獼猴桃SCoT遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構(gòu)建

張安世 張中海 齊秀娟 劉 瑩 駱 揚(yáng)

(1.焦作師范高等?？茖W(xué)校理工學(xué)院，焦作 454000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009)

獼猴桃SCoT遺傳多樣性分析及指紋圖譜的構(gòu)建

張安世1張中海1齊秀娟2劉 瑩1駱 揚(yáng)1

(1.焦作師范高等專科學(xué)校理工學(xué)院，焦作 454000； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009)

利用SCoT標(biāo)記對(duì)32個(gè)獼猴桃品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。從47個(gè)SCoT引物中篩選了11個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出185個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶180個(gè)，多態(tài)性比率為97.30%。各引物Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)平均為0.238 4，Shannon’s信息指數(shù)(I)平均為0.377 8。利用UPGMA構(gòu)建32份獼猴桃種質(zhì)資源的聚類樹狀圖。在遺傳相似系數(shù)為0.78處可將32個(gè)獼猴桃品種分為5組，聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類基本一致。利用4條引物擴(kuò)增的16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了32個(gè)獼猴桃品種的DNA指紋圖譜，可以將32個(gè)獼猴桃品種區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定。

獼猴桃； SCoT； DNA指紋圖譜； 遺傳多樣性

獼猴桃(Actinidiasp.)為多年生雌雄異株落葉藤本植物，現(xiàn)有54個(gè)種、21個(gè)變種，共計(jì)75個(gè)分類單元，其中我國(guó)有52種，73個(gè)分類單元[1]，已經(jīng)育成的品種或品系達(dá)148個(gè)[2]。以往的研究表明，獼猴桃屬植物從形態(tài)性狀、營(yíng)養(yǎng)成分、性別到染色體倍性變異都有很高的多樣性[3]。但是，由于近年來(lái)栽培品種大面積推廣，導(dǎo)致地方品種日趨減少，使得品種遺傳多樣性下降，遺傳基礎(chǔ)日益狹窄[1]。同時(shí)，由于獼猴桃資源的遺傳背景復(fù)雜,種間雜交和種內(nèi)多倍化的現(xiàn)象突出，研究者對(duì)獼猴桃種間及種內(nèi)的親緣關(guān)系有不同看法[3～4]，因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行獼猴桃品種鑒定和遺傳多樣性評(píng)價(jià)十分必要。目前，已有RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP等多種分子標(biāo)記技術(shù)成功應(yīng)用于獼猴桃遺傳多樣性分析中[1,5～8]，而獼猴桃的SCoT相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism,SCoT)是Collard和Mackill[9]首先在水稻上開發(fā)應(yīng)用的基于SPAR(單引物擴(kuò)增反應(yīng))新的目的基因分子標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)不僅具備了ISSR和RAPD的操作簡(jiǎn)單、通用性良好、多態(tài)性豐富、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又能對(duì)性狀進(jìn)行跟蹤，有利于分子輔助育種[10]，已在多種園藝植物上得到成功應(yīng)用[10～12]。本試驗(yàn)采用SCoT標(biāo)記對(duì)我國(guó)32個(gè)獼猴桃品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建DNA指紋圖譜，為獼猴桃的品種鑒定、雜交育種親本的選配等研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

獼猴桃材料全部采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院鄭州果樹研究所，包括4種32個(gè)品種(表1)。

表1 供試材料

1.1.2 試劑

2×Taq MasterMix(含有Taq DNA Polymerase,2×Taq PCR Buffer,3 mmol·L-1MgCl2和400 μmol·L-1dNTP mix)購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，SCoT引物由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。

1.1.3 儀器

BIOFUGE PRIMO R型冷凍離心機(jī)，NANODROP 1000紫外分光光度計(jì)，PTC-200型PCR儀，G:BOX-HR凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃基因組DNA的提取

采用改良CTAB法[13]提取獼猴桃基因組DNA，并將模板DNA濃度稀釋至20 ng·μL-1，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCoT-PCR分析

