普通小麥 Glu-3位點基因單元型的分離和序列分析

董 雪，王 增，劉 夢，楊 燕 ，韓 冰，李淑芬，趙獻林

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院植物生物技術功能實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所/河南省小麥生物學重點實驗室/小麥國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室,河南鄭州 450002)

普通小麥 Glu-3位點基因單元型的分離和序列分析

董 雪1，王 增1，劉 夢1，楊 燕1，韓 冰1，李淑芬1，趙獻林2

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院植物生物技術功能實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所/河南省小麥生物學重點實驗室/小麥國家工程實驗室/農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室,河南鄭州 450002)

為了從分子水平上探討優(yōu)質(zhì)小麥資源中LMW-GS等位基因與小麥品質(zhì)的關系，以及在改善小麥品質(zhì)方面的潛在價值，利用小麥 Glu-A3和 Glu-B3基因的特異引物從強筋型、中筋型和弱筋型小麥共計10份材料中分離出LMW-GS基因后進行序列分析。結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)14個新的核苷酸變異類型和4個肽鏈變異類型。其中，14個新的核苷酸變異類型中，4個為 Glu-A3基因變異類型，1個為 Glu-B3基因變異類型，9個為 Glu-D3基因變異類型。值得注意的是，有2個半胱氨酸數(shù)目特殊的亞基類型被發(fā)現(xiàn)，一個是來自師欒02-1含有9個半胱氨酸殘基的 GluA3-18基因，另一個是來自偃展4110含有7個半胱氨酸殘基的 GluD3-13基因。

普通小麥；低分子量麥谷蛋白亞基；基因分離； Glu-3位點

根據(jù)筋度的不同，小麥可分為強筋、中筋和弱筋三種類型，其中強筋和弱筋小麥一般稱為優(yōu)質(zhì)麥。強筋型小麥多用于制作面包，弱筋型小麥多用于制作餅干、糕點等。然而，我國的強筋型小麥和弱筋型小麥品種較少，生產(chǎn)上種植的品種多數(shù)為中筋型小麥。

小麥貯藏蛋白主要包括麥谷蛋白和醇溶蛋白，而麥谷蛋白的含量對面筋強度有著重要的影響。根據(jù)分子量大小，可將麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)[1]，其中，LMW-GS約占麥谷蛋白的60%。由于LMW-GS拷貝數(shù)較多，加之其分子量與醇溶蛋白分子量相似，傳統(tǒng)分離方法SDS-PAGE很難將其區(qū)分開來，因此對LMW-GS的研究遠不及HMW-GS那么深入。目前，采用特異性引物從小麥栽培品種及其近等基因系和近緣種中發(fā)現(xiàn)的LMW-GS基因、基因片斷和假基因已經(jīng)超過200個[1-5]，其中在普通小麥中被報道的編碼LMW-GS家族的 Glu-3基因位點約有70個[1]。許多研究認為， Glu-3位點編碼的LMW-GS等位基因?qū)π←溒焚|(zhì)有重要影響，其中 Glu-A3位點上的 Glu-A3b和 Glu-A3d等位基因?qū)υ鰪娒鎴F特性和改善烘烤品質(zhì)方面有著重要貢獻[6-9]。大部分LMW-GS通過第一組染色體短臂上的 Glu-3( GluA-3、 Glu-B3和 GluD-3)位點編碼[10]，在其他位點上也相繼有過報道，如在染色體1B上的 Glu-B2和 Glu-B4[11]，在染色體1D上的 Glu-D4和7D上的 Glu-D5[12-13]。目前無論是在普通小麥或是近緣種材料中，對D染色體上的LMW-GS基因的研究要比對A和B染色體上的研究多一些。由于3個位點中不同等位基因的亞基間分子量很接近，且有的亞基鑒定需要依賴其濃度進行區(qū)分[2,13]，所以很難發(fā)現(xiàn)新的亞基。由于LMW-GS對小麥加工品質(zhì)的重要性，鑒定LMW-GS基因的等位變異及開發(fā)出相應的分子標記對小麥品質(zhì)育種具有重要意義[14]。目前已研發(fā)出了一些LMW-GS基因的功能標記，如Zhang等[15]根據(jù) Glu-A3位點的1個LMW-GS基因的等位變異開發(fā)出一套 Glu-A3位點等位基因的PCR標記，可以有效地鑒定出該位點的等位基因類型，并在小麥資源及育種材料的篩選中加以利用[16-18]；Zhao等[19]從 Glu-D3位點擴增出6個LMW-GS基因的12個等位變異，并根據(jù)各基因等位變異之間的SNP或Indel開發(fā)出了7個單元型的STS標記。

