瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌發(fā)酵的影響

白延琴，時國峰，辛亞平

(1.子長縣畜牧獸醫(yī)局史家畔畜牧獸醫(yī)站，陜西 子長，717300；2.甘肅張掖市畜牧獸醫(yī)局，甘肅 張掖，734000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，中國 楊凌，712100)

瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌發(fā)酵的影響

白延琴1，時國峰2，辛亞平3*

(1.子長縣畜牧獸醫(yī)局史家畔畜牧獸醫(yī)站，陜西 子長，717300；2.甘肅張掖市畜牧獸醫(yī)局，甘肅 張掖，734000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，中國 楊凌，712100)

[目的]為了探討瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌的生長和發(fā)酵的影響；[方法]分別配制含有0.18 mg/mL、0.36 mg/mL、0.72 mg/mL、1.44 mg/mL、2.88 mg/mL、5.76 mg/mL瘋草毒素的培養(yǎng)基對瘤胃混合細(xì)菌進(jìn)行體外培養(yǎng)。用分光光度計(jì)實(shí)時測定培養(yǎng)物的OD值，培養(yǎng)結(jié)束后用pH計(jì)和凱氏定氮法測定了發(fā)酵終產(chǎn)物的pH值和氨氮濃度。在正常生長條件下，對瘤胃細(xì)菌的生長曲線進(jìn)行了測定。[結(jié)果]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中，不同濃度的瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌的生長無顯著影響(P>0.05)。培養(yǎng)后培養(yǎng)液的pH值、氨氮濃度無顯著差異(P>0.05)。[結(jié)論]研究表明，體外培養(yǎng)條件下瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌的發(fā)酵無顯著影響。瘤胃細(xì)菌的生長曲線為：Y=0.79/(1+7.81*e-0.942*x)(X=t，Y=OD值)。

瘋草毒素；瘤胃細(xì)菌；生長；發(fā)酵

近年來，應(yīng)用微生物降解毒物、毒素一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，研究內(nèi)容涉及到毒物(毒素)在環(huán)境中的降解轉(zhuǎn)化過程、降解微生物的篩選、鑒定、降解基因和降解機(jī)理的研究、基因工程菌的構(gòu)建等[1]。牛羊等反芻動物的瘤胃由于具有一些特殊功能的細(xì)菌，使反芻動物在采食一些含有一定劑量的有毒有害物質(zhì)的飼料、飼草時不受其毒害。牛羊的瘤胃中可能存在能夠分解利用瘋草毒素的微生物。本試驗(yàn)用用體外培養(yǎng)法初步探討瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌生長與瘤胃發(fā)酵特征的影響，為從瘤胃中分離能夠降解瘋草毒素的微生物等相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

帶瘤胃瘺管秦川母牛，日糧中精料混合料4 kg/d，青貯料10 kg/d，苜蓿 1 kg/d，麥秸2 kg/d。瘋草毒素、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、硫酸鎂(MgSO4)、氯化鈣(CaCl2)。pHS-3精密pH計(jì)、AG-2厭氧培養(yǎng)裝置、制冰機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 瘤胃液的采集及處理

(1) 采用口腔插管法采集200 mL的牛瘤胃液放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室后，放入39℃培養(yǎng)箱30min。

(2) 用移液管取容器中間部分30 mL裝入50 mL離心管中，在750×g ，10℃的條件下離心10 min。

(3) 取出離心后，取上清液置于新的50 mL離心管中，在12 000×g，10℃下離心15 min。

(4) 取出離心后的瘤胃液，去掉上清液，沉淀部分用30 mL 磷酸緩沖液沖洗，然后在12 000×g 、10℃的條件下離心15 min。

(5)去掉上清液，沉淀部分用30 mL磷酸緩沖液再沖洗一次，然后在12 000×g、10℃條件下離心15 min。

(6)去掉上清液，加入20 mL磷酸緩沖液沖洗混勻，然后放入冰水混合物中，不斷通入二氧化碳，保持厭氧狀態(tài)。

(7)將洗滌后的瘤胃混合細(xì)菌振蕩混勻后，分別加入裝有處理好的含培養(yǎng)基的試管中，每管加0.5 mL。

1.2.2 OD值測定 接種好后立即放入39°C水浴鍋培養(yǎng)。用分光光度計(jì)測定培養(yǎng)過程中光密度的變化，起始時測1次，培養(yǎng)的前2 h每1 h測1次，以后每30 min測1次，做好記錄。

1.2.3 pH值測定

1) 培養(yǎng)結(jié)束后，將測完OD值的18個試管中的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至10 mL的離心管，在1 2000×g、10℃條件下離心5 min。

