DNA損傷修復(fù)在耐輻射奇球菌中的研究進(jìn)展

韓萬春

【摘 要】耐輻射奇球菌是目前世界上最耐輻射的細(xì)菌。國內(nèi)外對其已經(jīng)有了多年研究。大量的研究結(jié)果表明不同的DNA損傷在耐輻射奇球菌體內(nèi)存在著不同的損傷修復(fù)途徑。本文主要概述不同的損傷類型在耐輻射奇球菌體內(nèi)所存在的修復(fù)途徑。旨在深入了解耐輻射奇球菌的輻射抗性機(jī)制，為生物體的輻射防護(hù)提供更好的思路。

【關(guān)鍵詞】耐輻射奇球菌；DNA損傷；DNA修復(fù)；輻射防護(hù)

中圖分類號： Q937 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 2095-2457（2017）17-0059-003

Research Progress on DNA Damage and Repair Mechanisms of Deinococcus radiodurans

HAN Wan-chun

（CNNC Nuclear Power Operations Management Co.，Ltd.，Haiyan Zhejiang 314300，China）

【Abstract】So far，Deinococcus radiodurans is the most radiation resistant bacteria in the world.For researchers， Deinococcus radiodurans as a research object for many years at home and abroad.The research results show that different DNA damages own different repair pathways in it.This article provided an overview of different types of damages own different repair pathways in Deinococcus radiodurans.The aim is to deeply realize the radiation resistance mechanism of Deinococcus raidodurans.Provide better ideas for the radiation protection of organism.

【Key words】Deinococcus radiodurans；DNA damage；DNA repair；Radiation protection

耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans， DR）是一種紅色的非致病細(xì)菌[1]。因其對極端環(huán)境具有很強(qiáng)的抗性而受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注。研究人員將其歸類到與其親緣性最高的Deinococcus科和奇球菌屬中。研究人員對耐輻射奇球菌進(jìn)行了大量的研究，通過研究發(fā)現(xiàn)其對于由氧化劑、烷化劑，紫外輻射，電離輻射、化學(xué)誘變劑等造成的DNA損傷有強(qiáng)大的修復(fù)功能[2]。研究這些損傷類型所涉及的損傷機(jī)制對于了解耐輻射奇球菌強(qiáng)大DNA損傷修復(fù)能力具有重要的意義，也為輻射防護(hù)提供更好的思路。

1 耐輻射奇球菌

耐輻射奇球菌最早是在1956年由美國科學(xué)家Anderson在經(jīng)過高劑量電離輻射滅菌的肉罐頭中被發(fā)現(xiàn)。之后在動物體內(nèi)、土壤、沙漠、溫泉、長壽人群的體內(nèi)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了30種左右該屬的其他成員。耐輻射奇球菌早期屬于Micrococcus屬，將其命名為Micrococcus radiodurans，后又因同源性差異將其改為Deinococcus raidodurans。

