVA(analysis of molecular variance)方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及擴(kuò)增片段多態(tài)性分析

本試驗采用64對引物作為初選引物對，每個種群選擇5個樣本用于篩選引物，從中共篩選出14對能擴(kuò)增出條帶明亮、分辨能力強(qiáng)、帶型分布均勻且多態(tài)性高且引物，引物序號分別為M6E4、M6E2、M4E5、M4E7、M6E7、M7E2、M5E1、M5E4、M5E5、M5E7、M5E8、M5E6、M4E1、M8E6。最終從14對引物中選取6對擴(kuò)增條帶較多的引物對分別對5個種群的135個個體進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出273條DNA片段，其中234條是多態(tài)性片段，占擴(kuò)增片段總數(shù)的85.71%(表2，圖1)。

表2引物對及其選擇性擴(kuò)增產(chǎn)生條帶多態(tài)性

Table2Polymorphismofselectiveamplificationbasedonsixprimerpairs

引物序號Primercode堿基序列Sequence(5'-3')擴(kuò)增位點Amplificationlocus多態(tài)性位點Polymorphismlocus多態(tài)性位點百分比PPL(%)M4E5MCAT-/E-ACC463882.61M4E7M-CAT/E-AGC342985.29M5E1M-CTA/E-AAC514486.27M5E5M-CTA/E-ACC534686.79M5E7M-CTA/E-AGC474085.11M8E6M-CTT/E-AGG423788.10平均Average45.53985.71

圖1 引物對M-CTA/E-AGC對雪層杜鵑米林種群的擴(kuò)增譜帶Fig.1 AFLP fingerprinting patterns of R.nivale samples in Milin, generated by M-CTA/E-AGC

2.2 種群及物種水平的遺傳多樣性分析

多態(tài)性位點百分比(PPL)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)和Shannon信息指數(shù)(I)是評價遺傳多樣性水平的常用指標(biāo)(表3)。

表3西藏地區(qū)雪層杜鵑5個種群的遺傳多樣性參數(shù)

Table3Geneticdiversityindexof5populationsofR.nivale

種群Population多態(tài)條帶數(shù)PolymorphismbandsPPL(%)NehI嘎隆拉Galongla(GL)17865.21.28960.17930.2798米林縣Milin(M)16359.71.24160.14170.2123色季拉山SejilaMountain(SD)16861.541.33700.19950.3011工布江達(dá)縣Gongbujiangda(G)15958.241.23160.13590.2064紅拉山HonglaMountain(YH)19772.161.43960.26390.4018平均Mean17363.361.30790.18410.2803物種水平Specieslevel23485.710.1840.2730.4151

通過分析西藏地區(qū)雪層杜鵑的5個種群遺傳多樣性得出不同種群間的多態(tài)位點百分比不同，工布江達(dá)縣種群的多態(tài)位點百分比最低，紅拉山的多態(tài)位點百分率最高。種群水平上PPL由低到高的順序依次為G

2.3 種群遺傳分化分析

根據(jù)POPGENE分析得出種群間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.324，表明雪層杜鵑5個種群間存在一定程度的遺傳分化，種群間遺傳變異指數(shù)為32.4%，種群內(nèi)的遺傳變異為67.6。因此可以推斷出遺傳變異主要存在于種群內(nèi)，這與AMOVA分析結(jié)果相一致(表4)。AMOVA分析中，64%的變異來源于種群內(nèi)，36%的變異來源于種群間。POPGENE分析顯示種群基因多樣性Ht為0.272 3；種群內(nèi)基因多樣性Hs為0.184；5個種群的基因流(Nm)為1.043 2，表明在種群間缺乏有效的基因交流，種群間具有一定的遺傳分化，遺傳變異主要存在于種群內(nèi)。

表4西藏地區(qū)雪層杜鵑種間和種內(nèi)分子變異的方差分析

Table4AnalysisofAMOVAwithinandamongR.nivalepopulations

變異來源Sourceofvariation自由度df平方和SS均方MS變異組分Variancecomponent變異率Percentageofvariance(%)P種群間Amongpopulations4886.716221.6797.73636%<0.01種群內(nèi)Withinpopulations1301777.52113.67313.67364%

2.4 種間遺傳關(guān)系分析

利用POPGENE計算得到的5個種群的遺傳一致度和遺傳距離進(jìn)行UPGMA分析，以進(jìn)一步分析雪層杜鵑的遺傳分化程度。根據(jù)各種群間的遺傳相似性系數(shù)，采用NTSYS軟件對5個雪層杜鵑種群進(jìn)行UPGMA聚類分析。由表5可得出5個種群的遺傳一致度在0.752 3～0.951 3，最大的遺傳一致度產(chǎn)生在米林和工布江達(dá)縣種群間，最小的產(chǎn)生在米林和色季拉山種群間。種群間的遺傳距離在0.05～0.284 6，其中米林縣和工布江達(dá)縣種群的遺傳距離最小，米林縣和色季拉山種群間的遺傳距離最大。