2) 每個管取上清液3.6 mL，分裝至兩個2 mL離心管中，每管1.8 mL，放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3) 將10 mL離心管中剩下的微生物培養(yǎng)基測pH值。

4) 測完pH值后，倒掉上清液，沉淀的細(xì)菌在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 NH3氮測定

1) 每管每次分別用微量加樣器量取0.5 mL液體樣，放入消化管中，加入3 g輕質(zhì)氧化鎂和1 mL液體石蠟油，再沿管壁加入30 mL蒸餾水，直接蒸餾，蒸餾時使冷凝管末端在吸收液面以下蒸餾4 min，然后使冷凝管末端在在吸收面上端再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端。

2) 用10 mL加入2～3滴混合指示劑的2%的硼酸吸收。

3) 用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸標(biāo)定，溶液由藍(lán)綠色變?yōu)榛壹t色為終點(diǎn)，每管測兩次，記錄鹽酸體積。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用SPSS軟件的非線性回歸過程擬合Logisti模型(模型方程為：Y=A/(1+Be-Kt))參數(shù)的最優(yōu)估計(jì)值A(chǔ)、B、k，建立生長曲線模型，推算出拐點(diǎn)OD值、達(dá)到拐點(diǎn)OD值的時間和最大增加OD值。應(yīng)用Microsoft excel軟件中t檢驗(yàn)功能進(jìn)行差異性檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃細(xì)菌的生長曲線

利用SPSS軟件非線性擬合過程擬合了瘤胃細(xì)菌正常生長的擬合模型的參數(shù)估計(jì)見表1。從表1中可以看出參數(shù)的最優(yōu)估計(jì)值A(chǔ)、B、k分別為0.79、7.81、0.942，達(dá)到拐點(diǎn)的OD值、拐點(diǎn)時間、最大增加OD值分別為0.395、2.1820、0.1860，曲線的擬合度R2為0.964，曲線的擬合較好。曲線整體呈“S”增長趨勢，先上升后降低，符合正常細(xì)菌的生長曲線。

2.2 不同濃度瘋草毒素對瘤胃發(fā)酵特征的影響

培養(yǎng)結(jié)束后，不同濃度瘋草毒素培養(yǎng)管中的pH值和氨氮濃度見表2。處理組與對照組差異不顯著(P>0.05)，說明不同濃度瘋草毒素對瘤胃發(fā)酵無顯著影響。

表1 非線性生長模型的表達(dá)式及參數(shù)

2.3 不同濃度的瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌生長的影響

添加不同濃度瘋草毒素的處理組和對照組的瘤胃細(xì)菌在不同測定時間點(diǎn)的OD值見表3。各處理組與對照組OD值變化不顯著(P>0.05)，說明不同濃度瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌的生長無顯著影響，各時間點(diǎn)不同處理之間瘤胃細(xì)菌的OD值變化差異不顯著(P>0.05)，由此說明不同濃度的瘋草毒素對瘤胃細(xì)菌生長無顯著影響。

表3 不同濃度的瘋草毒素瘤胃混合細(xì)菌生長(OD值，X±S)的影響

3 討論

通過測瘤胃混合細(xì)菌的OD來間接了解細(xì)菌的生長情況，由細(xì)菌的OD值繪成的生長曲線反映了細(xì)菌在培養(yǎng)中所表現(xiàn)出來的生長和繁殖的規(guī)律，實(shí)驗(yàn)得出的瘤胃混合細(xì)菌體外培養(yǎng)生長曲線與其他報道中的瘤胃混合細(xì)菌正常生長曲線一致，擬合度較好[2]。

B.S.Obeidat等對苦馬豆素的不同接觸途徑對綿羊的血清成分，瘤胃特征和營養(yǎng)代謝的影響進(jìn)行了研究，其用苦馬豆素與綿羊進(jìn)行瘤胃接觸、皺胃接觸和靜脈接觸方法來確定瘋草毒素是否對瘤胃特征，血清成分，消化代謝率和N保留存在影響[3]。當(dāng)綿羊接觸到苦馬豆素時發(fā)生亞中毒，但對瘤胃發(fā)酵，營養(yǎng)消化率和N保留影響不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)采用體外培養(yǎng)方法，將含有不同濃度瘋草毒素的處理組與不加瘋草毒素的對照組分別進(jìn)行pH值、氨氮濃度和揮發(fā)性脂肪酸濃度的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘋草毒素對瘤胃內(nèi)環(huán)境無顯著影響(P>0.05)，這與B.S.Obeidat等報道一致，無論是飼喂還是體外培養(yǎng)瘋草毒素對瘤胃發(fā)酵都無顯著影響[4]。