耐輻射奇球菌的最佳生長溫度為30℃。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)陀?℃或者高于42℃時耐輻射奇球菌則會停止生長。在正常條件下，處于指數(shù)生長期的耐輻射奇球菌以二聯(lián)體的形式存在，穩(wěn)定生長期的耐輻射奇球菌主要以四疊體方式存在。由于其細(xì)胞壁上的肽聚糖層較厚，染色后難以脫色，所以革蘭氏反應(yīng)呈陽性。然而其復(fù)雜的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陰性菌相似。美國科學(xué)家于1999年對耐輻射奇球菌R1進(jìn)行了全基因組測序[3]，測序結(jié)果顯示其基因組大小為3.28 Mb， 鳥嘌呤和胞嘧啶平均含量達(dá)66.6%。其基因組由染色體Ⅰ，染色體Ⅱ，大質(zhì)粒以及小質(zhì)粒構(gòu)成。對整個基因組預(yù)測約含有3187個閱讀框（open reading frames，ORFs），基因平均為936 bp。其中2185 ORFs可以找到匹配的同源物，包括通過生物信息學(xué)預(yù)測出1674個有特定功能的基因和511個未知功能蛋白基因。其余1002個基因功能未知[4]。耐輻射奇球菌在穩(wěn)定期時較穩(wěn)定，每個細(xì)胞含有4個基因組拷貝，而對數(shù)生長期的細(xì)胞生長旺盛，每個細(xì)胞含有8-10個基因組拷貝。在急性照射15 kGy條件下耐輻射奇球菌可以生存，在劑量率60 Gy/h條件下可以正常生長，顯示電離輻射抗性頑強(qiáng)。除了電離輻射抗性之外，其在1000 J/m2高紫外輻照條件下任然可以存活，顯示出超強(qiáng)的紫外輻射抗性。同時，耐輻射奇球菌對化學(xué)誘變劑絲裂霉素C也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。耐輻射奇球菌可以在干燥器內(nèi)存活六年且保持10%存活率。由于其具有超強(qiáng)的電離輻射抗性，紫外抗性，化學(xué)誘變劑抗性及干燥抗性，耐輻射奇球菌被作為模式生物用于抗性機(jī)制研究。相應(yīng)的研究結(jié)果也被逐漸用于輻射環(huán)境污染修復(fù)、農(nóng)業(yè)和軍事輻射防護(hù)等相關(guān)領(lǐng)域[5][6]。

2 耐輻射奇球菌的抗輻射機(jī)制的原因

2.1 基因組冗余

耐輻射奇球菌在穩(wěn)定期每個細(xì)胞有4個基因組拷貝，而處于迅速分裂的對數(shù)生長期時每個細(xì)胞約有8-10個基因組拷貝[7]。研究報道，基因拷貝數(shù)目越多細(xì)菌對電離輻射產(chǎn)生損傷的抗性越強(qiáng)[8-9]。多重基因組拷貝可以幫助在同源重組修復(fù)過程中提供足夠的模板。但是，目前為止還沒有直接實驗證據(jù)可以證明耐輻射奇球菌基因組的多重拷貝與其輻射抗性有相關(guān)性。endprint

2.2 染色體的類核結(jié)構(gòu)

處于穩(wěn)定期的耐輻射奇球菌的染色體是以高度緊密的環(huán)狀結(jié)構(gòu)形式存在，即使在高劑量的急性照射條件下染色體也不發(fā)生改變。Levin-Zaidman等人于2003年通過透射電子顯微鏡觀察到耐輻射奇球菌的染色體存在著緊實的環(huán)狀類核結(jié)構(gòu)，并認(rèn)為這種類核結(jié)構(gòu)與耐輻射奇球菌的輻射抗性相關(guān)[10]。類核結(jié)構(gòu)像網(wǎng)一樣可以阻止損傷DNA片段發(fā)生游離，使得DNA修復(fù)更加快速高效。

2.3 細(xì)胞內(nèi)的錳鐵比

Daly在science期刊上發(fā)表了錳離子對耐輻射奇球菌的輻射抗性有貢獻(xiàn)，研究結(jié)果表明耐輻射奇球菌細(xì)胞內(nèi)聚集著高濃度錳離子能夠提高細(xì)菌的輻射抗性[11]。Daly在PLOS Biology期刊上發(fā)表了二價錳離子能夠保護(hù)蛋白免受損傷，活性完好的修復(fù)蛋白能夠高效快速的修復(fù)DNA損傷位點[12]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)二價錳離子可以與超氧陰離子自由基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。Daly于在Clin. Lab. Med期刊上發(fā)表了多種生物體內(nèi)錳鐵比與輻射抗性的關(guān)系，錳鐵離子比與輻射抗性線性相關(guān)[13]。

2.4 類胡蘿卜素

在耐輻射奇球菌體內(nèi)可以大量合成類胡蘿卜素。類胡蘿卜素能有效的抑制活性氧自由基的產(chǎn)生，起到保護(hù)DNA，蛋白及膜蛋白脂類免受氧化損傷的作用[14]。人為將合成類胡蘿卜素系統(tǒng)破壞后，在50 mM H2O2壓力下其存活率下降了約100倍，說明類胡蘿卜素在耐輻射奇球菌的抗性機(jī)制中扮演著重要的角色。本實驗室研究人員研究發(fā)現(xiàn)耐輻射奇球菌的色素合成基因可以轉(zhuǎn)化到乳酸菌中并且成功的合成了紅色的色素。這一發(fā)現(xiàn)為色素保健乳酸飲品的開發(fā)提供了可能，也為廣大輻射防護(hù)工作者提供了福音。

