干細(xì)胞聯(lián)合人工耳蝸植入治療感音神經(jīng)性聾的研究現(xiàn)狀

王梅 王新蘭 鐘翠萍

1 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（蘭州730050）2 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院研究生院（銀川750004）

聽覺是人類感知外界事物的重要方式之一，聽力損失會給個人、家庭及社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。目前全世界大約有4.66億人患有永久性聽力喪失，SNHL約占所有聽力損失病例的85%，其中兒童占3400萬人[1]，聽力損失影響兒童的認(rèn)知、語言和社會心理發(fā)展，而在老年人中，聽力損失同樣與認(rèn)知能力下降和抑郁有關(guān)。造成SNHL的原因有很多，其中主要原因包括外傷、接觸耳毒性藥物、基因突變、病毒感染、炎癥或內(nèi)淋巴水腫等。目前SNHL的主要治療方法是佩戴助聽器和植入人工耳蝸，對于重度SNHL助聽器治療效果并不顯著，相反人工耳蝸植入通過電刺激聽覺神經(jīng)將聽覺信息傳遞至中樞，對于改善聽力相對有效。位于內(nèi)耳的感覺毛細(xì)胞及其所連接的SGNs在人工耳蝸通過電刺激將外界聲音轉(zhuǎn)化為電信號并傳輸至中樞神經(jīng)的過程中起重要作用。但是臨床實踐表明，并不是所有患者在人工耳蝸植入后都能達(dá)到預(yù)期效果，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)聽覺神經(jīng)的數(shù)量與功能在人工耳蝸傳遞至大腦的信息質(zhì)量方面起重要作用，也就是說聽神經(jīng)功能退化是影響人CI術(shù)后效果的一個重要因素。以往對于CI術(shù)后病人尸體顳骨組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，所有CI術(shù)后患者顳骨均有不停程度的損傷和炎癥反應(yīng)[2]，人工耳蝸植入術(shù)后炎癥反應(yīng)普遍存在，以耳蝸入口處炎癥反應(yīng)較遠(yuǎn)側(cè)炎癥反應(yīng)更為強(qiáng)烈，提示耳蝸植入損傷是炎癥的促發(fā)因素之一[3]。另有Seyyedi[18]的研究證實了CI術(shù)后通常導(dǎo)致SGNs退化，導(dǎo)致植入耳中的平均SGNs計數(shù)低于未植入耳中的計數(shù)，而SGNs的損傷是不可逆的[3]。很多研究者正在尋找延緩或防止神經(jīng)變性并使其恢復(fù)到正常狀態(tài)的方法，但是結(jié)果并不理想。因此，學(xué)者們開始尋找更有效的治療方法，干細(xì)胞移植聯(lián)合人工耳蝸植入作為一種新的有望用于臨床的治療方法被推出。本文旨在對干細(xì)胞移植、CI術(shù)后效果與SGNs計數(shù)、神經(jīng)營養(yǎng)及電刺激治療之間的關(guān)系進(jìn)行綜述，并且討論CI聯(lián)合干細(xì)胞移植面臨的治療難點。

1 SGNs計數(shù)與CI患者預(yù)后之間的關(guān)系

SGNs作為聽覺神經(jīng)的傳入軸突，以及人工耳蝸植入物的主要靶器官，其主要是通過電刺激SGNs，將耳蝸毛細(xì)胞的外周聽覺信息傳遞到中樞聽覺通路。迄今為止，改善SNHL患者聽覺的主要途徑是通過人工耳蝸植入對殘余SGNs的慢性電刺激從而獲得部分聽覺[4-6]。而廣泛的SGNs變性可能對耳蝸植入物的臨床療效產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，了解耳聾后SGNs的存活狀態(tài)對于這些神經(jīng)元保護(hù)和再生的策略是很重要的。

