板藍(lán)根微粉對雛雞大腸桿菌病的防治試驗

黃 慧 ， 姜曉文 ， 于文會 ， 侯耀杰 ， 李叔洪 ， 王金玉 , 郝敬友

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030 ; 2.哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

板藍(lán)根微粉對雛雞大腸桿菌病的防治試驗

黃 慧1， 姜曉文1， 于文會1， 侯耀杰1， 李叔洪1， 王金玉1, 郝敬友2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江 哈爾濱 150030 ; 2.哈爾濱綠達(dá)生動物藥業(yè)有限公司 ， 黑龍江 哈爾濱 150030)

為了研究板藍(lán)根超微粉對雛雞大腸桿菌病的臨床療效，試驗以板藍(lán)根普通粉做對照。利用50 ℃溫水提取板藍(lán)根超微粉和普通粉活性成分，水溶性活性成分告依春的高效液相檢測，并將水提取物進(jìn)行體外抑菌試驗和體內(nèi)防治試驗。試驗將9日齡雄性雛雞270只，隨機(jī)分為9組，每組30只。分為2個預(yù)防組、5個治療組、模型組及空白組。試驗結(jié)果：板藍(lán)根超微粉和普通粉中告依春含量分別為1.681mg/g，1.067mg/g；板藍(lán)根超微粉對大腸桿菌的抑菌效果高度敏感，其抑菌效果大于普通粉，抑菌環(huán)分別為16 mm和13 mm。體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，板藍(lán)根超微粉預(yù)防有效率90%，普通粉預(yù)防有效率73.33%；板藍(lán)根超微粉治愈率為83.33%，普通粉治愈率為70%，氧氟沙星治愈率為86.7%。結(jié)論：板藍(lán)根超微粉水溶性活性成分告依春溶出率優(yōu)于普通粉，超微粉體外抑菌和體內(nèi)對雛雞大腸桿菌病的防治均優(yōu)于板藍(lán)根普通粉。

板藍(lán)根超微粉 ； 雛雞 ； 大腸桿菌病防治

超微粉碎技術(shù)因其粉體理化性質(zhì)獨特，粉體比表面積和孔隙率增大等優(yōu)點被引入中藥加工領(lǐng)域[1]。一般粉碎技術(shù)對植物細(xì)胞的破壁率較低，一些活性成分不能釋放出來，影響其療效[2]。采用超微粉碎技術(shù)對天然植物進(jìn)行加工，天然植物細(xì)胞的破壁率可達(dá)100%，減小其有效成分溶出時所受到的阻力，活性成分的溶出率提高，減小了服用劑量，節(jié)省原料，降低成本[3]。中草藥經(jīng)超微粉碎后，細(xì)胞破壁率高，有效成分不需要通過細(xì)胞壁可直接曝露出來，提高天然植物有效成分的溶出量和溶出度，吸收速度加快，打破長期以來“中藥起效慢、作用強(qiáng)度低”的思維定勢[4]。但因粉體比表面積增大，吸附性強(qiáng)且流動性變差，致使顆粒處于不穩(wěn)定狀態(tài)，易吸潮及吸附空氣中的雜質(zhì)，同時還易形成假大顆粒[5]等不利因素。板藍(lán)根是中獸醫(yī)臨床常用的清熱解毒藥，生物堿類、有機(jī)酸類、黃酮類、核苷酸類、氨基酸類、多糖類、芥子苷類等大約100多種天然成分[6]。板藍(lán)根有廣譜抗菌作用，對革蘭陽性菌(G+)和革蘭陰性菌(G-)均有抑制作用，其抑菌成分為色胺酮類生物堿[7]。研究表明，板藍(lán)根不僅具有抑菌殺菌的作用，還有抑制細(xì)胞因子活性和抗內(nèi)毒素作用[8]。本試驗通過雛雞大腸桿菌病模型，深入研究板藍(lán)根超微粉對雞大腸桿菌病的防治效果，為今后中藥超微粉碎技術(shù)的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 板藍(lán)根浸提液的制備 將板藍(lán)根超微粉和普通粉溫水(50 ℃)浸提0.5 h，離心后濃縮至濃度為1.0 g/mL的原藥液，高壓滅菌后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 (R,S)-告依春的含量測定 (1) 色譜條件 色譜柱：C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動相：V(甲醇):V(1mL/L磷酸)=7∶93。流速：1.0 mL/min。柱溫度：30 ℃±5 ℃。進(jìn)樣量：10 μL。檢測波長：245 nm；(2)(R,S)-告依春對照品溶液的制備 用電子天平精密稱取(R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻，倍比稀釋得到濃度分別為200 μg/mL ,100 μg/mL, 50 μg/mL ,25 μg/mL ,12.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。超聲使其充分溶解，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 MIC測定：采用二倍稀釋法測定MIC。MBC測定：取不發(fā)生渾濁變化的試管內(nèi)培養(yǎng)液接種于營養(yǎng)平皿，培養(yǎng)18 h后觀察菌落數(shù)確定MBC。