目前，人們較少利用不同筋度的小麥為材料來研究其中的LMW-GS的基因。鑒于此，本試驗利用已知不同筋力的普通小麥材料以及 Glu-A3和 Glu-B3位點的特異引物，對相應的LMW-GS基因進行擴增和鑒定，以期發(fā)現(xiàn)新的基因單元型，探討不同筋力小麥品種的LMW-GS基因差異，為小麥品質(zhì)育種中親本的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共計10份，包括鄭麥366(半冬性)、鄭麥9023(弱春性)和師欒02-1(半冬性)3份強筋型，矮抗58(半冬性)、周麥18(半冬性)、石家莊8號(半冬性)和偃展4110(弱春性)4份中筋型，鄭麥004(半冬性)、豫麥50(弱春性)和揚麥13號(春性)3份弱筋型，均由河南農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所提供。

1.2 DNA的提取

每份小麥材料取3～5粒種子置于潔凈的培養(yǎng)皿中，在25 ℃條件下培養(yǎng)5～7 d，取2～3 g葉片，采用CTAB法[20]提取基因組DNA。

1.3 引物的篩選和PCR擴增

LMW-GS基因 Glu-A3位點和 Glu-B3位點上的特異性引物選自王林海[18]的文章，具體見表1。

PCR擴增體系50 μL，包括模板DNA 100 ng、上下游引物(20 μmol·L-1)各1 μL、TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1，TaKaRa Ex) 1 μL、10×PCR buffer 5 μL、dNTP Mix (2.5 mmol·L-1)4 μL，其余用ddH2O補足。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，57～61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 PCR產(chǎn)物的純化、克隆及測序

PCR產(chǎn)物電泳檢測后，在紫外燈下切取目的條帶，用天根公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化(具體步驟見其說明書)。將純化后的PCR產(chǎn)物連接至PMD19-T載體(北京全式金生物技術有限公司)上(連接體系：SolutionⅠ 5 μL、PMD19-T 1 μL、純化后的PCR產(chǎn)物4 μL)，16 ℃連接12 h，4 ℃保存。連接產(chǎn)物通過熱擊法進行轉(zhuǎn)化，之后進行克隆子的鑒定，最后送南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序，每個樣品測3～6次重復。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 序列分析

用DNAMAN 6.0漢化版軟件進行蛋白質(zhì)翻譯及多序列比對等處理；用Vector NTI Advance 11.5.2軟件進行肽鏈分子量的計算；用MEGA 4.0軟件構(gòu)建基因進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1Glu-A3基因等位變異的分離和序列分析

利用引物LA1F/LA1R對強筋、中筋、弱筋型10份小麥材料進行PCR擴增，共獲得8個條帶(圖1A)，經(jīng)測序得到3個不同的序列。將這3個序列與GenBank中已知的 GluA3-1基因核苷酸和氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，獲得的3個 GluA3-1單元型均不是新的等位變異類型，其中在鄭麥366、鄭麥9023、周麥18、偃展4110、豫麥50和揚麥13號中得到了相同的單元型 GluA3-13，在石家莊8號中得到了單元型 GluA3-17，在師欒02-1中得到了單元型 GluA3-18。不過，從強筋小麥品種師欒02-1中擴增的1個等位變異是首次在普通小麥中發(fā)現(xiàn)，且與本人先前從栽培二粒小麥DM2中擴增出的等位變異類型 GluA3-18(GenBank登錄號為KX879094)相同。該基因序列長度為1 537 bp，編碼區(qū)長度為1 164 bp。經(jīng)與 GluA3-11(GenBank登錄號FJ549928.1)進行對比后發(fā)現(xiàn)， GluA3-18在編碼區(qū)的第212、596和965位堿基后分別插入了24、3和9 bp堿基。此外，該序列還存在19個SNP，其中11個為錯義突變。值得注意的是，在924 bp處堿基C替換成T，使得對應氨基酸R替換成了C，導致 GluA3-18編碼的氨基酸序列AP1-8含有9個半胱氨酸殘基，多出的一個半胱氨酸位于半胱氨酸富集區(qū)。

