Notch信號通路在胰島素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細胞生長及凋亡中的作用

楊 琳，邵 茵，王莉菲

(廣東省深圳市人民醫(yī)院婦科 518000)

Notch信號通路在胰島素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細胞生長及凋亡中的作用

楊 琳，邵 茵△，王莉菲

(廣東省深圳市人民醫(yī)院婦科 518000)

子宮內(nèi)膜腫瘤；胰島素；γ分泌酶抑制劑MW167；Notch信號；細胞增殖

子宮內(nèi)膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，占女性惡性腫瘤的25%～30%，近年來其發(fā)病率呈逐漸上升且具有年輕化趨勢[1]。胰島素作為細胞生長因子可參與細胞生長、增殖及分化過程[2]。越來越多的證據(jù)表明，胰島素抵抗及高胰島素血癥在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病及病情進展中起重要作用[3-4]，但其內(nèi)在機制尚不明確。近年來研究顯示，相關(guān)細胞內(nèi)信號通路激活可促進子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展[5]。Notch信號通路是細胞間相互接觸的信號通路之一，可調(diào)控多種細胞分化、增殖及凋亡，且與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，并可促進子宮內(nèi)膜癌細胞的生長與增殖。因此，本研究從細胞與細胞間聯(lián)系的信號傳導通路及調(diào)節(jié)機制方面，探討γ分泌酶抑制劑MW167抑制Notch信號傳導后對胰島素誘導子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及相關(guān)凋亡蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞(上海一研生物科技有限公司)。

表1 MW167抑制劑拮抗胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞中Notch1蛋白表達

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與胰島素組比較；△：P<0.05，與MW167組(5 μmol/L)比較；▽：P<0.05，與MW167組(10 μmol/L)比較

1.1.2實驗試劑 γ分泌酶抑制劑MW167(美國MCE公司)；Notch蛋白試劑盒(上海滬震實業(yè)有限公司)；磷酸鹽緩沖液(上海依赫生物科技有限公司)；細胞凋亡試劑盒(上海拓然生物科技有限公司)；噻唑藍(MTT,上海遠慕生物科技有限公司)；新生牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司)；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗人半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3克隆抗體、兔抗人Caspase-8克隆抗體(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司)。

1.1.3實驗儀器 光學顯微鏡(型號：DMLP-MP30，日本Ricoh公司)；20、200、1 000 μL微量移液器(芬蘭DragonMed公司)；臺式微量離心機(型號：H1650-W，美國Sigma公司)；高速冷凍離心機(型號：A1330103，美國Beckman公司)；臺式低溫高速離心機(型號：TD-35M/TD35；德國Hettich公司)；CO2培養(yǎng)箱(型號：MCO-20AIC，德國Heraeus公司)；電子天平(BP211D型，德國Sartorius公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(型號：DG-3022型，國營華東電子管廠)；流式細胞儀(型號：1401-X-20R，美國Beckman-Coulter公司)。

1.2方法

1.2.1子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞的培養(yǎng) 在無菌操作條件下取子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞，置于含10%胎牛血清(100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)RPMI-1640培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)，傳代時依次加入0.01% Ⅱ型膠原酶、0.08%胰蛋白酶消化10 min，收集懸浮液離心過濾后留取沉淀物，繼續(xù)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，2～4 d傳代1次，收集對數(shù)生長期細胞，每種實驗重復3次。