SGNs是一級神經(jīng)元，它將人工耳蝸產(chǎn)生的電刺激傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)。目前有許多研究者以SNHL患者殘余SGNs數(shù)量和CI術(shù)后效果是否存在存在一定相關(guān)性，進(jìn)行研究。Khan[7]等人曾對15名單側(cè)CI尸體顳骨組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)殘余SGNs數(shù)量與語言識別能力之間無顯著相關(guān)性。Xu[8]等在對4名受試者的顳骨研究中得出了相似的結(jié)論。Linthicum[9]在其研究中表明長期耳聾患者的人工耳蝸植入效果不佳與SGNs的持續(xù)退化無關(guān)。但Fayad[10]在14名CI患者遺體顳骨的組織學(xué)檢查中，發(fā)現(xiàn)CI術(shù)后殘余SGNs的數(shù)量與患者術(shù)后表現(xiàn)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.632，P≤0.047）。而Otte[11]等人在對82具未植入人工耳蝸的SNHL患者遺體顳骨研究中，報告了SGNs數(shù)量與語言識別能力的顯著相關(guān)性。另有研究證實，受試者的雙耳因相同的病因?qū)е露@，則雙側(cè)耳蝸的SGNs計數(shù)在統(tǒng)計學(xué)上沒有差異[12]。Seyyedi[13]在控制耳聾病因、年齡和認(rèn)知能力等多個變量的情況下，對以單耳為對照的雙側(cè)IC植入后耳蝸殘余SGNs計數(shù)與語言識別能力之間的相關(guān)性進(jìn)行研究，優(yōu)化后的匹配技術(shù)使得語言識別分?jǐn)?shù)與SGNs計數(shù)的差異具有很強(qiáng)的相關(guān)性（r=0.934，P值=0.006，n=6）。Wise[14]的研究顯示隨著耳聾時間的延長，SGNs數(shù)量顯著降低。Long[15]和他團(tuán)隊的研究結(jié)果表明，SGNs丟失是CI術(shù)后語言理解能力降低的重要因素，其結(jié)果同樣解釋了CI患者臨床結(jié)果的變異性高，并證實了非創(chuàng)傷性手術(shù)、保護(hù)性或再生性干預(yù)研究的重要性。

盡管SGNs數(shù)量并不太可能是CI術(shù)后影響聽力的唯一決定因素，但是越來越多的研究證明大量存活的SGNs對于CI術(shù)后患者預(yù)后有有利影響，組織病理學(xué)與患者臨床癥狀研究相結(jié)合有助于進(jìn)一步闡明SGN存活數(shù)量與CI術(shù)后患者聽力相關(guān)。

2 CI患者預(yù)后與神經(jīng)營養(yǎng)治療及電刺激治療之間的關(guān)系

存活SGNs數(shù)量和完整性、其與中樞連接的健康狀況、耳蝸電極與神經(jīng)元的接近程度以及長時間沒有聽覺輸入后中央聽覺通路連接退化的程度等因素可能會影響CI術(shù)后效果[16,17]。Seyyedi[18]和Leake[19]等人報道通過人工耳蝸植入的慢性雙極性刺激對SGNs的生存有保護(hù)作用。同樣，有報道稱，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子3（NT3）等可以促進(jìn)重度SNHL患者SGNs的存活。有研究表明，人工耳蝸植入體的慢性電刺激可以輔助外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT）提高SGNs存活率，當(dāng)去除NT供應(yīng)后，持續(xù)的慢性電刺激可維持顯著的SGN生存效應(yīng)[20,21]。在此基礎(chǔ)上，Wise[22]等將含有綠色熒光蛋白標(biāo)記的腺病毒載體（含/不含BDNF和NT3）基因注入耳蝸鱗片介質(zhì)室，結(jié)果表明NT基因治療對于SGNs有明顯保護(hù)作用，但其保護(hù)作用隨著耳聾持續(xù)時間的增加而降低。因此，將耳蝸植入物的電刺激與NT基因治療結(jié)合起來，可以提高SGNs存活率[23]。此外，富含生長因子的部分血液成分有望通過提高SGNs存活率及其與電極的粘附性來優(yōu)化人工耳蝸和SGNs中的電極-神經(jīng)相互作用[24]，有必要進(jìn)行進(jìn)一步研究，以驗證它們在體內(nèi)的作用機(jī)理，并得出臨床適用的生物療法。Landry[25]等利用致聾豚鼠耳蝸研究慢性電刺激治療后的耳蝸組織病理學(xué)反應(yīng)，結(jié)果顯示長期耳聾受試者在NT治療后耳蝸的SGNs存活率增加（雙向方差分析，P＜0.05），聽覺電生理檢測（EABR）閾值降低，同時表明慢性電刺激并不能提高SGNs生存率，并解釋與其他實驗得出不同結(jié)果可能是方法上的差異，包括治療前耳聾持續(xù)時間、治療技術(shù)以及刺激參數(shù)等方面的因素。Hadler[26]在其研究中表述電極插入后，炎癥因子、異物、血液等對外淋巴液的污染和手術(shù)局部感染會造成結(jié)締組織過度生長，導(dǎo)致電極-組織界面的阻抗增加從而影響了不同聲音頻率對選擇性神經(jīng)元的的刺激，作者利用帶正電荷的聚（2-甲基丙烯酰氧基）乙基三甲基氯化銨（PMTA）促進(jìn)了膠質(zhì)細(xì)胞的粘附和增殖，間接地增加SGNs的營養(yǎng)支持及軸突的生長。有人指出，在SGNs存活率較低或不穩(wěn)定的患者耳蝸中，人工耳蝸植入體慢性電刺激對SGNs保護(hù)作用的有效性顯著降低[27]。人工耳蝸植入物和周圍神經(jīng)刺激相關(guān)研究表明，電刺激可促進(jìn)神經(jīng)元損傷后的軸突生長[14]。最近有研究表明丙戊酸能促進(jìn)SGNs神經(jīng)分化，使軸突生長旺盛，從而在與CI結(jié)合時恢復(fù)聽力[28]。由于聽覺神經(jīng)元和CI電極之間的解剖學(xué)間隙導(dǎo)致電流擴(kuò)散和非特異性神經(jīng)刺激，CI用戶的頻率辨別很差，Li[29]和他的團(tuán)隊通過使用可生物降解的磷酸鈣納米球（CPHS）涂敷在CI電極上并裝載神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，結(jié)果表明，通過CPHS涂層遞送神經(jīng)營養(yǎng)素來關(guān)閉聽覺神經(jīng)元與電極之間的解剖學(xué)差異，從而使CI患者的選擇性神經(jīng)激活和良好聽力成為可能。

