非洲豬瘟病毒基因Ⅰ型的雙重實(shí)時熒光定量PCR檢測方法建立

常 昊,邱英武,彭 杰,高 琦,宋澤布,陳 洋,5,李 薇,林麗苗,曹雪珍,周慶豐,張桂紅,李群輝*,鄭澤中*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院非洲豬瘟防控技術(shù)研究中心,廣州 510642;2.溫氏食品集團(tuán)股份有限公司 廣東省畜禽健康養(yǎng)殖與環(huán)境控制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云浮 527400;3.國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒?yàn)室(廣州),廣州 510642;4.廣東省動物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510642;5.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心,茂名 525000)

非洲豬瘟(African swine fever ,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家豬與野豬引起的高度傳染性出血性疾病,致死率高達(dá)100%。1921年,ASF首次在肯尼亞被報道[1],并于2018年傳入我國,隨后蔓延至全國范圍內(nèi)且持續(xù)至今[2]。

ASFV基因組為線性、雙鏈DNA,全長約170～193 kb,編碼 150～171個開放閱讀框(ORFs)[3]。編碼ASFV衣殼蛋白P72的B646 L基因較為保守,常被用做ASFV檢測中的靶基因[4]。EP402R基因編碼ASFV的CD2v蛋白是ASFV的重要抗原之一,同時CD2v蛋白的細(xì)胞質(zhì)區(qū)被認(rèn)為是一種新的遺傳標(biāo)記[5]。

目前中國以基因型Ⅱ ASFV(GenotypeⅡ ASFV)流行為主,隨著低毒力的基因Ⅰ型ASFV(GenotypeⅠ ASFV)在國內(nèi)被報道[6],使得ASF的監(jiān)測、預(yù)防和控制更具挑戰(zhàn)性。為有效針對ASFV進(jìn)行診斷以及GenotypeⅠ、GenotypeⅡ 的鑒定,本研究使用中國動物疾病預(yù)防控制中心(CADC)推薦的B646L引物與探針,并針對GenotypeⅠ EP402R基因保守特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針,建立了一種在診斷ASF的同時可進(jìn)行GenotypeⅠ ASFV鑒別的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、質(zhì)粒與臨床樣品 Genotype Ⅰ ASFV、Genotype Ⅱ ASFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬流感病毒(SIV)、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(PCV-2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、pUC57-B646 L質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存,連接有GenotypeⅠ ASFV EP402R基因保守特異性區(qū)域的質(zhì)粒pMD18-T-ASFV-EP402R由擎科生物技術(shù)有限公司完成合成與測序。526份臨床樣品(口拭子263份,肛拭子95份,抗凝血146份,扁桃體22份)來自華南地區(qū)生豬養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑與儀器 MagaBio plus 病毒DNA/RNA純化試劑盒Ⅳ、博日NPA-32P核酸提取純化儀(杭州博日科技股份有限公司);PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Erase試劑盒(上海金畔生物科技有限公司);real-time PCR 2×AceQ Universal U kit+Probe Master Mix V2 PCR 檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司);ExCycle-48 real-time PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 病毒核酸的提取 對Genotype Ⅰ ASFV、Genotype Ⅱ ASFV、PRRSV、PCV、PRV及臨床樣品進(jìn)行病毒核酸提取。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 B646L引物與探針使用CADC推薦使用的B646L引物與探針序列進(jìn)行合成。

使用Primer5.0軟件針對在NCBI中篩選的40條 GenotypeⅠ ASFV EP402R基因保守特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針,所有引物和探針均由Thermo公司(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)合成。引物與探針相關(guān)信息見表1。

表1 引物與探針

表2 臨床樣品檢測結(jié)果

1.2.3 雙重實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立 以1.06×105copies·μL-1的EP402R陽性質(zhì)粒與1.07×105copies·μL-1的B646L陽性質(zhì)粒1∶1等體積混勻作為模板,體系及反應(yīng)條件參考real-time PCR 2×AceQ Universal U kit+Probe Master Mix V2 PCR試劑盒說明書,通過改變加入反應(yīng)體系中兩對引物與探針的體積,使兩對引物終濃度分別為0.2、0.4、0.8 μmol·L-1三個梯度;兩對探針終濃度分別為50、100、150 nmol·L-1三個梯度進(jìn)行試驗(yàn),篩選出引物與探針最優(yōu)濃度。

1.2.4 ASFV EP402R基因檢測通道標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及靈敏性檢測 10倍梯度稀釋pMD18-T-ASFV-EP402R質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(1.06×101～10copies·μL-1),使用“1.2.3”優(yōu)化反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn),ddH2O為陰性對照,設(shè)計(jì)3次重復(fù)。依據(jù)擴(kuò)增曲線檢驗(yàn)該方法的靈敏度并根據(jù)測得的Ct值以及EP402R基因的拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 雙重?zé)晒舛繖z測方法的特異性檢測 以pMD18-T-ASFV-EP402R為陽性對照,GenotypeⅠ ASFV、GenotypeⅡ ASFV、GenotypeⅠ+GenotypeⅡ ASFV、PRRSV、PCV、PRV核酸為模板,ddH2O為陰性對照,使用“1.2.3”反應(yīng)體系進(jìn)行特異性檢測。