表5雪層杜鵑種群間Nei’s遺傳一致度(右上)和遺傳距離(左下)

Table5Nei’sgeneticidentityandgeneticdistanceof5populationsofR.nivale

種群Population嘎隆拉Galongla(GL)色季拉山SejilaMountain(SD)米林Milin(M)工布江達(dá)Gongbujiangda(G)紅拉山HonglaMountain(YH)嘎隆拉Galongla(GL)10.86630.83490.81320.9310色季拉山SejilaMountain(SD)0.143510.75230.76110.8691米林Milin(M)0.18040.284610.95130.9441工布江達(dá)Gongbujiangda(G)0.20680.2730.0510.9431紅拉山HonglaMountain(YH)0.07150.14030.05760.05861

由圖2可看出5個不同的種群間有一定的遺傳距離，也可以聚類到一起，表明5個種群具有相同的遺傳背景，并且存在著遺傳差異。其中米林縣和工布江達(dá)縣種群遺傳一致度最大，且與紅拉山種群聚類到同一組，表明這3個種群具有較近的遺傳距離。嘎隆拉和色季拉山種群聚類到另一個組，說明這兩個種群間有較近的遺傳距離，與其他3個種的遺傳距離較遠(yuǎn)，遺傳距離與地理距離之間相關(guān)性不顯著。經(jīng)Mantel檢驗得出5個種群的遺傳距離與地理距離之間不存在顯著的相關(guān)性(R=0.603 1,P=0.894 0,P=0.114 0)。西藏地區(qū)的地形和氣候環(huán)境復(fù)雜多樣以及雪層杜鵑的生活習(xí)性，可能是導(dǎo)致5個種群間有著較顯著的遺傳分化的原因。

圖2 雪層杜鵑種群UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram for 5 populations of R.nivale

3 討論與結(jié)論

3.1 雪層杜鵑的遺傳多樣性和遺傳分化

近年來分子標(biāo)記方法被廣泛地用于分析植物親緣關(guān)系和遺傳多樣性，例如RAPD[17]、ISSR[18]、SSR[12]、AFLP[10]等。AFLP是一種高效的分子標(biāo)記方法，適合用于標(biāo)記總基因組檢測遺傳多樣性，并且AFLP可以標(biāo)記大量的基因位點具有很高的多態(tài)性和可重復(fù)性[13]。曾有研究表明，在基因序列未知的情況下，分析親緣關(guān)系較近的植物遺傳多樣性，AFLP標(biāo)記技術(shù)是比較好的選擇[19]。本試驗共篩選出6對引物用于135份樣本的選擇性擴(kuò)增，各引物對擴(kuò)增結(jié)果的多態(tài)性位點百分率在是82.61%～88.10%，平均值為85.71%。結(jié)果與秦嶺秀雅杜鵑(Rhododendronconcinnum)遺傳多樣性的分析結(jié)果相似，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于紅花(Carthamustinctorius)遺傳多樣性的分析結(jié)果[20]。POPGENE計算得出物種水平上多態(tài)位點百分比為85.71%，大于大樹杜鵑(Rhododendronprotistumvar.giganteum)遺傳多樣性的分析結(jié)果[21]。這些結(jié)果表明AFLP分子標(biāo)記技術(shù)可以用于分析雪層杜鵑的遺傳多樣。

試驗取樣地主要位于西藏東部，分布于念青唐古拉山脈、喜馬拉雅山脈以及橫斷山脈中，地形復(fù)雜、氣候環(huán)境多樣，是植物種類和生境類型極其豐富的地區(qū)。杜鵑花屬植物資源是西藏地區(qū)重要的群落基礎(chǔ)，是西藏地區(qū)高山灌叢植被類型的重要組成部分[4]。雪層杜鵑生長海拔較高、分布廣、觀賞價值高，是極具開發(fā)價值的植物之一。本試驗利用AFLP標(biāo)記方法分析西藏地區(qū)雪層杜鵑野生資源的遺傳多樣性，為該物種的科學(xué)開發(fā)提供理論參考。