利用引物LA2F/LA2R對強筋、中筋、弱筋型10份小麥材料進行PCR擴增，共獲得9個條帶(圖1B)，經(jīng)測序得到4個不同的序列。將這4個序列與GenBank中已知的 GluA3-1基因核苷酸和氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果(表2)發(fā)現(xiàn)，有2個序列為新的等位變異，命名為 GluA3-25和 GluA3-26(GenBank登錄號分別為KX879099和KX879100)，分別來自品種師欒02-1和豫麥50。 GluA3-25和 GluA3-26基因長度分別為1 100 bp和1 097 bp，編碼區(qū)長度分別為912 bp和909 bp。在編碼區(qū)域內(nèi)，與 GluA3-21(GenBank登錄號為FJ549935.1)相比，二單元型在第306個堿基處發(fā)生了無義突變，形成了終止密碼子，為假基因。

利用引物LA3F/LA3R對強筋、中筋、弱筋型10份小麥材料進行PCR擴增，共獲得9個條帶(圖1C)，經(jīng)測序得到4個不同的序列。其中，來自矮抗58和石家莊8號的序列為新等位變異，分別命名為 GluA3-37和 GluA3-38(GenBank登錄號分別為KX879106和KX879107)，序列長度分別為1 408 bp和1 393 bp，完整編碼區(qū)長度分別為1 032 bp和1 017 bp。在編碼區(qū)內(nèi)，與 GluA3-31(GenBank登錄號：FJ549939.1)相比， GluA3-37和 GluA3-38在第417 bp處發(fā)生了無義突變，形成終止密碼子，為假基因。

A：引物LA1F/LA1R的擴增產(chǎn)物；B：引物LA2F/LA2R的擴增產(chǎn)物；C：引物LA3F/LA3R的擴增產(chǎn)物。M:DL2000；1：鄭麥366；2：鄭麥9023；3：師欒02-1；4：矮抗58；5：周麥18；6：石家莊8號；7：偃展4110；8：鄭麥004；9：豫麥50；10：揚麥13號。

A:PCR products amplified with the primer LA1F/LA1R; B:PCR products amplified with the primer LA2F/LA2R; C:PCR products amplified with the primer LA3F/LA3R.M:DL2000; 1:Zhengmai 366; 2:Zhengmai 9023; 3:Shiluan 02-1; 4:Aikang 58; 5:Zhoumai 18; 6:Shijiazhuang 8; 7:Yanzhan 4110; 8:Zhengmai 004; 9:Yumai 50; 10:Yangmai 13.

圖13對Glu-A3位點基因特異性引物在普通小麥中的PCR擴增產(chǎn)物

Fig.1PCRproductsofGlu-A3amplifiedwiththreegene-specificprimersfromcommonwheat

表2 10份普通小麥中擴增獲得的單元型Table 2 Haplotypes amplified from the ten common wheats

加粗體表示假基因；“-”表示沒有擴增出相應單元型；下劃線表示新發(fā)現(xiàn)的單元型及肽鏈。

Pseudogenes are in bold; “-” represents no amplification; The newly discovered haplotypes and peptide chains are underlined.