1.4 最佳感染劑量的確定 將12日齡健康雛雞135只隨機(jī)分為9組，每組15只，將菌液依次稀釋為9個不同濃度，分別為2.36×109、1.68×109、8.4×108、4.2×108、2.1×108、1.05×108、5.25×107、2.63×107、1.81×107，每組雛雞胸肌注射不同濃度的菌液0.5 mL/只，記錄72 h內(nèi)雛雞的發(fā)病情況及死亡率。以死亡率在60%～90%的攻菌劑量為最佳感染劑量。

1.5 試驗雛雞分組與給藥 將9日齡雄性雛雞270只，隨機(jī)分30只雛雞為空白組(A)和240只雛雞為感染組，感染組共8組，分為模型組(B)，西藥治療組(C)，超微粉高劑量治療組(D)，超微粉中劑量治療組(E)，超微粉低劑量治療組(F)，普通粉治療組(G)，超微粉預(yù)防組(H)，普通粉預(yù)防組(I)，每組30只。

預(yù)防組于9日齡灌服濃度為0.25 g/mL板藍(lán)根超微粉和普通粉浸提物，給藥量為0.5 mL/只，連續(xù)灌服3 d。12日齡時，除空白組外，其余各組雛雞進(jìn)行胸肌注射大腸桿菌菌液0.5 mL/只。6～12 h部分雛雞出現(xiàn)臨床癥狀后，D組、E組、F組分別按濃度1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.25 g/mL進(jìn)行治療，G組按濃度1 g/mL進(jìn)行治療，D組、E組、F組、G組給藥劑量為 0.5 mL/只。C組按濃度2.5 g/L的氧氟沙星水溶液自由飲水給藥；A組與B組灌服等量的生理鹽水，連續(xù)給藥5 d，觀察7 d，觀察并記錄雞只發(fā)病情況。

1.6 免疫器官指數(shù)的測定 試驗結(jié)束后各組隨機(jī)選取5只雛雞進(jìn)行剖檢，觀察病變特征，并取胸腺和腔上囊，計算免疫器官指數(shù)。

免疫器官指數(shù)(mg/g)=免疫器官重(mg)/體重(g)

1.7 血清生化指標(biāo)及細(xì)胞因子的測定 各組分別于給藥后的第3天、5天、7天時，隨機(jī)選取5只雛雞空腹12 h，心臟采血，分離血清測定IL-1、TNF-α、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(CREA)、尿酸(URIC)含量。

2 結(jié)果

2.1 板藍(lán)根中(R,S)-告依春的含量 (R,S)-告依春標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=40733x+145072，R2=0.999 7。由圖1可知，板藍(lán)根超微粉和普通粉的出峰時間分別為10.964 min，10.947 min。積分面積分別為25692100, 2862088。(R,S)-告依春的含量分別為1.681 mg/g，1.067 mg/g。

2.2 板藍(lán)根超微粉與普通粉對大腸桿菌O78體外抑菌活性檢測結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果表明，板藍(lán)根超微粉對大腸桿菌的抑菌效果高度敏感，其抑菌圈大于普通粉，分別為16 mm和13 mm。兩種板藍(lán)根粉末最小抑菌濃度(MIC)分別為0.125 g/mL和0.25 g/mL，最小殺菌濃度(MBC)均為0.5 g/mL，無差異。由此可知，板藍(lán)根超微粉和普通粉對大腸桿菌均有明顯抑菌效果，且板藍(lán)根超微粉抑菌作用好于板藍(lán)根普通粉。

2.3 雛雞大腸桿菌病模型制備結(jié)果 4.2×108CFU/mL的劑量組死亡率為73.33%，按照死亡率在60%～90%的攻菌劑量為最佳感染劑量，所以選擇4.2×108CFU/mL為最佳感染劑量。攻菌6 h后除空白組和兩組預(yù)防組外，其他各組雛雞出現(xiàn)扎堆，縮頭，兩翅下垂，精神不振，閉眼昏睡等癥狀且排黃色或白色稀便，偶有嚴(yán)重者臥地不起，10 h后預(yù)防兩組開始出現(xiàn)臨床癥狀；12 h時，開始出現(xiàn)死亡雞只，兩組預(yù)防組部分未發(fā)病，其余各組發(fā)病率近100%。