選用40個(gè)SCoT單引物(從SC1到SC40)和7個(gè)由SCoT單引物搭配而成的引物組合(SC1+SC31,SC1+SC35,SC13+SC37,SC29+SC31,SC29+SC35,SC29+SC37,SC31+SC35)共計(jì)47個(gè)引物對(duì)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體積10 μL，DNA 0.8 μL，引物0.8 μL，2×Taq MasterMix 5.0 μL，RNase-Free water 3.4 μL。SCoT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃，5 min；94℃，1 min，54℃，1 min，72℃，1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72℃，8 min。4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分離。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

選取條帶清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以1或0表示同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物在遷移距離相同的位置上條帶的有或無(wú)，建立1,0矩陣，利用POPGENE1.32軟件進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)分析，計(jì)算多態(tài)性百分率(PPL)、Nei’s基因多樣性(H)和Shannon’s多樣性指數(shù)(I)。用NTSYS-pc 2.0軟件構(gòu)建UPGMA聚類圖。同時(shí)，參照林青等[12]方法構(gòu)建34個(gè)獼猴桃品種的數(shù)字指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT引物篩選與多態(tài)性分析

以供試的32個(gè)獼猴桃材料對(duì)47個(gè)SCoT引物進(jìn)行了篩選，最終篩選出了條帶清晰、多態(tài)性高的11個(gè)引物，其中，包括9個(gè)SCoT單引物和2個(gè)引物組合。所用引物序列見(jiàn)表2。各引物的多態(tài)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。11個(gè)引物共擴(kuò)增出185個(gè)條帶，多態(tài)性條帶180個(gè)，多態(tài)性比率為97.30%，說(shuō)明獼猴桃具有很高的SCoT多態(tài)性。在被統(tǒng)計(jì)的11個(gè)引物中，引物SC29擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最多，為22個(gè)，引物SC13擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)最少，為13個(gè)，平均每個(gè)引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為16.82個(gè)。引物組合SC29+SC31的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)POPGENE1.32軟件分析得到的獼猴桃遺傳多樣性參數(shù)表明(表3)，各引物Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)的變化范圍為0.164 0～0.288 3，平均值為0.238 4，H值最高的為引物SC31(0.288 3)，H值最低的引物為SC23(0.164 0)；各引物Shannon’s信息指數(shù)(I)的變化范圍在0.284 5～0.437 2，平均值為0.377 8，I值最高的為引物SC29+SC31(0.437 2)，I值最低的引物為SC23(0.284 5)。

2.2 遺傳相似性和聚類分析

利用NTSYS-pc軟件計(jì)算品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)，結(jié)果表明，32個(gè)獼猴桃品種兩兩間的GS在0.529 7～0.962 2，平均值為0.707 4，變幅為0.432 5，說(shuō)明供試品種間存在較大的遺傳差異。其中金魁(雌)和金魁(雄)的GS最大(0.962 2)，親緣關(guān)系最近，布魯諾和紅貝(雄)的GS最小(0.529 7)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 用于SCoT分析的引物序列

表311個(gè)SCOT引物及多態(tài)性分析

Table3TheelevenSCoTprimersusedforthisstudyandtheirpolymorphic

引物Primers總位點(diǎn)數(shù)Numberoftotalloci多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)Numberofpolymorphicloci多態(tài)性百分率(%)Percentageofpolymorphicloci(PPL)Nei’s基因多樣性Nei’sgenediversity(H)Shannon信息指數(shù)Shannoninformationindex(I)SC1141392.860.25850.3994SC1313131000.21310.3572SC2316161000.16400.2845SC2619191000.19060.3204SC2922221000.20080.3305SC31141392.860.28830.4314SC34171694.120.27590.4297SC35141392.860.22260.3462SC37201995.000.28620.4367SC29+SC3121211000.28480.4372SC29+SC3715151000.23320.3761總計(jì)Total185180平均Mean16.8297.300.23840.3778