2.2Glu-B3和Glu-D3基因等位變異的分離和序列分析

利用引物LB1F/LB1R對強筋、中筋、弱筋型10份小麥材料進行PCR擴增，結(jié)果(圖2A)發(fā)現(xiàn)，在鄭麥366、鄭麥9023和石家莊8號中擴增出了相同的核苷酸序列(1 184 bp)，與 GluB3-41(GenBank登錄號為EU369724.1)的相似性高達99.9%，且編碼區(qū)核苷酸序列相同(1 056 bp)，僅在3′-UTR有1個變異堿基(T→C)，將該序列命名為 GluB3-418(GenBank登錄號：KY430288)；在師欒02-1和揚麥13號中擴增的核苷酸序列也相同(1 187 bp)，與 GluD3-11(GenBank登錄號為DQ357052.1)的相似性高達99.8%，且編碼區(qū)核苷酸序列相同(1 056 bp)，僅5′-UTR和3′-UTR分別有1個變異堿基(T→G、T→C)，將該核苷酸序列命名為 GluD3-18(GenBank登錄號KY430289)；在矮抗58中獲得2種DNA序列，一種長度為1 043 bp，與 GluD3-42相似性高達99.1%，編碼區(qū)序列相同(915 bp)，僅在3′-UTR有9個變異堿基，命名為 GluD3-44(GenBank登錄號：KY430290)，另一個長度為1 055 bp，與 GluD3-21(GenBank登錄號：DQ357054.1)的相似性為99.8%，編碼區(qū)序列長度相同(927 bp)，但有1個變異堿基(C→T)，導致對應氨基酸T替換成I，將該基因命名為 GluD3-24(GenBank登錄號：KY436383)，并將推導的氨基酸序列命名為P-24；在偃展4110中擴增的核苷酸序列長度為1 055 bp，與 GluD3-21的相似性高達99.9%，編碼區(qū)序列相同(927 bp)，僅在5′-UTR區(qū)有1個變異堿基(G→A)，命名為 GluD3-25(GenBank登錄號：KY430291)；而在周麥18、鄭麥004和豫麥50中并未擴增出條帶。

利用引物LB2F/LB2R在不同筋度的小麥品種中共擴增到9個條帶，測序后得到5個新的序列變異類型(圖2B)。其中，從鄭麥366、鄭麥9023、師欒02-1和揚麥13號中得到的核苷酸序列相同，命名為 GluD3-16(GenBank登錄號：KY430292)；從矮抗58和周麥18中得到的核苷酸序列相同，命名為 GluD3-17(GenBank登錄號：KY430293)。 GluD3-16和 GluD3-17的核苷酸序列長度均為1 341 bp，編碼區(qū)長度為1 056 bp，在第1 324 bp處有一個堿基變異( GluD3-16為C， GluD3-17為T)。 GluD3-16、 GluD3-17與 GluD3-11相似性分別為99.8%和99.7%，且與 GluD3-11的編碼區(qū)序列相同。從偃展4110、鄭麥004和豫麥50中各擴增出一個核苷酸序列，長度均為1 341 bp，編碼區(qū)長度均為1 056 bp。這3條序列與GenBank中注冊的KC716051.1序列的相似性分別為99.9%、99.7%和99.8%，與 GluD3-11的相似性分別為99.6%、99.6%和99.5%。分別將從偃展4110、鄭麥004和豫麥50中所得到的3條核苷酸序列命名為 GluD3-13、 GluD3-14和 GluD3-15 (GenBank登錄號分別為：KY436384、KY436385 和 KY436386)，對應肽鏈分別命名為P-13、P-14和P-15；P-13、P-14和P-15與KC716051.1編碼的氨基酸序列(KC716051.1和 GluD3-11編碼的氨基酸序列相同)相比，其相似性分別為99.4%、99.7%和99.4%。

A：引物LB1F/LB1R的擴增產(chǎn)物；B：引物LB2F/LB2R的擴增產(chǎn)物；C：引物LB4F/LB4R的擴增產(chǎn)物。M:DL2000；1：鄭麥366；2：鄭麥9023；3：師欒02-1；4：矮抗58；5：周麥18；6：石家莊8號；7：偃展4110；8：鄭麥004；9：豫麥50；10：揚麥13號。

A:PCR products amplified with the primer LB1F/LB1R; B:PCR products amplified with the primer LB2F/LB2R; C:PCR products amplified with the primer LB4F/LB4R. M:DL2000; 1:Zhengmai 366; 2:Zhengmai 9023; 3:Shiluan 02-1; 4:Aikang 58; 5:Zhoumai 18; 6:Shijiazhuang 8; 7:Yanzhan 4110; 8:Zhengmai 004; 9:Yumai 50; 10:Yangmai 13.

