原油污染土壤中蒿屬植物與叢枝菌根真菌共生性研究*

山寶琴 張永濤 李 茜 白雪梅

(延安大學石油工程與環(huán)境工程學院，陜西 延安 716000)

原油污染土壤中蒿屬植物與叢枝菌根真菌共生性研究*

山寶琴 張永濤 李 茜 白雪梅

(延安大學石油工程與環(huán)境工程學院，陜西 延安 716000)

通過盆栽試驗研究原油污染條件下艾蒿(Artemisiaargyi)、黃花蒿(Artemisiaannua)、豬毛蒿(Artemisiascoparia)和白葉蒿(Artemisialeucophylla)4種蒿屬植物根系叢枝菌根(AM)真菌侵染率及形態(tài)特點。每種植物各設0、5、10、20、40g/kg5種原油污染質(zhì)量濃度，分離鑒定植物根圍AM真菌，測定孢子密度、菌絲侵染率、叢枝侵染率以及植物株高和干質(zhì)量。結(jié)果表明，原油污染條件下蒿屬植物根圍共分離鑒定出2屬10種AM真菌，7種屬于球囊霉屬 (Glomus)， 3種屬于無梗囊霉屬(Acaulospora)，其中地球囊霉(Glomusgeospora)為優(yōu)勢種，4種植物中艾蒿根圍AM真菌多樣性最豐富。形態(tài)觀察結(jié)果表明，4種蒿屬植物的根系都具有疆南星型菌根結(jié)構(gòu)。AM真菌孢子密度、菌絲侵染率和叢枝侵染率都與原油濃度呈顯著正相關(guān)；植物株高和干質(zhì)量隨原油濃度增加而下降。

原油污染土壤 叢枝菌根真菌 蒿屬植物 共生

陜北地區(qū)油氣資源豐富，長期開采及貯運加工造成油田土壤污染嚴重[1]，原油滲透污染易造成土壤黏結(jié)，透水性降低，進入土壤的各類多環(huán)芳烴具有超強生物毒性，難去除、難降解，且濃度越大遷移深度越大[2]，給當?shù)厣鷳B(tài)帶來危害。自然條件下，土壤中原油類污染物的降解是地被植物與其根際微生物共生互作的過程[3]。叢枝菌根(AM)真菌廣泛分布于陸地生態(tài)系統(tǒng)中，AM真菌菌絲與高等植物營養(yǎng)根系共生而形成菌根。菌根具有改善宿主植物的營養(yǎng)狀況、增強宿主的抗逆性、加快污染土壤修復等功能[4]，并能增強污染土壤中農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全性[5]。因此，研究陜北適生植物及其根圍AM真菌多樣性，尤其是原油污染條件下AM真菌侵染的特點，對于采用生物技術(shù)修復污染土壤，維持植物的多樣性和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要意義。

菊科蒿屬植物是陜北油田荒地最常見的植物種類，本研究選取艾蒿(Artemisiaargyi)、黃花蒿(Artemisiaannua)、豬毛蒿(Artemisiascoparia)和白葉蒿(Artemisialeucophylla)4種抗逆性強、適應性廣、耐瘠薄草本植物，這4種植物均屬自然條件下陜北退化土壤恢復的先鋒物種，作為原油污染土壤生物修復材料具有一定研究價值。目前，生物修復技術(shù)方興未艾，國外已有通過投加微生物修復原油污染土壤的報道[6_7]，國內(nèi)針對生物修復材料的研究也極為廣泛[8_9]，但尚未有針對在陜北分布極為廣泛的蒿屬植物及其根圍AM真菌的研究。本研究采用盆栽方法，選用4種蒿屬植物，并設定不同濃度原油污染的土壤，測定原油污染協(xié)迫條件下蒿屬植物根圍AM真菌的多樣性、AM真菌侵染形態(tài)，并分析AM真菌對宿主植物生長的影響，為后期利用鄉(xiāng)土植物及根圍AM真菌提高修復效率并降低修復成本積累數(shù)據(jù)，為陜北原油污染土壤AM真菌生物修復技術(shù)的應用提供科學依據(jù)。

表1 不同質(zhì)量濃度原油污染土壤的理化性質(zhì)1)

注：1)字母不同表示在p<0.05水平上差異顯著，字母相同表示在p<0.05水平上差異不顯著，表3同。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自延安市楊家?guī)X植物園，自然風干后研磨過2 mm篩子，加入300 g細沙混勻以增強土壤通透性，每盆土總質(zhì)量約1.2 kg。原油取自延長石油集團七里村采油廠，不同質(zhì)量濃度原油污染土壤的理化性質(zhì)見表1。供試植物種子于2014年秋季野外采集并低溫保存，試驗時種子置于恒溫箱中培養(yǎng)，發(fā)芽后移至花盆中。