西藏地區(qū)5個雪層杜鵑種群遺傳多樣性指標(biāo)分析結(jié)果表明，物種水平上多態(tài)性位點百分比(PPL=85.71%)和Shannon信息指數(shù)(I=0.415 1)，略小于秦嶺地區(qū)5個美容杜鵑的研究結(jié)果(PPL=86.77%，I=0.497 2)[11]和長白山區(qū)牛皮杜鵑(Rhododendronaureum)的研究結(jié)果(PPL=87.43，I=0.459 3)[9]，表明西藏地區(qū)雪層杜鵑在物種水平上具有較高的遺傳多樣性。在種群水平上，多態(tài)性位點百分比(PPL=63.36%)略低于秦嶺地區(qū)秀雅杜鵑遺傳多樣性研究結(jié)果(PPL=77.56)，但是Shannon信息指數(shù)(I=0.280 3)和基因多樣性指數(shù)(h=0.184 1)遠(yuǎn)低于秀雅杜鵑遺傳多樣性研究結(jié)果(I=0.640 9，h=0.472 5)，并且基因多樣性指數(shù)小于Nybom統(tǒng)計的不同物種種群內(nèi)基因多樣性指標(biāo)平均值h=0.220 0[24]，表明西藏地區(qū)雪層杜鵑在種群水平上遺傳多樣性較低，這區(qū)別于秦嶺地區(qū)和長白山區(qū)其他杜鵑花種的研究結(jié)果。這可能是由西藏地區(qū)特殊的生境引起的，雪層杜鵑是灌叢群落的建群種，生長地海拔較高、分布范圍廣，遺傳方向主要受環(huán)境因素制約。本試驗檢測的5個雪層杜鵑種群的多態(tài)位點百分率的變化趨勢為工布江達(dá)縣種群<米林種群<色季拉山種群<嘎隆拉種群<紅拉山種群，基因多樣性指數(shù)h和Shannon信息指數(shù)I的變化趨勢一致均為工布江達(dá)縣種群<米林種群<嘎隆拉種群<色季拉山種群<紅拉山種群。這種變化趨勢可能與種群地理分布區(qū)域的大小、生境環(huán)境和海拔有關(guān)。有研究表明，生活史、生活型、交配系統(tǒng)、環(huán)境包括人類活動以及自然環(huán)境都是影響植物種群遺傳多樣性的原因[9,24～25]。雪層杜鵑為矮小灌木，可自花異花授粉繁殖，也可以無性系繁殖。紅拉山種群的各項指標(biāo)都是5個種群中最高的，其中基因多樣性指標(biāo)h=0.263 9，大于不同物種種群內(nèi)基因多樣性指標(biāo)平均值h=0.220 0，說明紅拉山種群內(nèi)具有較高的遺傳多樣性。紅拉山種群的采樣地是5個種群中海拔最高的，種群樣本為低矮灌木叢，生長于山頂冠層，特殊的群落類型使得紅拉山種群不受較高植物的阻礙，風(fēng)媒、蟲媒傳粉可以順利進(jìn)行；雪層杜鵑具有分枝多、分枝稠密、常平臥成墊狀生長，易產(chǎn)生無性繁殖；紅拉山種群呈連續(xù)分布，這增強(qiáng)了種群內(nèi)基因交流并且豐富了種群基因型；色季拉山種群生生長于山坡草甸冠層，呈片狀連續(xù)分布，使得色季拉山種群內(nèi)有較豐富的基因交流，遺傳多樣性僅次于紅拉山種群；其余3個種群分布于林下，種群呈間斷分布，采樣種群在一定范圍內(nèi)隔離成一些小種群，這導(dǎo)致小種群內(nèi)部基因交流頻繁且容易進(jìn)行并且阻礙了整個種群的有效基因交流，因此降低種群基因的多樣性水平；嘎隆拉山種群生長地具有的多樣的自然氣候，可能是引起該種群遺傳多樣性水平較高的原因。

種群遺傳分化系數(shù)是評價種群遺傳結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，不同物種在遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳分化上有很大不同[5,7]。地理因素是促使群體遺傳分化的主要因素之一[7]，西藏地區(qū)山脈較多，海拔跨度大，氣候類型豐富，導(dǎo)致種群間相互隔離并且可能引起種群間的遺傳分化；種群大小也是引起種群間遺傳分化的重要因素之一[26～27]；基因流也是引起群體遺傳分化的重要因素之一，傳粉和種子傳播是植物基因流的2種主要形式[29]，雪層杜鵑為低矮灌木，生長在混交林下層時，花粉和種子傳播距離受限，從而降低了不同群體間的基因交流，導(dǎo)致遺傳分化出現(xiàn)；種群生長地域差異或海拔差異使得種群間缺乏有效的基因交流，從而引起種群間的遺傳分化。POPGENE分析得出種群間總的遺傳分化系數(shù)為Gst=0.324，大于長白山山區(qū)牛皮杜鵑種群間遺傳分化系數(shù)[9]，表明5個雪層杜鵑種群間有顯著的遺傳分化。AMOVA分析的雪層杜鵑遺傳變異分布格局結(jié)果顯示種群間的變異率為36%，種群內(nèi)的變異率為64%，說明雪層杜鵑在種群間存在一定的遺傳多樣性，但是主要存在于種群內(nèi)，可以推測基因流可能是影響雪層杜鵑遺傳分化的重要因素，雪層杜鵑的生境類型可能導(dǎo)致了生境片段化，從而引起種群內(nèi)的遺傳分化。