圖1 引物組合SC29+SC31擴(kuò)增結(jié)果 M.DNA Marker；1～32.材料編號(hào)同表1Fig.1 The SCoT amplification of primer combination SC29+SC31 M.DNA Marker；1-32.The same as table 1

利用NTSYS-pc軟件對(duì)32個(gè)獼猴桃瓜品種進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明(圖2)，在GS為0.78處可將32個(gè)獼猴桃品種分為5組。第1組包括13個(gè)獼猴桃品種：徐香、金魁(雌)、金魁(雄)、翠玉、皖翠、海沃德、中獼2號(hào)、海燕、米良1號(hào)、布魯諾、金碩、楚紅和湘吉紅；第2組為華特(雌)1個(gè)獼猴桃品種；第3組包括8個(gè)獼猴桃品種：紅陽(yáng)、晚紅、黃陽(yáng)(雌)、黃金果、黃陽(yáng)(雄)、金艷、豫黃1號(hào)和瓊漿；第4組包括9個(gè)獼猴桃品種：紅寶石星(雄)、軟紅、紅寶石星(雌)、紅貝(雌)、華紅2號(hào)、華紅1號(hào)、紅貝(雄)、桓優(yōu)1號(hào)和魁綠；第5組為華特(雄)1個(gè)獼猴桃品種。其中第1組除楚紅和湘吉2個(gè)品種外均為美味獼猴桃系列，第3組為中華獼猴桃系列，第4組為軟棗獼猴桃系列，而第2組和第5組為毛花獼猴桃系列，因此，該聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類基本一致。

同時(shí)，利用POPGENE1.32軟件計(jì)算種間的遺傳相似系數(shù)(GS)，結(jié)果表明，中華獼猴桃與美味獼猴桃親緣關(guān)系最近，GS為0.942 0，毛花獼猴桃與中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴的GS分別為0.851 5、0.860 3和0.807 2，因此，相對(duì)于軟棗獼猴，毛花獼猴桃與中華獼猴桃和美味獼猴桃的親緣關(guān)系更近，也與上述聚類結(jié)果基本一致。

2.3 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

通過(guò)篩選的11個(gè)引物對(duì)32種獼猴桃品種的擴(kuò)增結(jié)果分析，選取其中SC29、SC31、SC37和SC29+SC31 4個(gè)引物擴(kuò)增的16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了32個(gè)獼猴桃品種的DNA指紋圖譜(表4)。每個(gè)品種都有唯一的指紋圖譜，可以將32個(gè)獼猴桃品種區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定。

表4 32個(gè)獼猴桃品種的分子指紋圖譜

注:1～32材料編號(hào)同表1；分子指紋1～16分別表示SC29-1189,SC29-589,SC29-522,SC29-387,SC29-311,SC31-1066,SC31-803,SC31-349,SC37-1699,SC37-1114,(SC29+SC31)-1166,(SC29+SC31)-811,(SC29+SC31)-788,(SC29+SC31)-674,(SC29+SC31)-447,(SC29+SC31)-349。

Note:1-32 are the same as table 1; Molecular fringerprints 1-16 represent SC29-1189,SC29-589,SC29-522,SC29-387,SC29-311,SC31-1066,SC31-803,SC31-349,SC37-1699,SC37-1114,(SC29+ SC31)-1166,(SC29+ SC31)-811,(SC29+ SC31)-788,(SC29+ SC31)-674,(SC29+ SC31)-447,(SC29+ SC31)-349.

圖2 32個(gè)獼猴桃品種的聚類圖 1～32材料編號(hào)同表1。Fig.2 Dendrogram for 32 varieties of Actinidia based on SCoT marker 1-32 are the same as table 1.