圖23對Glu-B3位點基因特異性引物在普通小麥中的PCR擴增產(chǎn)物

Fig.2PCRproductsofGlu-B3amplifiedwiththreegene-specificprimersfromcommonwheat

利用引物LB4F/LB4R對不同筋度的10份小麥品種進行PCR擴增，結(jié)果(圖2C)發(fā)現(xiàn)，僅在強筋小麥品種鄭麥366、鄭麥9023和師欒02-1中擴增出了PCR產(chǎn)物，其中從鄭麥366和鄭麥9023中擴增得到的是單元型 GluB3-41，從師欒02-1中得到的是單元型 GluB3-43，即引物LB4F/LB4R并未擴增到新的變異類型。

2.3Glu-A3位點和Glu-D3位點上新等位變異系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為了明確本研究新發(fā)現(xiàn)的 Glu-A3基因和 Glu-D3基因與其他已知的 Glu-A3基因和 Glu-D3基因的進化關系，采用MEGA 4.0軟件的NJ法和最大擬自然法對本研究發(fā)現(xiàn)的8個新等位變異( GluA3-25、 GluA3-26、 GluA3-37、 GluA3-38、 GluD3-24、 GluD3-13、 GluD3-14和 GluD3-15)與GenBank中搜索到的32個普通小麥 Glu-A3基因、6個小麥近緣種 Glu-A3基因、15個普通小麥 Glu-D3基因及17個小麥近緣種 Glu-D3基因的編碼區(qū)序列進行了聚類分析。結(jié)果(圖3)表明，所有序列劃分為2個一級分支、5個二級分支和10個三級分支。在二級分支下， GluA3-37和 GluA3-38聚為一類， GluA3-25、 GluA3-26、 GluD3-13、 GluD3-14和 GluD3-15聚為另一類。在三級分支下， GluD3-13、 GluD3-14和 GluD3-15聚為一類， GluA3-25和 GluA3-26聚為另一類；而 GluD3-24在二級分支下就和其余的7個新等位變異分離，與山羊草中的編碼LMW-GS的序列DQ287977相似度最高。以上結(jié)果說明， GluD3-13、 GluD3-14和 GluD3-15間及 GluA3-25和 GluA3-26間相似度較高。另外，在二級分支下， GluA3-25、 GluA3-26、 GluD3-13、 GluD3-14和 GluD3-15聚為一類，還說明 Glu-A3和 Glu-D3序列間具有較高的相似度。

3 討 論

斜體為本研究所得到的在編碼區(qū)有堿基突變的 Glu-A3和 Glu-D3新單元型。

Italic means the new Glu-A3 and Glu-D3 haplotypes with mutations in coding regions identified in this paper.

圖3來源于普通小麥及其近緣種中的78個Glu-A3和Glu-D3基因的進化樹分析

Fig.3Phylogenetictreeofseventy-eightGlu-A3andGlu-D3genesincommonwheatandrelatedspecies

LMW-GS基因核苷酸序列的長度主要是由重復區(qū)內(nèi)重復序列的多少決定的，不同等位變異之間的差別則取決于核苷酸序列間存在的SNP和InDel數(shù)目。本研究利用 Glu-A3和 Glu-B3基因的特異引物在不同筋力小麥品種中共擴增到14個新的LMW-GS基因序列，但值得注意的是，在 Glu-D3位點上新發(fā)現(xiàn)的9個等位變異是由 Glu-B3基因的特異引物擴增的，其原因可能是 Glu-B3 和 Glu-D3位點的堿基序列具有較高的相似性。韓 冉等[3]對 Glu-A3、 Glu-B3和 Glu-D3位點上的LMW-GS基因進行聚類分析，同樣發(fā)現(xiàn) Glu-B3 和 Glu-D3位點間基因編碼區(qū)序列具有較高的相似性， Glu-A3位點基因與 Glu-B3或 Glu-D3位點基因編碼區(qū)序列差異相對較大。在新擴增到的14個新的LMW-GS基因序列中，在 Glu-A3位點得到4個變異類型，分別是 GluA3-2基因的單元型 GluA3-25和 GluA3-26，以及 GluA3-3基因的單元型 GluA3-37和 GluA3-38，但這4個單元型均為假基因。在 Glu-B3位點得到了1個新的堿基變異序列，但對應氨基酸序列是曾經(jīng)報道過的肽鏈。在 Glu-D3位點，共發(fā)現(xiàn)了9個新的單元型，分別為 GluD3-18、 GluD3-44、 GluD3-25、 GluD3-16、 GluD3-17、 GluD3-13、 GluD3-14、 GluD3-15和 GluD3-24，其中， GluD3-18、 GluD3-44、 (GluD3-25、) GluD3-16和 GluD3-17在編碼區(qū)與已經(jīng)報道的相關基因核苷酸序列無差異，但在5′-UTR或3′-UTR區(qū)有1至9個堿基變異。有研究認為，UTR區(qū)的等位變異位點對基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯具有非常重要的影響，包括mRNA的半衰期、轉(zhuǎn)錄本的剪切、轉(zhuǎn)錄本的表達水平和蛋白質(zhì)的翻譯等[21-22]。而 GluD3-13、 GluD3-14、 GluD3-15和 GluD3-24單元型對應的肽鏈P-13、P-14、P-15和 P-24為本次新發(fā)現(xiàn)的肽鏈變異類型。在普通小麥中發(fā)現(xiàn)的LMW-GS基因與本人先前在小麥近緣種中發(fā)現(xiàn)的LMW-GS基因相比，普通小麥的LMW-GS基因相對穩(wěn)定，而在小麥近緣種中的LMW-GS基因多樣性更為廣泛，是小麥品質(zhì)遺傳改良不可忽視的基因資源。