根據(jù)遺傳一致度對5個雪層杜鵑進(jìn)行UPGMA聚類分析以及地理距離與遺傳距離的Mantle檢驗，結(jié)果表明該5個種群間的遺傳分化程度與地理分布和海拔沒有明顯的相關(guān)性，這與趙冰等分析秦嶺秀雅杜鵑遺傳多樣得到的結(jié)果一致[7]。但是長白山牛皮杜鵑遺傳多樣性分析中證明了種群間的遺傳距離和海拔顯著相關(guān)[9]，武夷山伯樂樹(Bretschneiderasinensis)的種群間遺傳距離和地理距離顯著相關(guān)[5]，因此可以對雪層杜鵑種群的遺傳多樣性是否與海拔相關(guān)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

3.2 雪層杜鵑種質(zhì)資源開發(fā)和保護(hù)建議

藏東南、滇西北、川西南是中國杜鵑花集中分布地，也是杜鵑花屬的現(xiàn)代分布中心[4]。近年來，全球變暖，藏東南冰川融化退縮，降水減少等氣候變化可能影響到高山生態(tài)系統(tǒng)。另外，人類對大自然的開發(fā)也會損失植物野生種質(zhì)資源。雪層杜鵑有較高的觀賞價值和藥用價值，是高海拔地區(qū)植物群落的重要組成部分，因此應(yīng)對雪層杜鵑進(jìn)行合理的開發(fā)和保護(hù)。有研究在藏東南高海拔地區(qū)發(fā)現(xiàn)一些國家重點保護(hù)野生植物，生長于杜鵑灌叢提供的庇護(hù)所內(nèi)，因此建立高海拔杜鵑花屬植物的就地保護(hù)基地可以為珍惜瀕危植物的就地保護(hù)提供基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示紅拉山種群具有較高的遺傳多樣性，可以對現(xiàn)有種群進(jìn)行就地保護(hù)；其余4個種群的遺傳多樣性水平較低，建議在建立杜鵑花就地保護(hù)基地的同時可以遷地保護(hù)杜鵑花種質(zhì)資源，促進(jìn)其遺傳多樣性水平提高并防止種群消亡。西藏地區(qū)的雪層杜鵑在物種水平具有較高的遺傳多樣性，但是由于種群的生境片段化，降低了種群基因流，引起了種群遺傳分化，因此對西藏地區(qū)的雪層杜鵑的保護(hù)提出以下建議：首先對該物種進(jìn)行全面研究，其次確定合適的保育地點對杜鵑花進(jìn)行就地保護(hù)，并對部分杜鵑花進(jìn)行遷地保護(hù)試驗，盡可能多地保護(hù)野生種群；其次進(jìn)一步加強(qiáng)雪層杜鵑繁殖生物學(xué)、物種多樣性的研究，積極增強(qiáng)合理的引種馴化和人工栽培雪層杜鵑的研究，為雪層杜鵑的合理開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

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National Science Foundation(K305021401)

introduction：XU Jing-Jing(1990—),female,Current Master Students,Mainly engaged in garden plant germplasm resources research.

date:2016-08-30

AssessmentofGeneticDiversityofRhododendronnivaleinTibetan,ChinausingAFLPMarkers

XU Jing-Jing1ZHAO Bing1*ZHANG Liang-Ying2SHEN Hui-Fei1LI Hou-Hua1

(1.The College of Landscape Architecture and Arts,Northwest A&F University,Yangling 712100；2.College of agriculture and animal husbandry,Tibet University,Linzhi 860114)

To determine the correlation among genetic variations, the geographic location of a population, and factors that influence high-level genetic diversity, the genetic diversity of 135Rhododendronnivalesamples was studied using amplified fragment length polymorphisms(AFLP). A total of 273 amplification products were generated from 6 selective primer combinations, of which 85.71% were polymorphic. The results of POPGENE showed the change trends of the percentage of polymorphic(PPL), Nei’s genetic diversity(h) and Shannon’s index(I) were similar. The change trends of Nei’s genetic diversity(h) and Shannon’s index(I) were Gongbujiada

Tibetan;Rhododendronnivale;genetic diversity;AFLP;population

國家自然科學(xué)基金(K305021401)

徐靜靜(1990—)，女，碩士研究生，主要從事園林植物種質(zhì)資源研究。

* 通信作者：E-mail:bingbing2003915@163.com

2016-08-30

* Corresponding author：E-mail:bingbing2003915@163.com

S685.21

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.012