2.5 胞內(nèi)高活性抗氧化酶類

抗氧化酶類物質(zhì)能夠高效的清除生物體內(nèi)活性氧自由基物質(zhì)[15-16]。耐輻射奇球菌編碼三個過氧化氫酶蛋白，四個超氧化物歧化酶蛋白。此外還編碼一些抗氧化酶類，包括谷氧還蛋白，硫氧還蛋白還原酶，烷基氫過氧化物還原酶等，這些抗氧化酶類保護(hù)細(xì)胞免受由于氧化作用對機(jī)體造成的損傷。

3 耐輻射奇球菌的體內(nèi)存在的DNA修復(fù)途徑

細(xì)菌在不同的DNA損傷誘因下，產(chǎn)生不同的損傷類型，包括8-氧鳥嘌呤單鏈斷裂，堿基錯配、缺失，嘧啶二聚體，單、雙鏈斷裂等。對于不同的損傷類型需要不同的損傷修復(fù)途徑來完成修復(fù)。修復(fù)途徑主要包括堿基切除修復(fù)，堿基錯配修復(fù)，核苷酸切除修復(fù)，非同源末端連接修復(fù)等[17]。

3.1 堿基切除修復(fù)

堿基切除修復(fù)（Base excision repair，BER）可完成由氧化劑、烷化劑等所造成的外源性和內(nèi)源性DNA損傷修復(fù)。其損傷修復(fù)途徑為，首先在DNA糖苷水解酶作用下識別并切割損傷位點，露出AP位點；接著AP核酸內(nèi)切酶識別AP位點并切開，由DNA磷酸二酯酶切割脫氧核糖-5-磷酸形成缺口，在聚合酶Ⅰ作用下插入相應(yīng)堿基，在連接酶的作用下完成修復(fù)。在耐輻射奇球菌堿基切除修復(fù)過程中，兩個烷基化糖基化酶（DR2074和DR2584）參與堿基位點的識別，由剩余的9個DNA糖基化酶參與損傷堿基的切除。核酸內(nèi)切酶Ⅴ主要移除黃嘌呤和次黃嘌呤[18][19]。此外，耐輻射奇球菌的三個基因（DR0928，DR2438，DR0289）編碼三個核酸內(nèi)切酶Ⅲ移除胸腺嘧啶二聚體。

3.2 核苷酸切除修復(fù)

核苷酸切除修復(fù)途徑（Nucleotide excision repair， NER）在真核和原核生物中廣泛存在。在耐輻射奇球菌中，核苷酸切除修復(fù)主要以UvrABC和UvrDE兩種途徑修復(fù)形式存在[20]。聚合酶polA參加了這兩種修復(fù)途徑。UvrABC修復(fù)途徑主要參與切除修復(fù)嘧啶二聚體，其中UvrA和UvrB參與結(jié)合識別嘧啶二聚體， UvrB和UvrC形成的復(fù)合體將損傷位點切除，接著在DNA聚合酶和連接酶的作用下完成修復(fù)。UvrDE途徑是在缺少UvrA的條件下發(fā)現(xiàn)的另一種核苷酸切除修復(fù)途徑。主要用于修復(fù)紫外照射產(chǎn)生的嘧啶二聚體和環(huán)丁烷嘧啶二聚體[21-22]。研究結(jié)果顯示在耐輻射奇球菌中UvrABC修復(fù)途徑比UvrDE修復(fù)途徑的貢獻(xiàn)要大。

3.4 非同源末端連接修復(fù)