3 人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）實現(xiàn)SGNs的再生與修復(fù)

使用干細(xì)胞替換丟失的聽神經(jīng)并改善它們的中樞連接是一種可以用來提高耳蝸植入體性能的方法。有人已經(jīng)研究了干細(xì)胞在耳蝸康復(fù)中的應(yīng)用，包括毛細(xì)胞和聽覺神經(jīng)元的替換。干細(xì)胞療法在耳蝸中的主要作用是替換受損或丟失的聽覺細(xì)胞。動物研究證明，現(xiàn)在已經(jīng)有多種類型干細(xì)胞被輸送到內(nèi)耳用于毛細(xì)胞或SGNs的替代治療，其中包括骨髓干細(xì)胞[30]、胚胎干細(xì)胞[31]以及人iPSC等對以往研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞及iPSC相對安全[32]。iPSC由日本學(xué)者通過人為表達(dá)四種基因（轉(zhuǎn)錄因子OCT4，MYC，SOX2和KLF4）重新編程成纖維細(xì)胞使之進(jìn)入多能狀態(tài)（類似胚胎干細(xì)胞）[33]，獲得有自我更新和分化的全能性，從理論上講，人iPSC可從移植個體自身取得，從而避免了免疫排斥反應(yīng)及倫理學(xué)問題，并具有大規(guī)模生產(chǎn)的潛力。已有報告描述了小鼠iPSC細(xì)胞向聽覺神經(jīng)元的分化。王翠翠[34]等人利用iPSCs的定向分化，發(fā)現(xiàn)iPSC可分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞并且具有向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化的潛能，將分化后的內(nèi)耳祖細(xì)胞移植到具有Mitf-M基因突變耳聾豬模型內(nèi)耳中，移植四周后發(fā)現(xiàn)在柯替氏器周圍靠近蓋膜的地方發(fā)現(xiàn)了標(biāo)記細(xì)胞，但是只有少數(shù)細(xì)胞整合到聽覺上皮組織中。一項體外培養(yǎng)的毛細(xì)胞研究中，人iPSC衍生的神經(jīng)元可以直接與突觸形成突觸前連接，此外，還觀察到在分化早期階段，來自神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)祖細(xì)胞具有更高的神經(jīng)支配潛能[35]。Chen[36]等研究了人iPSC誘導(dǎo)的上皮祖細(xì)胞在小鼠耳蝸中的遷移、分化和突觸連接，結(jié)果證實iPSC衍生的上皮祖細(xì)胞可以分化為具有典型的形態(tài)學(xué)特征和電生理特性的類毛細(xì)胞，在體外，上皮祖細(xì)胞衍生的類毛細(xì)胞在共培養(yǎng)中與SGNs形成突觸連接，在體內(nèi)，部分移植細(xì)胞遷移到位于皮質(zhì)醇器官內(nèi)的毛細(xì)胞的位置，分化成類毛細(xì)胞，并與耳源性SGNs形成突觸連接，這也許可以成為iPSC在聽覺細(xì)胞替代中的研究基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步研究耳聾患者干細(xì)胞移植聯(lián)合CI治療的可能性。