1.2 試驗方案

本研究前期調(diào)查結(jié)果表明，陜北污染土壤中總石油烴質(zhì)量濃度約為0.168～22.920 g/kg，因此設定原油添加質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、40 g/kg。

2015年5月進行盆栽試驗，選取艾蒿、黃花蒿、豬毛蒿和白葉蒿4種蒿屬植物為研究對象，每種植物各設0、5、10、20、40 g/kg 5種原油質(zhì)量濃度，各3組平行，共60盆，其中原油質(zhì)量濃度為0 g/kg的為無污染對照。原油按1∶1(體積比)溶解于石油醚中，然后倒入土壤充分混勻，靜置7 d后播種植物。供試花盆直徑和深度均為20 cm，每盆初始播種30粒，出苗后間苗保持在20棵/盆。花盆隨機置于向陽處、室溫、自然采光條件下生長，定時移動交換位置以保證植物采光均勻，每天2次澆灌。培養(yǎng)60 d后，分別測定植物株高，采集植物須根測定菌絲侵染率和叢枝侵染率，采集植物根際土壤測定AM真菌孢子密度，然后仔細連根拔出每盆植物，漂洗干凈后迅速烘干，測定每盆植物的干質(zhì)量。

1.3 主要測定方法

1.3.1 AM真菌侵染率測定

收集4種植物細根根段，參考文獻[10]的方法測定組織內(nèi)菌絲的侵染發(fā)育狀況，每種植物約25條細根置于Olympus BXSO顯微鏡下觀測根系的AM真菌的菌絲侵染率和叢枝侵染率，菌絲侵染率計算公式見式(1)，叢枝侵染率計算公式見式(2)。

菌絲侵染率=(菌絲侵染根段數(shù)/被檢根段總數(shù))×100%

(1)

叢枝侵染率=(叢枝侵染根段數(shù)/被檢根段總數(shù))×100%

(2)

1.3.2 AM真菌孢子密度

用濕篩傾注蔗糖離心法[11]對10 g風干土壤中的AM真菌孢子進行分離，在體視鏡下挑取AM真菌孢子對孢子進行計數(shù)。AM 真菌孢子密度為1 g風干土壤中含有的AM 真菌的孢子數(shù)，相對多度計算公式見式(3)，頻度計算公式見式(4)。

相對多度=某1個種的孢子數(shù)/總的孢子數(shù)×100%

(3)

頻度=某1個種出現(xiàn)的樣品數(shù)/總樣品數(shù)×100%

(4)

1.3.3 AM真菌鑒定

挑取孢子置于載玻片上，加浮載劑(如水、乳酸甘油、聚乙烯醇/乳酸甘油、Melzer’s試劑等)在顯微鏡下觀察，根據(jù)SCHECK等[12]的《外生菌根鑒定手冊》和國際AM真菌保藏中心(INVAM)提供的種的描述及圖片，并參閱有關(guān)鑒定材料和近年來發(fā)表的新種等進行種屬檢索、確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel處理試驗數(shù)據(jù)并繪圖，用SPSS 18.0生物統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Pearson雙變量相關(guān)分析。

表2 原油污染土壤中蒿屬植物根圍AM真菌多樣性

圖1 AM真菌孢子形態(tài)Fig.1 Spore morphologies of AM fungi

2 結(jié)果與討論

2.1 AM真菌多樣性

在所有試驗土壤樣品中分離并鑒定AM真菌共10種，其中球囊霉屬(Glomus)7種，無梗囊霉屬(Acaulospora) 3種。優(yōu)勢種為地球囊霉(Glomusgeospora)，出現(xiàn)的頻度為100.0%。艾蒿根圍AM真菌種類最多，黃花蒿根圍未分離出具皰球囊霉(Glomuspustulatum)，豬毛蒿根圍未見摩西球囊霉(Glomusmosseae)、具皰球囊霉和蜜色無梗囊霉 (Acaulosporamellea)，白葉蒿根圍未見摩西球囊霉和具皰球囊霉，原油污染土壤中蒿屬植物根圍AM真菌多樣性情況見表2，分離出的AM真菌孢子形態(tài)見圖1。原油污染土壤中蒿屬植物根圍AM真菌多樣性豐富，且不同植物根圍多樣性存在差異。與陜北自然條件下植物根圍AM真菌多樣性相比[13]，原油污染土壤AM真菌種類有所減少，但優(yōu)勢種的頻度和相對多度很高，這意味著個別菌種對原油具有強適生性和抗逆性。

2.2 原油污染土壤中蒿屬植物根系AM真菌侵染形態(tài)