1.2.2MTT比色法測定子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞 取對數(shù)期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞，以1×104個/孔的密度接種在96孔板中，每孔加入100 μL新生胎牛血清，將培養(yǎng)好的細胞分為：對照組(加入磷酸緩沖液3 mL)、胰島素組(加入1×106mol/L胰島素單獨刺激)及MW167組(分別應用5、10、20 μmol/L γ分泌酶抑制劑MW167預處理后再用胰島素刺激)，每組設(shè)3個復孔，各組在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24、48、72 h后加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)恒溫孵育4 h，將培養(yǎng)液去掉，依次加入經(jīng)生物素標記山羊抗小鼠免疫球蛋白及辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素工作液于室溫孵育。應用酶標儀測量樣品在570 nm處的吸光度(A570)值，并計算生長抑制率。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定子宮內(nèi)膜癌相關(guān)凋亡蛋白及Notch1蛋白 取對數(shù)生長期子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞，以2×105個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁生長后，將細胞分為對照組(加入磷酸緩沖液3 mL)、胰島素組(加入1×106mol/L胰島素單獨刺激)及MW167組(分別應用5、10、20 μmol/L γ分泌酶抑制劑MW167預處理后再用胰島素刺激)，每組培養(yǎng)48 h后收集貼壁生長細胞，提取細胞蛋白，將蛋白凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，于室溫下采用含5%脫脂奶粉Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉1 h，并加入鼠抗人Caspase-3及鼠抗人Caspase-8，于4 ℃下孵育過夜，TBST洗滌樣品，加入經(jīng)辣根過氧化酶標記的二抗，在常溫下孵育1 h后采用TBST洗滌3次，采用化學發(fā)光法測定硝酸纖維素膜上Caspase-3、Caspase-8及Notch1蛋白水平。

2 結(jié) 果

2.1MW167抑制劑拮抗胰島素促Ishikawa 3-H-12細胞中Notch1蛋白表達 胰島素可促進Ishikawa 3-H-12細胞中Notch1蛋白表達，刺激48 h后Notch1蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，MW167可抑制胰島素誘導Notch1蛋白表達，且抑制作用具有時間及濃度依賴性，見表1、圖1。

1：對照組；2：胰島素組；3：MW167組(5 μmol/L)；4：MW167組(10 μmol/L)；5：MW167組(20 μmol/L)

圖1 MW167抑制劑拮抗胰島素對Ishikawa 3-H-12細胞中Notch1蛋白表達

圖2 MW167抑制劑拮抗胰島素調(diào)節(jié)Ishikawa 3-H-12細胞增殖作用

表2 MW167抑制劑拮抗胰島素調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細胞增殖作用

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與胰島素組比較；△：P<0.05，與MW167組(5 μmol/L)比較；▽：P<0.05，與MW167組(10 μmol/L)比較

表3 抑制Notch信號傳導對胰島素誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡蛋白表達的影響

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與胰島素組比較；△：P<0.05，與MW167組(5 μmol/L)比較；▽：P<0.05，與MW167組(10 μmol/L)比較

2.2MW167抑制劑拮抗胰島素調(diào)節(jié)Ishikawa 3-H-12細胞增殖作用 MTT比色法測定結(jié)果顯示，不同組別Ishikawa 3-H-12細胞在培養(yǎng)24、48、72 h后A570值存在明顯差異(P<0.05)，其中胰島素組各時間點A570值均高于對照組同一時間點(P<0.05)，胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖在48 h時達到最高水平。MW167以濃度及時間依賴的方式抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，在48 h時以20 μmol/L MW167可持久抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，見表2、圖2。

2.3抑制Notch信號傳導對胰島素誘導Ishikawa 3-H-12細胞凋亡蛋白表達的影響 Western blot檢測結(jié)果顯示，胰島素組各時間點Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平低于對照組同一時間點(P<0.05)，其中以48 h刺激作用最為明顯，在培養(yǎng)48 h后胰島素組Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平降至最低，直至培養(yǎng)72 h后仍維持較低的表達水平，MW167以濃度及時間依賴的方式促進Ishikawa 3-H-12細胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達，見表3、圖3。

1：對照組；2：胰島素組；3：MW167組(5 μmol/L)；4：MW167組(10 μmol/L)；5：MW167組(20 μmol/L)