3 討論

3.1 SCoT標(biāo)記的多態(tài)性分析

SCoT作為一種目的基因分子標(biāo)記(Gene targeted markers，GTMs)[14]，與傳統(tǒng)意義上的隨機(jī)DNA分子標(biāo)記(Random DNA markers，RDMs)相比，SCoT能對(duì)性狀進(jìn)行跟蹤，尋找與重要目標(biāo)性狀緊密連鎖的基因，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助選擇育種[15]，可避免傳統(tǒng)標(biāo)記的盲目性，正逐漸受到越來(lái)越多研究者的重視。多態(tài)性常常作為評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的一種重要依據(jù)，而評(píng)價(jià)多態(tài)性的主要參數(shù)包括DNA擴(kuò)增的總位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)性百分率(PPL)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon信息指數(shù)(I)等。在本研究中，利用SCoT標(biāo)記分析32個(gè)獼猴桃品種，結(jié)果表明，被統(tǒng)計(jì)的11個(gè)引物共擴(kuò)增出185條帶，其中多態(tài)性條帶180條，PPL值高達(dá)97.30%，高于前人利用其它分子標(biāo)記對(duì)獼猴桃品種的檢測(cè)結(jié)果。例如徐小彪等[16]利用EST-SSR標(biāo)記分析33份獼猴桃得到的PPL值為72.7%；賈兵等[5]利用RAPD技術(shù)對(duì)獼猴桃10個(gè)種42個(gè)樣品進(jìn)行了分析，得到的PPL值為93.2%；鄒游[17]等利用ISSR技術(shù)對(duì)14個(gè)獼猴桃品種分析結(jié)果表明，PPL值為82.41%；秦小波[6]等利用AFLP技術(shù)對(duì)西南50個(gè)獼猴桃品種的分析表明，其PPL值僅為66.3%。同樣，在本研究中，Nei’s基因多樣性(H)、Shannon信息指數(shù)(I)分別為0.238 4和0.377 8，也是處于高水平，與劉娟等[8]研究結(jié)果接近。因此，與其它分子標(biāo)記相比，SCoT具有更豐富的多態(tài)性。

3.2 獼猴桃品種的遺傳差異與聚類分析

評(píng)價(jià)獼猴桃品種的遺傳多樣性，了解不同獼猴桃品種之間的遺傳差異，對(duì)于雜交育種中特異性親本的選配具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，32個(gè)獼猴桃品種兩兩間的遺傳相似系數(shù)(GS)在0.529 7～0.962 2，平均值為0.707 4，變幅為0.432 5，說(shuō)明供試品種間遺傳背景較寬，多樣性比較豐富，可以為獼猴桃優(yōu)良品種的選育提供理論依據(jù)。

本研究的聚類結(jié)果表明，在GS為0.78處可將32個(gè)獼猴桃品種分為5組。除毛花獼猴桃的兩個(gè)品種華特(雌)和華特(雄)各自聚為單獨(dú)一組外，中華獼猴桃、美味獼猴桃和軟棗獼猴等3個(gè)獼猴桃品種系列基本各自聚為一組，因此，從整體結(jié)果來(lái)看，該聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類基本一致，說(shuō)明，SCoT標(biāo)記可以用于獼猴桃的遺傳多樣性分析。但是，從圖2也可以看出，SCoT標(biāo)記的分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類也存在一定差異，如2個(gè)中華獼猴桃品種楚紅和湘吉紅聚在了美味獼猴桃一組，這可能是SCoT標(biāo)記本身還有一定的局限性，也可能是中華獼猴桃和美味獼猴桃兩者遺傳關(guān)系的復(fù)雜性所致。中華獼猴桃和美味獼猴桃作為遺傳近緣種，兩者存在著極高的遺傳相似性[3]，有學(xué)者建議可將兩者劃歸為一個(gè)種[5]。同時(shí)，聚類結(jié)果還顯示，美味獼猴桃金魁品種雌、雄株首先聚類，中華獼猴桃黃陽(yáng)品種的雌、雄株和軟棗獼猴桃紅寶石星雌、雄株雖沒(méi)有首先聚類，但也表現(xiàn)了很近的遺傳關(guān)系，與龔俊杰[18]的研究結(jié)果類似。毛花獼猴桃的華特(雌)和華特(雄)各自聚為一組，與預(yù)期并不一致。華特(雌)和華特(雄)均為野生選種，不屬于一個(gè)姊妹系，兩者未能聚在一組，可能與此有關(guān)，也可能與分子標(biāo)記本身的局限性有關(guān)。另外，通過(guò)對(duì)中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴和毛花獼猴桃等4個(gè)種間遺傳關(guān)系分析表明，中華獼猴桃與美味獼猴桃親緣關(guān)系最近。聚類結(jié)果也表明，第1組的美味獼猴桃和第2組的中華獼猴桃首先聚類，顯示了更近的親緣關(guān)系，與相關(guān)研究結(jié)果一致[19～20]。