通過對瘤胃內(nèi)是否存在可降解利用瘋草毒素的細(xì)菌進(jìn)行研究，對照組和處理組瘤胃細(xì)菌在各時間點(diǎn)OD值得測定和比較，發(fā)現(xiàn)不同濃度的瘋草毒素對瘤胃內(nèi)細(xì)菌沒有顯著影響(P>0.05)[5]。不能確定瘤胃內(nèi)沒有可降解利用瘋草毒素的微生物，因?yàn)榀偛荻舅刈饔脵C(jī)制主要是能強(qiáng)烈地和特異性地抑制溶酶體α-甘露糖甙酶I和高爾基氏體α-甘露糖甙酶II的活性，這種酶并不是瘤胃細(xì)菌的主要代謝過程，瘋草中毒是一個逐漸累積的過程[6]。由于條件所限，不能肯定瘤胃內(nèi)是否有可降解利用瘋草毒素的細(xì)菌存在。但為可降解瘋草毒素的細(xì)菌的提取和分離進(jìn)行了探索，對瘋草毒素的防治提供了新方法。

4 結(jié)論

瘤胃混合細(xì)菌的生長曲線為：Y=0.79/(1+7.81*e-0.942x)(X=t，Y=OD值)；體外培養(yǎng)條件下，瘋草毒素對pH值、氨氮濃度等發(fā)酵特征無顯著影響；瘋草毒素對瘤胃混合細(xì)菌的生長無顯著影響。

[1] 黃榮福，沈頌東.西藏草原豆科毒害植物(瘋草)的種類與分布[J].動物毒物學(xué)，1998,13(1-2):13-17.

[2] 王建華，張志恒，高巨星.西藏阿里地區(qū)動物“醉馬草”中毒病調(diào)查報告[J].動物毒物學(xué)，1998,13(12):22-27.

[3] 劉栩,王英東.甘肅棘豆草粉添加飼喂豬試驗(yàn)血液學(xué)分析[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,1997,(1):8-10.

[4] 童德文，曹光榮，李紹君.甘肅棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2001,29(3):5-7.

[5] 陳學(xué)誠，陳立昕，鄧曉麗，等.二惡英、有毒二惡英及其類似化合物[J].河北工業(yè)科技,2002，19(3):46-49.

[6] 杜秀英，竺乃愷，夏希娟，等.多氯代二苯并-對-二惡英的微生物降解[J].環(huán)境科學(xué),2001,22(3):97-99.

EffectsofLocoweedToxinsontheFermentationofRumenBacteria

BAI Yan-qin1，SHI Guo-feng2，XIN Ya-ping3*

(1.TheAnimalHusbandryandVeterinaryBureauinShijiapan,Zichang,Shaanxi, 717300,China; 2.TheAnimalHusbandryandVeterinaryBureauofZhangye,Zhangye,Gansu, 734000,China; 3.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi, 712100,China)

[Objective] The aim of this study was to explore the effect of locoweed toxin on rumen bacterial growth and fermentation. [Method] The medias were prepared containing 0.18 mg/mL, 0.36 mg/mL, 0.72 mg/mL, 1.44 mg/mL, 2.88 mg/mL and 5.76 mg/mL and 57.6 mg/mL locoweed toxin, respectively. Then, the madias containing locoweed toxins were prepared to culture mixed rumen bacteria in vitro. The pH values and ammonia concentration in fermentation end product were monitored and the normal growth curve of rumen bacteria was constructed based on the relationship between OD values and culture time.[Result] It showed that no effects of locoweed toxin at different concentrations on rumen bacteria growth were observed (P>0.05). After the culture, the pH and ammonia concentration in the fermentation end products showed no significant difference (P>0.05). [Conclusion] The locoweed toxin has no significantly effects on the fermentation of rumen bacteria in vitro. Under the conditions in vitro, the growth curve of mixed rumen bacterial was as follows: Y=0.79/(1+7.81*e-0.942*x) (X=t,Y= OD value,R2=0.964).

locoweed toxin; rumen bacteria; growth; fermentation

2017-03-18接收日期2017-05-15

秦川肉牛種質(zhì)創(chuàng)新及高效健康養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)集成與示范、富硒畜禽水產(chǎn)飼料研制開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化及陜西省奶牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助。

白延琴(1985-)，女，陜西子長人，本科，助理畜牧師，主要從事畜牧技術(shù)推廣工作。

*通訊作者：辛亞平(1965-),男,陜西扶風(fēng)人,副教授,主要從事養(yǎng)牛教學(xué)與研究工作。

S823

A

1001-9111(2017)04-0030-04