1.2.6 臨床樣品的檢測 使用本研究建立的雙重實(shí)時熒光檢測方法與世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦使用的方法對在華南地區(qū)526份送檢樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 雙重實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)對反應(yīng)體系優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果可知,EP402R基因與B646L基因的引物最適終濃度均為0.2 μmol·L-1,EP402R基因與B646L基因的探針最適終濃度均為100 nmol·L-1,故確定雙重實(shí)時熒光定量體系如下:

總體系20 μL:2×AceQ Universal U kit+Probe Master Mix V2 PCR 10 μL,EP402R-R、EP402R-F各0.4 μL,EP402R-Probe 0.2 μL,EB646L-R、B646L-F各0.4 μL,B646L-Probe 0.2 μL,模板2 μL,加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

圖1 B646L實(shí)時熒光定量PCR不同引物、探針濃度擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Real-time PCR amplification results of B646L with different primers and probe concentrations

圖2 EP402R實(shí)時熒光定量PCR不同引物、探針濃度擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Real-time PCR amplification results of EP402R with different primers and probe concentrations

2.2 針對ASFV EP402R基因檢測方法的靈敏性檢測

根據(jù)擴(kuò)增曲線可知,該方法的檢測底限為1.06×101copies·μL-1,表明靈敏度較好。

根據(jù)“1.2.4”測得的Ct值以及EP402R基因的拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。結(jié)果顯示,在1.06×101～1.06×1010copies·μL-1范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)為0.988 8(介于0.95～1.05之間),表明存在良好的線性關(guān)系。

2.3 雙重?zé)晒舛繖z測方法的特異性試驗(yàn)

該檢測方法的特異性結(jié)果顯示,FAM通道的GenotypeⅠ、GenotypeⅡ、GenotypeⅠ+GenotypeⅡ ASFV的混合樣品和VIC通道中的GenotypeⅠ、GenotypeⅠ+GenotypeⅡ ASFV的混合樣品均可顯示出擴(kuò)增曲線。結(jié)果表明,該方法具有良好的特異性,且不與其他常見豬源病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.4 臨床樣品檢測試驗(yàn)

使用本方法對526份送檢臨床樣品進(jìn)行檢測,檢出4份ASFV陽性樣品,其中1份為GenotypeⅠ。

3 討 論

當(dāng)前的ASFV檢測技術(shù)主要分為兩大類:針對病毒DNA的核酸檢測技術(shù);針對病毒抗原、抗體反應(yīng)的免疫學(xué)技術(shù)。由于針對抗體的檢測方法具有一定的滯后性[7],因此能夠在ASFV感染早期快速檢測病毒核酸的qPCR檢測的方法成為了主流。

隨著GenotypeⅠ ASFV在我國流行,Gao等[8]基于CADC推薦使用的ASFV B646L的引物與探針以及針對E183L設(shè)計(jì)的引物與探針建立了鑒別GenotypeⅠ與 GenotypeⅡ ASFV的檢測方法,并驗(yàn)證了CADC推薦使用的ASFV B646L基因引物與探針具有良好的特異性、重復(fù)性以及檢測底限為1.07×102copies·μL-1的較強(qiáng)靈敏度。本研究針對GenotypeⅠ ASFV EP402R基因保守特異性區(qū)域設(shè)計(jì)的引物與探針同樣具有良好的特異性以及重復(fù)性,檢測底限為1.06×101copies·μL-1,對GenotypeⅠ ASFV檢測更為靈敏。此外,通過本研究建立的檢測方法對526份送檢臨床樣品進(jìn)行檢測,檢出4份ASFV陽性,結(jié)果與世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦使用的方法結(jié)果一致,并且其中1份為 GenotypeⅠ ASFV。結(jié)果表明本研究建立的雙重?zé)晒鈱?shí)時定量PCR檢測方法具有高靈敏性和高特異性,可有效用于ASFV的臨床診斷以及GenotypeⅠ ASFV的監(jiān)測。

4 結(jié) 論

本研究通過針對使用中國動物疾病預(yù)防控制中心(CADC)推薦使用的B646L引物與探針,結(jié)合針對GenotypeⅠ ASFV EP402R基因保守特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物與探針,建立了一種在診斷ASF的同時可對ASFV進(jìn)行GenotypeⅠ ASFV鑒別的快速檢測方法。通過試驗(yàn)確定了EP402R基因與E646L基因的引物最適終濃度均為0.2 μmol·L-1,EP402R基因與E646L基因的探針最適終濃度均為100 nmol·L-1,并且經(jīng)試驗(yàn)證明了EP402R引物具有檢測底限為1.06×101copies·μL-1的靈敏性以及良好的特異性,可有效地用于GenotypeⅠ ASFV的檢測與監(jiān)測。