AM真菌有兩個最明顯特征：一是能與植物互惠共生；二是在植物根細胞內(nèi)形成二叉的叢枝結(jié)構(gòu)，并由此得名[14]。4種蒿屬植物的根系都具有疆南星型菌根結(jié)構(gòu)。從原油質(zhì)量濃度為40 g/kg的土壤中分離出的艾蒿根系AM真菌共生體結(jié)構(gòu)見圖2。由圖2可知，在宿主幼嫩須根中形成大量胞間菌絲，在較為成熟的須根內(nèi)沿皮層細胞縱向延伸形成無隔菌絲。菌絲侵入皮層細胞內(nèi)后連續(xù)二叉分支形成典型花椰菜狀叢枝。從直徑小于0.5 mm的艾蒿須根中可觀察到叢枝在根皮層細胞中有成片分布，而無污染對照土壤中未見。

圖2 艾蒿根系AM真菌共生體結(jié)構(gòu)Fig.2 Symbiosis structures of AM fungi in root system of Artemisia argyi

表3 不同原油質(zhì)量濃度土壤中植物生物量和AM真菌侵染率

2.3 不同濃度原油土壤中植物生物量和AM真菌侵染率

在盆栽條件下，設定原油濃度為唯一差異因子，不同質(zhì)量濃度原油污染土壤中植物生物量和AM真菌侵染率見表3。由表3可知，4種植物根圍AM真菌孢子密度隨原油濃度的增加均總體顯著增加，原油質(zhì)量濃度為40 g/kg時AM真菌孢子密度達到最大。耿春女等[15]研究發(fā)現(xiàn)，油場周圍原油污染土壤中AM真菌孢子密度隨原油濃度增加而下降，這很可能是由于野外條件下，高濃度污染土壤本身鮮有存活植物，缺乏真菌生長的根系微環(huán)境。本研究觀測到的AM真菌對原油中的石油烴污染物有很強的耐受力，石油烴毒性能使土壤中許多生物致死，但這些生物的腐化可能反而為AM真菌生長提供了養(yǎng)分。王晨霞等[16]認為，輕度原油污染能刺激根區(qū)土壤微生物的生長，且土壤微生物對碳源的利用能力增強。JUSSI等[17]的菌根根際假說也認為，石油烴污染的土壤中富含易利用的富碳基質(zhì)，可促進植物根際的菌群對碳源的利用。本研究中AM真菌孢子密度隨原油濃度的增加而總體顯著增加，說明其并未受到高水平原油污染毒害作用的抑制。高濃度原油污染土壤易粘結(jié)成塊，水分凝結(jié)成珠難以入滲，AM真菌和植物的共生能促進植物對土壤中水分和氮、磷等養(yǎng)分的吸收，從而促進植物在逆境中生存和生長[18]。在原油污染土壤中，AM真菌可以改善宿主對礦質(zhì)營養(yǎng)的利用[19_20]，同時植株根系降解作用減弱了原油污染對土壤中微生物的脅迫，維護了微生物的生長環(huán)境[21]，因此在生物修復原油污染土壤的過程中，兩者間的共生支撐作用不容忽視。

表4 AM真菌侵染率與其他因子相關(guān)性分析1)

注：1)**表示p<0.01水平上有極顯著相關(guān)性。

隨著原油濃度增加，4種蒿屬植物的菌絲侵染率總體顯著增加。菌絲侵染率是表征AM 真菌與植物親和力的指標，說明原油污染脅迫條件下，宿主植物對AM真菌的依賴性顯著增強。原油質(zhì)量濃度≥20 g/kg條件下，植物根系中叢枝侵染率顯著高于無污染對照，而且在艾蒿須根中觀察到成片分布的叢枝。真菌對宿主植物的侵染也隨著原油濃度的增加而加大，兩者呈顯著正相關(guān)，這表明脅迫條件下植物與真菌相互間依賴性增加，其偏利共生關(guān)系得到強化。叢枝是植物與AM真菌之間進行能量與物質(zhì)交換的主界面，叢枝的豐富程度與發(fā)生強度，反映出菌根共生體功能單位的數(shù)量和真菌代謝潛力[22]。叢枝壽命很短，一般從形成到被植物消化掉只有1～2周[23]。AM真菌侵染率的相關(guān)研究大多以菌絲侵染率為代表，部分原因是由于叢枝侵染難以觀察且數(shù)量很少，本研究中艾蒿根系里叢枝侵染率最強，叢枝侵染形態(tài)典型并且清晰，尤其隨原油濃度增加而增加，說明隨著原油污染脅迫程度增加，植物與AM真菌之間物質(zhì)交換密集，代謝頻繁，宿主植物更多地依賴AM真菌來抵抗周邊毒性環(huán)境。采自四川遂寧原油污染土樣的分析也表明，艾蒿具有修復原油污染土壤的潛在優(yōu)勢[24]。