非同源末端連接修復(fù)途徑（Non-homologous end joining，NHEJ）在耐輻射奇球菌中還沒有被明確證明存在。但是，最新研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PprA蛋白可能參與NHEJ修復(fù)途徑，因為PprA蛋白可以特異性的結(jié)合損傷的雙鏈DNA，并在DNA連接酶作用下促使DNA末端連接反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)若將耐輻射奇球菌的PprA基因敲除，其電離輻射抗性大大降低[23-25]。

3.5 單鏈退火延伸

單鏈退火延伸途徑（Single strand annealing，SSA）最早由Daly等研究人員在缺失recA基因的耐輻射奇球菌輻照后的修復(fù)過程中發(fā)現(xiàn)。其工作的基本原理是以多拷貝基因組為模板進(jìn)行同源單鏈間的退火配對， DNA聚合酶行使復(fù)制與延伸功能，最后DNA連接酶完成修復(fù)[26-27]。此途徑不依賴于recA蛋白，細(xì)菌在受到1 kGy的電離輻照后將會產(chǎn)生此修復(fù)響應(yīng)。

3.6 同源重組修復(fù)

同源重組修復(fù)（Homologous recombination，HR）是原核生物體內(nèi)修復(fù)斷裂DNA的最主要途徑。其工作的基本原理是在核酸酶作用下使斷裂的DNA露出3末端，以同源的DNA為模板，進(jìn)行跨損傷缺口修復(fù)。在此修復(fù)過程中得到包括RecA，RecD，RecF，RecJ，RecG，RecN，RecO，RecR等蛋白的響應(yīng) [28]。在細(xì)菌中，依賴RecA的同源重組進(jìn)行修復(fù)的主要途徑包括：RecBCD途徑和RecFOR途徑。

在RecBCD途徑中，由于耐輻射奇球菌中沒有發(fā)現(xiàn)RecB和RecC的同源蛋白，表明耐輻射奇球菌沒有一整套RecBCD修復(fù)途徑[29]。然而研究人員發(fā)現(xiàn)將recD基因敲除后，耐輻射奇球菌對過氧化氫的敏感性增加[30-31]。endprint

在RecFOR途徑中，RecA主要參與單鏈缺口的修復(fù)。在耐輻射奇球菌DNA雙鏈斷裂損傷的重組修復(fù)過程中RecA蛋白是不可或缺的。耐輻射奇球菌體內(nèi)存在著完整的RecFOR修復(fù)途徑，主要是由解旋酶RecQ和核酸酶RecJ處理出3單鏈，單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到單鏈上保護(hù)單鏈不被降解[32-33]。接著RecFOR復(fù)合體結(jié)合到單鏈上招募RecA進(jìn)行鏈交換[34]。最后在DNA聚合酶和連接酶共同作用下完成修復(fù)。

4 總結(jié)與展望

耐輻射奇球菌是目前為止發(fā)現(xiàn)的最耐輻射的細(xì)菌。其抗輻射機(jī)制與基因組冗余，染色體的類核結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)的錳鐵比，類胡蘿卜素，胞內(nèi)高活性抗氧化酶類等相關(guān)。耐輻射奇球菌對于不同損傷也產(chǎn)生了相應(yīng)的損傷修復(fù)途徑，其中包括堿基切除修復(fù)，核苷酸切除修復(fù)，非同源末端連接修復(fù)，單鏈退火延伸，同源重組修復(fù)等修復(fù)途徑。

令輻射防護(hù)人員感興趣的是，目前研究發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素對白內(nèi)障，心血管疾病，特定的腫瘤，機(jī)體衰老有一定的保健作用，特別是其可以提高人體的免疫功能。若能開發(fā)成相應(yīng)的保健食品，將會有巨大的應(yīng)用價值。

耐輻射奇球菌修復(fù)過程中涉及多種DNA損傷修復(fù)途徑，不同的修復(fù)途徑有大量的相應(yīng)蛋白參與，解釋了其對電離輻射，紫外輻射，干燥以及化學(xué)誘變劑引起的突變和致死效應(yīng)具有超強(qiáng)抗性的原因。對耐輻射奇球菌的深入研究，促進(jìn)人們對其應(yīng)用價值的開發(fā)，也為生物體輻射防護(hù)工作提供更好的思路。

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