圖3抑制Notch信號傳導對胰島素誘導Ishikawa 3-H-12細胞凋亡蛋白表達的影響

3 討 論

胰島素不僅可調(diào)節(jié)糖脂代謝，還可作為細胞生長因子調(diào)控細胞增殖及抑制細胞凋亡。胰島素可與胰島素受體(INSR)結(jié)合并活化其生物學效應，從而刺激細胞增殖、生長及抑制凋亡，誘發(fā)多種腫瘤發(fā)生[6]。動物實驗發(fā)現(xiàn)，對結(jié)腸癌小鼠注射胰島素后腫瘤生長速度明顯加快[7]。孫恒子等[8]研究發(fā)現(xiàn)，血清胰島素水平與乳腺癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，高胰島素血癥是乳腺癌預后的獨立危險因素，通過降低血清胰島素水平可有效延長乳腺癌患者的生存時間，降低乳腺癌復發(fā)率。另有研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌細胞中大量存在INSR，且INSR水平與子宮內(nèi)膜癌的復發(fā)、遠期轉(zhuǎn)移及生存率有密切的關(guān)系[9]。

目前關(guān)于胰島素在子宮內(nèi)膜癌中的作用機制尚不明確。但是相關(guān)研究認為，胰島素可經(jīng)相關(guān)信號傳導通路發(fā)揮生物學效應，其中Notch信號通路可調(diào)控細胞增殖及抑制細胞凋亡，該信號通路異常激活可刺激腫瘤血管形成及促進細胞惡性增殖，并與腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移及浸潤有密切的關(guān)系[10]。目前多項研究均表明，Notch可通過調(diào)控細胞增殖及抑制細胞凋亡而促進惡性腫瘤的生成及進展[11-12]。Mi等[13]研究指出，應用γ分泌酶抑制劑MW167能有效抑制Notch信號通路傳導，進而可阻斷Notch誘導的低氧條件下癌細胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞基礎(chǔ)狀態(tài)下Notch信號通路已被激活，表現(xiàn)為Notch1蛋白表達水平升高。在胰島素刺激下，Notch1蛋白表達水平進一步升高，而隨著γ分泌酶抑制劑MW167作用時間及濃度增加，Ishikawa 3-H-12細胞中Notch1蛋白表達水平下降。MTT比色法測定結(jié)果顯示，不同組別Ishikawa 3-H-12細胞在培養(yǎng)24、48、72 h 后A570值存在明顯差異(P<0.05)，其中胰島素組各時間點A570值均高于對照組同一時間點，胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖在48 h時達到最高水平。MW167以濃度及時間依賴的方式抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，在48 h時20 μmol/L MW167可持久抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。由此可推測促子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖及生長與胰島素刺激下Notch信號通路進一步激活有關(guān)。Sparling等[14]研究證實，在胰島素培養(yǎng)子宮內(nèi)膜癌細胞株中存在Notch過表達的現(xiàn)象，Notch過表達可誘導細胞周期阻滯并促進細胞增殖及生長，支持了本研究結(jié)果。

細胞凋亡是生物體內(nèi)普遍存在的現(xiàn)象，具有重要的生物學意義。Caspase-3、Caspase-8是細胞凋亡的重要執(zhí)行者及主要效應因子，在凋亡執(zhí)行階段主要負責對部分或全部關(guān)鍵性蛋白進行酶切，使之滅活?；罨腃aspase-3、Caspase-8可特異性切割DNA，并參與DNA損傷修復及DNA滅活過程，從而激活核酸及促使染色體凝固，進而誘導細胞凋亡[15]。本研究經(jīng)Western blot檢測顯示，胰島素組各時間點Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平低于對照組同一時間點，其中以48 h刺激作用最為顯著，在培養(yǎng)48 h后胰島素組Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平最低，直至培養(yǎng)72 h仍維持較低的表達水平，MW167以濃度及時間依賴的方式促進Ishikawa 3-H-12細胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達，表明胰島素可抑制Ishikawa 3-H-12細胞凋亡，其可能的作用機制為胰島素可激活Notch信號通路，抑制相關(guān)凋亡蛋白表達，從而抑制細胞凋亡，而MW167可抑制胰島素誘導的Notch信號傳導，進而促進凋亡蛋白表達，誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡。

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TheroleofNotchsignalingpathwayininsulinregulationofendometrialcancercellgrowthandapoptosis