根據(jù)N-末端起始氨基酸的不同，分別為甲硫氨酸、絲氨酸和異亮氨酸，又可將低分子量麥谷蛋白亞基分為LMW-m、LMW-s和LMW-i 3種類型[23-24]。據(jù)此可以確定，本研究獲得的氨基酸序列AP1和AP3的N-末端為ISQQQQ-，屬于LMW-i類型；AP2的N-末端為 MDTSYIP-和MDTSCIP-，屬于LMW-m類型；P-1和P-2的N-末端為METSRVP-和 METRCIP-，也屬于 LMW-m類型。由于在 GluA-3位點上新發(fā)現(xiàn)的4個單元型均為假基因，在理論上不能編碼蛋白，而在 GluD-3位點上新發(fā)現(xiàn)的4個單元型均含有完整的開放閱讀框，編碼的肽鏈P-13、P-14、P-15 和P-24的分子量依次約為39.83、39.81、39.81和34.91 kDa，這與王林海等的研究結(jié)果基本一致[18,25]。

根據(jù)多數(shù)人對LMW-GS基因的研究結(jié)果， GluA3-3基因的等位變異類型大多數(shù)為假基因[26]，這在本研中也得到了驗證，一共發(fā)現(xiàn)了2個 Glu-A3-3等位變異，都為假基因。由于3個 Glu-3位點的LMW-GS基因之間有著極高的相似性，特異引物的特異性受到限制。日本的Ikeda等[27]曾用1對引物擴增30多個 Glu-3基因。在本研究中，原本用于擴增 Glu-B3基因的引物，從10份小麥材料中分別擴增出 Glu-B3位點的 GluB3-418以及 Glu-D3位點的 GluD3-18、 GluD3-44、 GluD3-25、 GluD3-16、 GluD3-17、 GluD3-13、 GluD3-14、 GluD3-15和 GluD3-24基因序列。在 Glu-D3位點上擴增到9個新的等位變異，這說明 Glu-D3基因與 Glu-B3基因的核苷酸序列有著較高的相似性。其中，在偃展4110小麥品種中擴增到的 GluD3-13對應的肽鏈P-13含有7個半胱氨酸，其缺少的氨基酸位于C末端保守區(qū)上的第8個半胱氨酸的位置上。從師欒02-1小麥品種中擴增到一個含有9個半胱氨酸殘基的單元型，是首次在小麥品種中發(fā)現(xiàn)，但與本人曾在栽培二粒小麥中得到的 GluA3-18單元型相同，進一步說明一粒小麥就是普通小麥的祖先[28]。