圖1 板藍(lán)根中(R,S)-告依春積分圖

表1 板藍(lán)根抑菌活性及MIC、MBC的檢測結(jié)果

2.4 板藍(lán)根超微粉和普通粉對雛雞大腸桿菌病的防治試驗結(jié)果 由圖2可知，與B組比較，各給藥組均可有效降低死亡率，H組死亡率最低為10%。預(yù)防試驗中，H組治愈率顯著高于I組，為83.33%；治療組中，超微粉各劑量組的治愈率、有效率均優(yōu)于普通粉各組。

圖2 板藍(lán)根對雛雞大腸桿菌病的防治結(jié)果/%

2.5 板藍(lán)根超微粉對雛雞大腸桿菌病免疫器官指數(shù)的影響測定結(jié)果 由圖3可知，板藍(lán)根超微粉和普通粉對大腸桿菌感染的雛雞免疫器官發(fā)育有促進(jìn)作用，且治療組和預(yù)防組的效果均是板藍(lán)根超微粉優(yōu)于普通粉。

2.6 板藍(lán)根微粉對雛雞大腸桿菌病血清中相關(guān)細(xì)胞因子影響測定結(jié)果 如圖4，圖5可知，雛雞血清白細(xì)胞介素-1在5 d時，D組和H組IL-1含量較B組低，差異顯著(P<0.05)；7 d時，D組與B組差異極顯著(P<0.01)，D組效果優(yōu)于G組。雛雞血清腫瘤壞死因子-α在5 d、7 d時，B組顯著高于A組(P<0.05)，各組含量均顯著低于B組(P<0.05)，D組與G組間無明顯差異(P>0.05)。

圖3感染大腸桿菌的雛雞免疫器官指數(shù)的測定結(jié)果

注：與空白組比較，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)；與感染對照組比較，△表示差異顯著
(P<0.05)，△△表示差異極顯著(P<0.01)，下圖同

2.7 板藍(lán)根微粉對雛雞大腸桿菌病血清中轉(zhuǎn)氨酶活性影響測定結(jié)果 由圖6，圖7可知，給藥5 d、7 d時，B組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性極顯著高于各給藥組(P<0.01)，各給藥組間無顯著差異(P>0.05)。5d時，C組、D組、G組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性較B組低，差異極顯著(P<0.01)，7 d時各給藥組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于B組(P<0.05)。

2.8 板藍(lán)根對雛雞大腸桿菌病血清中肌酐、尿酸影響測定結(jié)果 由圖8，圖9可知，7 d時D組和H組的CREA含量顯著低于B組(P<0.05)；給藥3 d、5 d時，B組的URIC含量極顯著高于A組(P<0.01)，各給藥組均極顯著降低了URIC的含量(P<0.01)，7 d時，B組與A組差異顯著(P<0.05)。

圖4 感染大腸桿菌的雛雞血清白細(xì)胞介素-1(IL-1)的測定結(jié)果

圖5 對大腸桿菌感染的雛雞血清腫瘤壞死因子測定結(jié)果

圖6 感染大腸桿菌的雛雞血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性的測定結(jié)果

圖7 感染大腸桿菌的雛雞血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性的測定結(jié)果

圖8 感染大腸桿菌的雛雞血清肌酐(CREA)活性的測定結(jié)果

圖9 對大腸桿菌感染的雛雞血清尿酸(URIC)活性的測定結(jié)果

3 討論

板藍(lán)根超微粉粉體粒徑小，細(xì)胞破壁率高，有效成分不需要受細(xì)胞壁的阻力而直接快速溢出。溶出量和溶出速度均有提高，且化學(xué)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變保持原有的生物活性[9]。本試驗研究結(jié)果可知，板藍(lán)根超微粉中告依春溶出的量較普通粉多，且溶出的速度快，超微粉中告依春溶出量是普通粉的1.58倍。超微粉體外抑菌和體內(nèi)對雛雞大腸桿菌病的防治均優(yōu)于板藍(lán)根普通粉。