YangLin，ShaoYin△，WangLifei

(DepartmentofGynaecology,thePeople′sHospitalofShenzhenCity,Shenzhen,Guangdong518000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Notch signaling pathway on proliferation of insulin-induced endometrial carcinoma cells and apoptosis related protein expression levels.MethodsThe endometrial carcinoma Ishikawa 3-H-12 cell line was primarily cultured and subcultured in vitro.Then,the cultured cells were divided into five groups:the control group (3 mL PBS was added into the group),the insulin group (cells were stimulated by 1×106mol/L insulin) and MW167 groups (different doses of γ-secretase inhibitor MW167 pretreated with insulin stimulation).After 48 h culturation,inhibition of endometrial carcinoma cell growth of each group was measured by MTT-colorimetric method,the apoptosis-related proteins (Caspase-3,Caspase-8) and Notch1 protein expression levels of each group were determined by Western blot.ResultsInsulin can promote Notch1 protein expression in endometrial carcinoma cells,after 48 h insulin stimulation,the Notch1 protein expression level was significantly higher than that in the control group (P<0.05).MW167 can inhibit insulin-induced Notch1 protein expression in a concentration-dependent inhibition manner.The absorbance at 570 nm (A570) of endometrial carcinoma cells cultured for 24,48 and 72 h in different groups were significantly different (P<0.05).TheA570values in the insulin group at each time point were higher than those in the control group (P<0.05),and the insulin-induced endometrial carcinoma cell proliferation reached its highest level at 48 h.MW167 inhibited insulin-induced endometrial carcinoma cells proliferation in a concentration- and time-dependent manner,and 20 μmol/L MW167 persistently inhibited insulin-induced proliferation of endometrial carcinoma cells at 48 h.Western blot analysis showed that expression levels of Caspase-3 and Caspase-8 protein in the insulin group at each time point were lower than those in the control group (P<0.05),and MW167 promoted the expressions of Caspase-3 and Caspase-8 in a concentration-and time-dependent manner.ConclusionMW167 can suppress the insulin-induced endometrial carcinoma cells proliferation and promote the expression of related apoptotic proteins by inhibiting Notch signaling pathway,and induce apoptosis of endometrial carcinoma cells.

endometrial neoplasms；insulin；γ-secretase inhibitor MW167；Notch signaling；cell proliferation

楊琳(1975-)，副主任醫(yī)師，本科，主要從事婦科腫瘤研究?！?/p>

，E-mail:doctorsy0755@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.29.005

目的探討抑制Notch信號傳導對胰島素誘導子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及相關(guān)凋亡蛋白表達水平的影響。方法將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa 3-H-12細胞行體外原代及傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的細胞分為：對照組(加入磷酸鹽緩沖液3 mL)、胰島素組(加入1×106mol/L胰島素單獨刺激)及MW167組(應用不同劑量γ分泌酶抑制劑MW167預處理后再用胰島素刺激)，培養(yǎng)48 h后應用噻唑藍(MTT)比色法測定各組子宮內(nèi)膜癌細胞生長抑制情況，應用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-8及Notch1蛋白表達情況。結(jié)果胰島素可促進子宮內(nèi)膜癌細胞中Notch1蛋白表達，刺激48 h后Notch1蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，MW167可抑制胰島素誘導Notch1蛋白表達，且抑制作用具有濃度依賴性。不同組別子宮內(nèi)膜癌細胞在培養(yǎng)24、48、72 h后570 nm處吸光度(A570)值存在明顯差異(P<0.05)，其中胰島素組各時間點A570值均高于對照組(P<0.05)，胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖在48 h時達到最高水平。MW167以濃度及時間依賴的方式抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖，在48 h時20 μmol/L MW167可持久抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖。胰島素組各時間點Caspase-3、Caspase-8蛋白表達水平低于對照組(P<0.05)，MW167以濃度及時間依賴的方式促進細胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表達。結(jié)論MW167可通過抑制Notch信號通路傳導而抑制胰島素促子宮內(nèi)膜癌細胞增殖及促進相關(guān)凋亡蛋白表達，誘導子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡。

R737.33

A

1671-8348(2017)29-4047-04

2017-03-20

2017-06-18)