大多數(shù)LMW-GS均含有8個半胱氨酸殘基，在第1和第7位上的半胱氨酸殘基形成分子間二硫鍵，其余6個形成分子內(nèi)二硫鍵[29]。AP1-8是在第6位和第7位半胱氨酸殘基之間多出一個半胱氨酸殘基。Zhao等[19]曾在小偃6號小麥品種的1D染色體上首次發(fā)現(xiàn)含有9個半胱氨酸殘基的LMW-GS，其多出的半胱氨酸殘基在第3和第4位半胱氨酸殘基之間；Si等[5]在1B染色體上也發(fā)現(xiàn)了含有9個半胱氨酸殘基的LMW-GS，其多出的半胱氨酸殘基在第7和第8位半胱氨酸殘基之間。根據(jù)Zhao等[30]和Xu等[31]的報道，與含有8個半胱氨酸殘基LMW-GS材料的面粉相比，含有9個半胱氨酸殘基的LMW-GS更有助于形成分子間二硫鍵，進而提高了和面時間，顯著增強了面團強度，增多了蛋白聚合體，減弱了抗延阻力。此外，一些含有7個半胱氨酸的LMW-GS相繼被發(fā)現(xiàn)，例如Lan等[32]曾在小麥品種Jiachazharen、Jiachaaigan和Maoyintumai中分別發(fā)現(xiàn)了含有7個半胱氨酸的LMW-GS，韓 冉等[3]在從小麥品種Cook中也發(fā)現(xiàn)了含有7個半胱氨酸的LMW-GS。經(jīng)對本研究獲得的含有7個半胱氨酸殘基的LMW-GS進行二級結(jié)構(gòu)預測，發(fā)現(xiàn) P-13蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋和β-折疊所占的比例之和為24.86%，這明顯高于 GluD3-1基因的其他等位變異(24.00%～24.57%)，這種二級結(jié)構(gòu)的變化可能與缺少一個半胱氨酸殘基有關，半胱氨酸殘基數(shù)量的變化會影響LMW-GS分子間二硫鍵的形成，從而影響到其三級結(jié)構(gòu)的構(gòu)型，進而會影響到蛋白的功能及面粉品質(zhì)。據(jù)此推測， GluA3-18和 GluD3-13可能是小麥改良的優(yōu)質(zhì)基因資源。另外值得注意的是，本研究用了6對特異引物對不同筋力的10份小麥材料進行LMW-GS基因擴增，其中1對引物LB4F/LB4R只在三個強筋型小麥品種中擴增出了條帶，其他7個品種沒能擴增出PCR產(chǎn)物，說明LB4F/LB4R有可能對強筋小麥的LMW-GS基因具有特異性，這有待進一步研究。

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IsolationandSequenceAnalysisofLMW-GSGeneattheGlu-3LociinCommonWheat

DONGXue1,WANGZeng1,LIUMeng1,YANGYan1,HANBing1,LIShufen1,ZHAOXianlin2

(1.The Functional Laboratory of Plant Biotechnology,College of Life Sciences,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot,Inner Mongolia 010018,China； 2.Wheat Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Key Laboratory of Wheat Biology/National Engineering Laboratory for Wheat/Key Laboratory of Wheat Biology and Genetic Breeding in Central Huang-Huai Region,Ministry of Agriculture,Zhengzhou,Henan 450002,China)

Low-molecular-weight glutenin subunits(LMW-GS) are major fractions of wheat gluten,and have great effects on dough extensibility and food processing quality. In this study,the specific primers of Glu-A3 and Glu-B3 genes were used to identify and amplify the allelic variations of LMW-GS genes from ten wheat varieties with different gluten content. A total of 14 new DNA haplotypes were identified,including four haplotypes at Glu-A3,one haplotype at Glu-B3 and nine haplotypes at (Glu-D3.) Among them,the corresponding peptide of GluA3-18 from wheat variety Shiluan 02-1 contains nine cysteine residues,and the corresponding peptide of GluD3-13 from Yanzhan 4110 has seven cysteine residues,both of which belong to the specific subunits compared with others with eight cysteine residues. The results provide the basis for further study of LMW-GS genes and quality improvement of wheat.

Common wheat; LMW-GS; Gene isolation; Glu-3 loci

時間：2017-10-11

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171011.1601.002.html

2017-02-13

2017-07-25

國家自然科學基金項目(31271726)；內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學優(yōu)秀青年科學基金項目(2014XYQ-18)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學基金項目(2014MS0338)；內(nèi)蒙古自治區(qū)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)人才團隊項目(201503004)

E-mail：dongxue225@126.com

趙獻林(E-mail:xlin918@126.com)；楊 燕(E-mail:yangyanchutao@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)10-1276-09

網(wǎng)絡出版時間：2017-10-11

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171011.1601.004.html