淺談豬胸膜肺炎放線桿菌的實驗室診斷

郝志香+李樂+馬健+劉海林

胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae， APP）是豬傳染性胸膜肺炎的病原菌，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。由于本病是細菌性疾病，因此可以通過使用抗生素和改善飼養(yǎng)條件進行預(yù)防和控制，同時科學(xué)合理地使用安全高效的疫苗可以降低本病的發(fā)病率，減少經(jīng)濟損失。具體采用哪種方法，主要根據(jù)各個豬場APP的流行情況而定。所以及時準確地掌握該病的流行情況對有效的預(yù)防和控制該病具有舉足輕重的意義。目前對該病的監(jiān)測主要是通過病原學(xué)和血清學(xué)的方法來實現(xiàn)的。

一、豬傳染性胸膜肺炎的病原學(xué)診斷方法

APP的病原學(xué)診斷主要基于細菌的分離或?qū)M織內(nèi)APP的檢測，包括細菌的分離鑒定、PCR檢測、熒光抗體等方法。

1.細菌的分離鑒定

從豬的肺臟、扁桃體或鼻腔中分離APP，在APP的培養(yǎng)基中直接添加NAD、綿羊血、制霉菌素（50μg/mL）、地衣桿菌素（100μg～1000μg/mL）、結(jié)晶紫（1μg/mL）、林可霉素（1μg/mL）和制霉菌素（50μg/mL）可以最為有效地分離APP。對分離到的APP鑒定傳統(tǒng)上是通過一系列的生理生化試驗來完成的，包括革蘭氏染色試驗、NAD依賴試驗、溶血試驗、脲酶

2.聚合酶鏈反應(yīng)

國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種PCR病原學(xué)診斷方法用于疾病的早期診斷和細菌的快速鑒定，將分子生物學(xué)的分型方法與常規(guī)血清學(xué)方法結(jié)合起來，會提高APP分型的速度和準確性。

PCR因為所需時間很短，可以替代常規(guī)的生理生化檢測。由于還沒有發(fā)現(xiàn)各個血清型特有的DNA序列，PCR在診斷和檢測上還沒有充分發(fā)揮其快速高效的作用，一旦各個血清型特有的DNA序列被發(fā)現(xiàn)，PCR就能為APP的血清型分型提供一個簡單快捷、特異性好、靈敏度高的方法。

3.熒光抗體試驗

1981年，Rosendal等人用間接熒光抗體試驗（Indirect Fluorescent Antibody Method， IFA）對APP進行了檢測和血清學(xué)分型。間接熒光抗體實驗只須3～4h即可完成，然而，除血清型6與非對應(yīng)的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)外，血清型4，7之間和血清型4，5之間也發(fā)生交叉反應(yīng)。另外還發(fā)現(xiàn)間接熒光抗體試驗對血清型1無效?？傊?，直接或間接熒光抗體試驗可以直接檢測APP，但敏感性和特異性相對較低。

二、豬傳染性胸膜肺炎的血清學(xué)診斷方法

較病原學(xué)檢測而言，血清學(xué)檢測具有簡潔、快速、高效和靈敏度高的特點，故而臨床上備受青睞。APP的血清學(xué)診斷方法主要有補體結(jié)合試驗、間接血凝試驗、凝集和協(xié)同凝集試驗、乳膠凝集試驗、免疫擴散試驗、環(huán)形沉淀實驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。

1.補體結(jié)合試驗（Complement Fixation Test， CFT）

CFT是用來檢測APP的最早的血清學(xué)診斷方法之一，該試驗依賴于15種具有血清型特異性的APP的抗原，用這些特異性抗原與待檢血清反應(yīng)，從而進行分型，它有較好的敏感性和特異性，檢出率可達100%，感染兩周后即可檢出抗體，可持續(xù)數(shù)月，與其它呼吸道疾病無交叉反應(yīng)，能夠區(qū)分胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌。但它與一些其它的檢測方法相比（如ELISA），其敏感性較差，不同型間交叉反應(yīng)也比較多，而且由于檢測抗原單一，用于診斷時操作繁鎖、費時且檢測樣品不易規(guī)?；?，一般只能在實驗室進行。

2.酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immunosorbert Assay， ELISA）

APP的血清學(xué)檢測方法雖然很多，但由于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）敏感度高、簡便、快速而成為常規(guī)檢測手段之一。做ELISA試驗要求選擇和純化一種特異性好的抗原。由于從細菌自身提取的抗原受特異性或提取量的限制，人們越來越多的把目光轉(zhuǎn)向人工表達的特異性抗原。Gero Leiner于1999年用人工表達的毒素Ⅱ的結(jié)構(gòu)蛋白建立了APP的ELISA檢測方法。由于APP除了血清型10外其余的都分泌毒素Ⅱ，故而基于毒素Ⅱ的ELISA可以檢測除10型外的所有型的APP。毒素Ⅳ的ELISA方法可以檢測APP所有的血清型。但APP只有進入豬體內(nèi)才會表達毒素Ⅳ，這在一定程度上也影響了該方法的檢出率，限制了該方法的廣泛使用。