3.3 獼猴桃品種鑒定與DNA指紋圖譜構(gòu)建

應(yīng)用DNA分子標(biāo)記可直接反映植物品種間的遺傳差異，具有不受環(huán)境因子和時(shí)空條件影響、高效、快捷等優(yōu)點(diǎn)，逐漸取代了依據(jù)形態(tài)學(xué)特征的鑒別方法，已成為植物品種鑒定的最有效的方法。SCoT作為一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)，在植物品種鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建方面已經(jīng)得到了初步應(yīng)用。楊祥燕等[11]利用6個(gè)SCoT引物擴(kuò)增的13個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了中國(guó)22個(gè)番木瓜主栽品種的分子指紋圖譜，每個(gè)品種都有唯一的指紋圖譜；林清等[12]通過(guò)對(duì)5個(gè)SCoT引物在46份供試芥菜種質(zhì)中擴(kuò)增所得的16個(gè)多態(tài)性DNA譜帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，初步構(gòu)建了芥菜種質(zhì)的指紋圖譜，能夠準(zhǔn)確地鑒定這46份芥菜種質(zhì)；蔣林峰等[21]利用5個(gè)引物(包括4對(duì)SSR引物和1個(gè)SCoT引物)上的37條帶構(gòu)建了我國(guó)主栽的21個(gè)鴨茅品種的DNA指紋圖譜。本研究利用SCoT技術(shù),選用4條引物擴(kuò)增的16個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建了32個(gè)獼猴桃品種的DNA指紋圖譜，為獼猴桃品種間的鑒別提供了重要的科學(xué)依據(jù)。

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Special funds for science and technology innovation project of Chinese Academy of Agricultural Sciences(CAAS-ASTIP-2016-ZFRI)

introduction：ZHANG An-Shi(1965—),male,master,professor,Mainly engaged in plant molecular biology research.

date:2016-11-07

GeneticDiversityandFingerprintswithSCoTMarkersinActinidia

ZHANG An-Shi1ZHANG Zhong-Hai1QI Xiu-Juan2LIU Ying1LUO Yang1

(1.School of Science,Jiaozuo Teachers College,Jiaozuo 454000；2.Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450009)

SCoT were used to analysis genetic diversity of the samples of 32Actinidiavarieties. The 11 primers were screened from 47 SCoT primers and 185 SCoT bands were obtained, including 180 polymorphic bands, with a polymorphism rate of 97.30%. The average Nei’s gene diversity(H) and Shannon’s information index(I) were 0.2384 and 0.3778. The cluster analysis conducted with UPGMA showed that 32Actinidiavarieties were divided into 5 groups at the genetic similarity coefficient of 0.78, and the constructed phylogenetic trees based on SCoT were consistent with the morphology results. The DNA fingerprints for 32Actinidiavarieties were established with 16 sites from 4 SCoT primers, and 32Actinidiavarieties could be identified by SCoT fringerprints.

Actinidia;SCoT;DNA fingerprint;genetic diversity

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2016-ZFRI)

張安世(1965—)，男，碩士，教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

2016-11-07

S663.4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.014