由表3可知，艾蒿和白葉蒿的株高和干質(zhì)量都是在原油質(zhì)量濃度達到20 g/kg后有顯著下降；黃花蒿株高在原油質(zhì)量濃度達到10 g/kg后開始顯著下降，干質(zhì)量在原油質(zhì)量濃度達到20 g/kg時開始顯著下降；豬毛蒿株高在各濃度間無顯著差異，干質(zhì)量在原油質(zhì)量濃度達到10g/kg時開始顯著下降。4種植物的株高和干質(zhì)量最小值都出現(xiàn)在40 g/kg。由此可見，植物生長受到高濃度原油污染的毒害，即使有真菌菌群的共生支持，生長情況也明顯受抑。

結(jié)合表2和表3，推薦艾蒿/地球囊霉組合為陜北原油污染土壤生物修復材料。

2.4 相關(guān)性分析

AM真菌侵染率與其他因子相關(guān)性分析結(jié)果見表4。由表4可知，AM真菌孢子密度、菌絲侵染率和叢枝侵染率均與土壤中原油濃度及總有機碳、速效氮和速效磷含量極顯著正相關(guān)，但是和速效鉀、脲酶活性極顯著負相關(guān)。前人研究也表明，土壤脲酶活性受到原油污染明顯的抑制[25_26]。脲酶活性表征土壤中有機氮向有效氮轉(zhuǎn)化，活性低則土壤氮素供應狀況不好。土壤中速效鉀的含量也與AM真菌侵染率顯著負相關(guān)。高翔[27]認為，污染土壤中植物吸收鉀的能力降低，但接種菌根真菌可有效地提高宿主植物對鉀的吸收。

3 結(jié) 論

(1) 原油污染條件下，蒿屬植物根圍共分離鑒定10種AM真菌，地球囊霉為優(yōu)勢菌種，4種植物中艾蒿根圍AM真菌多樣性最豐富。AM真菌對石油烴污染物有很強的耐受力，真菌孢子密度隨原油濃度的增加而總體顯著增加。

(2) 4種蒿屬植物的根系都具有疆南星型菌根結(jié)構(gòu)，叢枝侵染率在艾蒿根系中最強，并隨原油濃度升高而增加。結(jié)合植物生物量考慮，推薦艾蒿/地球囊霉組合為陜北原油污染土壤生物修復材料。

(3) AM真菌菌絲侵染率和叢枝侵染率與原油濃度呈顯著正相關(guān)，隨著原油濃度的增加而加大。但植物生長受到高濃度原油污染的毒害，即使有真菌菌群的共生支持，生長情況也明顯受抑。

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SymbioticrelationshipbetweenArtemisiaspeciesandarbuscularmycorrhizafungiincrudeoilcontaminatedsoil

SHANBaoqin，ZHANGYongtao，LIQian,BAIXuemei.

(CollegeofPetroleumEngineeringandEnvironmentalEngineering,Yan’anUniversity,Yan’anShaanxi716000)

The infection rates of arbuscular mycorrhizae (AM) fungi of root system ofArtemisiaargyi，Artemisiaannua，ArtemisiascopariaandArtemisialeucophyllawere measured in crude oil contaminated soil by pot experiment,as well as the morphological characteristics of AM fungi. Crude oil concentration was set at 0,5,10,20 and 40 g/kg respectively. The AM fungi were isolated and identified,and spore densities,hyphal rates,arbuscular rates,plant heights and dry weights were measured. The results showed that 10 species of AM fungi in two genera were isolated and identified from contaminated soil,7 species of them belong to the genusGlomus,and other species belong to genusAcaulospora.Glomusgeosporawas the dominant species. The diversity of AM fungi in the rhizosphere ofArtemisiaargyiwas larger than that of others. Morphological observation results showed that mutualistic symbiont named arum_type mycorrhiza was observed in root system of each kind of host plants. The spore densities,hyphal rates and arbuscular rates of AM fungi were all significantly positive correlated with the crude oil concentration. Plant heights and dry weights decreased with the increase of crude oil concentration.

crude oil contaminated soil; AM fungi;Artemisiaspecies; symbiosis

10.15985/j.cnki.1001_3865.2017.01.011

2016_03_01)

山寶琴，女，1970年生，博士，副教授，主要從事石油污染土壤生物修復方面的研究。

*陜西省教育廳科研項目(No.16JK1855);延安市科技局項目(No.2014KS_03);延安大學引導項目(No.YD2015_14)。