板藍(lán)根作為清熱藥對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有廣譜的抗菌作用，由于其化學(xué)成分復(fù)雜，具體的抗菌機(jī)制尚未明確，有效成分可能是一種，也可能是多種成分共同發(fā)揮作用[10]。而糖類、氨基酸類化合物對機(jī)體有免疫調(diào)節(jié)作用，有助于提高機(jī)體抗病能力，在抗菌過程中發(fā)揮一定作用[11-12]。本實驗對板藍(lán)根超微粉和普通粉抗雞源性大腸桿菌效果進(jìn)行對比研究，體外抑菌試驗結(jié)果表明，兩種粒度的板藍(lán)根粉末對雞源性大腸桿菌均有明顯的抑菌效果。藥敏試驗測得板藍(lán)根超微粉和普通粉的抑菌圈分別為16 mm和13 mm，超微粉抑菌效果較普通粉敏感。板藍(lán)根抗菌可以通過影響細(xì)菌的呼吸和代謝，起到直接抑制細(xì)菌生長或殺死細(xì)菌的作用[13]；板藍(lán)根中的活性成分與細(xì)菌的 DNA形成復(fù)合物，影響細(xì)菌 DNA 的復(fù)制，干擾細(xì)菌的繁殖[14]；也可直接作用于細(xì)菌的細(xì)胞壁，抑制細(xì)胞壁的合成[15]；通過改善機(jī)體免疫功能，提高機(jī)體的抗應(yīng)激能力，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體非特異性防御機(jī)能[16]。大腸桿菌的主要致病機(jī)制是引起雛雞嚴(yán)重的急性炎癥反應(yīng)，造成肝、腎損傷。其炎性反應(yīng)與IL-1、TNF-α等炎性因子密切相關(guān)[17]。試驗結(jié)果表明，板藍(lán)根各給藥組及西藥對照組均可降低血清中IL-1、TNF-α的含量，且超微粉效果最佳，3 d時較感染對照組比IL-1、TNF-α的含量均顯著降低，5 d時的含量即與空白組相近，說明板藍(lán)根超微粉能快速有效的降低雛雞大腸桿菌病的炎性因子水平，減輕炎癥反應(yīng)。從肝、腎功能指標(biāo)上看，板藍(lán)根超微粉及普通粉均有保護(hù)肝腎及對肝腎損傷具有修復(fù)作用，但超微粉效果優(yōu)于普通粉。其作用機(jī)制是板藍(lán)根中的活性成分通過抗炎或中和細(xì)菌毒素來發(fā)揮作用，還待于進(jìn)一步研究。

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ThestudyofRadixIsatidisSuperfinePowderonChickColibacillosis

HUANG Hui1, JIANG Xiao-wen1, YU Wen-hui1, HOU Yao-jie1, LI Shu-hong1, WANG Jin-yu1, HAO Jing-you2

(1.College of veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Harbin Lvdasheng Animal Pharmaceutical Co.,Ltd,Harbin 150030,China)

In order to study the clinical effect of ultra fine powder of Radix Isatidis on Colibacillosis in chickens, Radix Isatidis powder was taken as control group. The active ingredients of ultra fine powder and ordinary powder were extracted with 50℃ water. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to detect the water soluble active components content of epigoitrin, and water soluble active ingredients were tested for bacteriostatic experimentsinvitroand prevention experimentsinvivo270 male chickens of 9 day old were randomly divided into the following nine groups, two prevention groups, five treatment groups model group and control group,and each group had 30 chickens,The results showed that the contents of epigoitrin in ultra fine powder of Radix Isatidis and in Radix Isatidis were 1.681 mg/g and 1.067 mg/g, respectively.The ultra fine powder of Radix Isatidis was highly sensitive to the inhibitory effect ofEscherichiacoli, and its inhibition effect was greater than ordinary powder, the inhibition rings of ultra fine powder of Radix Isatidis and ordinary powder of Radix Isatidis were 16 mm and 13 mm, respectively.Invivostudy, the prevention efficiency of Radix Isatidis ultra fine powder was 90% and the prevention efficiency of common powder was 73.33%.The cure rate of ultrafine powder of Radix Isatidis was 83.33% and the cure rate ordinary powder was 70%.The cure rate of Ofloxacin was 86.7%.We conclude that the dissolution rate of water soluble active ingredient epigoitrin of Radix Isatidis ultrafine powder is better than that of ordinary powder, and the bacteriostatic of Colibacillosisinvitroand preventioninvivoof ultra fine powder of Radix Isatidis are better than ordinary powder of Radix Isatidis.

ultra fine powder of Radix Isatidis ; chicken ; prevention and treatment of colibacillosis

YU Wen-hui

R378.2+1

A

0529-6005(2017)09-0053-05

2017-05-02

黃慧(1990-)，男，碩士生，主要研究方向為中藥抗菌及獸醫(yī)臨床應(yīng)用，E-mail:773429067qq.com

于文會，E-mail:yuwenhui@neau.edu.cn