4 干細(xì)胞移植聯(lián)合人工耳蝸植入治療的難點及挑戰(zhàn)

近年來，毛細(xì)胞的相關(guān)研究取得了巨大的突破。從細(xì)胞系的建立，到一套成熟的培養(yǎng)方法的建立，再到后來的毛細(xì)胞以及類毛細(xì)胞的成功誘導(dǎo)以及分化各階段的檢測策略的建立等，都是研究者們不斷探索成功的結(jié)果。但是目前仍有許多挑戰(zhàn)：①SGNs再生及誘導(dǎo)率問題，SGNs誘導(dǎo)率還很低。②再生毛細(xì)胞及SGNs生理功能問題。雖然已有多種體外毛細(xì)胞檢測判定方式，但都比較片面，目前無公認(rèn)的權(quán)威方法來判定毛細(xì)胞或類毛細(xì)胞的功能。③植入方式問題。盡管現(xiàn)在有多種植入方式，如從圓窗、蝸軸、半規(guī)管、鼓階等，但以上方式都會對內(nèi)耳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的損傷，不利于殘余聽力的保存，未來可探索降低內(nèi)耳損傷的移植方法，如腰椎穿刺蛛網(wǎng)膜下腔移植入路[37]。④植入后存活率以及發(fā)揮生理功能等問題都是目前面臨的困難與挑戰(zhàn)。干細(xì)胞移植聯(lián)合人工耳蝸植入能否在形態(tài)和功能上融入耳聾患者的人工耳蝸環(huán)境以改善聽力還不確定。有研究表明干細(xì)胞內(nèi)耳移植不僅能替代受損的SGNs，同時還可以為其提供神經(jīng)營養(yǎng)作用[38]。SGNs與毛細(xì)胞形成突觸并持續(xù)接觸才能存活，在Niliksha的研究中不僅證明人iPSC能與毛細(xì)胞形成功能性突觸，同時表明了分化后的神經(jīng)元具有明顯的神經(jīng)表達(dá)功能[35]。有理由認(rèn)為干細(xì)胞源性神經(jīng)元與耳蝸源性神經(jīng)元之間的功能性突觸的形成對于有意義的聽覺處理至關(guān)重要。⑤到目前為止，大部分研究都停留在動物模型階段，基于動物實驗的研究結(jié)論推測用于臨床的治療效果，需要考慮人與動物生理學(xué)之間的差異。Roemer[39]用從骨髓中分離出具有釋放抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用的多種因子的自體單核細(xì)胞，使用纖維蛋白粘合劑作為載體，研究出一種生物混合電極，并將其植入三名患者體內(nèi)，這是使用自體細(xì)胞移植到人類內(nèi)耳的第一份報告。雖然今后還需要大量列隊研究資料來加以驗證治療效果，但這也是邁向臨床治療的一個良好開端。

當(dāng)前臨床上有耳蝸神經(jīng)發(fā)育不良或未發(fā)育的患者，人工耳蝸植入的效果較差甚至無效，結(jié)合電刺激及神經(jīng)營養(yǎng)治療對干細(xì)胞影響的研究結(jié)果，干細(xì)胞移植修復(fù)內(nèi)耳與CI結(jié)合也將會是解決這一類臨床問題的研究熱點?；诂F(xiàn)有的研究基礎(chǔ)及目前的科研技術(shù)，我們相信在未來干細(xì)胞移植聯(lián)合CI將會給SNHL患者帶來福音。