3.凝集試驗（Agglutination Coagglutination Test）

凝集試驗是一種簡單快速確定APP和進行血清型分型的方法。凝集試驗包括協(xié)同凝集試驗、常規(guī)試管凝集、2-疏基乙醇試管凝集和快速玻片凝集。比較這些試驗發(fā)現(xiàn)協(xié)同凝集試驗和2-疏基乙醇試管凝集試驗的特異性與敏感性均優(yōu)于快速玻片凝集試驗和試管凝集試驗，但是，所有這些試驗都不能將APP血清型3、6和8區(qū)別開?？焖俨Ｆ囼灡乳g接熒光抗體試驗的特異性和敏感性要好，雖然快速平板凝集試驗和協(xié)同凝集試驗的敏感性不及酶聯(lián)免疫吸附試驗，但它們都很快速和簡便，因而也成為實驗室劃分APP血清型的常規(guī)方法。

4.環(huán)狀沉淀試驗（Ring Precipitation Test， RPT）

環(huán)形沉淀實驗到目前為止還沒有普遍使用，但它是快速檢測APP及確定血清型的方法之一。環(huán)形沉淀試驗的結(jié)果穩(wěn)定，并有較好的可重復(fù)性。這個試驗同樣可以對凝集試驗不能確定血清型的APP進行分型。APP可溶性抗原玻片沉淀試驗具有與環(huán)狀沉淀試驗相同的特異性，但操作上更簡單，與玻片凝集試驗相比特異性更高。

5.間接血凝試驗（Indirect Hemagglutination Test， IHA）

Nielsen 1974年首次報告用間接血凝試驗檢測APP抗體。1983年，Mittal等用間接血凝試驗用于APP血清分型，這種方法可用于APP的分型且能將這4型和7型這兩種血清型分開，但在血清型6和8之間分型時出現(xiàn)交叉反應(yīng)。間接血凝試驗的滴度測定是發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生陽性反應(yīng)血清最高稀釋度的倒數(shù)。逯忠新于1999年在建立了間接血凝抑制試驗，該方法在國內(nèi)被廣泛運用。

6.乳膠凝集試驗（Latex Agglutination Test， LAT）

乳膠凝集試驗方法簡捷快速，不僅用于檢測，還可用于分型。用莢膜特異的IgG抗體來檢測APP菌體或組織樣品特異性好，不與異型血清反應(yīng)，也不與多殺性巴氏桿菌、豬副嗜血桿菌和豬放線桿菌反應(yīng)。而且，致敏的乳膠可以從肺組織，鼻拭子以及濃縮的尿中直接檢測到APP的莢膜抗原。這種乳膠凝集試驗非常適用于快速的臨床檢驗，而且有很好的敏感性和特異性。它不需要大量的儀器設(shè)備，有很好的應(yīng)用前景。

7.免疫擴散試驗（Immunodiffusion Test）

免疫擴散的原理是特異性的抗體和抗原在瓊脂中擴散，并且能在抗原-抗體復(fù)合物形成的地方形成明顯的沉淀線。免疫擴散試驗在檢測時既可以檢測抗原，也可以檢測抗體。這個試驗雖然簡單，但需要很長的反應(yīng)時間，在孔周圍的沉淀線有的很難解釋，并且結(jié)果可能不明顯，然而，由于每種特異的抗原-抗體復(fù)合物均可形成明顯的沉淀線，所以免疫擴散實驗是研究APP附加抗原的一個有效的方法。

目前發(fā)展的APP的血清學(xué)診斷方法，大部分是血清型特異的，不適于大量樣本的檢測或血清學(xué)調(diào)查，特別是血清流行背景復(fù)雜的地區(qū)更是如此。但混合LPS的ELISA方法以及基于ApxⅡ的ELISA檢測方法敏感性和特異性都不錯，而且可以同時檢測多種血清型，極大的簡化檢測程序，因而是目前應(yīng)用較好的檢測方法。相比起來，重組ApxⅡELISA抗原的提取要較LPS簡便的多，如能消除ApxⅡ與豬放線桿菌、大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的交叉反應(yīng)，則ApxⅡ的ELISA方法則是一種方便、快捷的檢測方法，理論上可以對所有血清型APP的感染作出檢測。而且毒素抗體也是豬群保護抗體的一個重要指標，可直接反應(yīng)豬群的易感狀況。endprint