蜘蛛絲蛋白促凝血作用及其機(jī)制的初步探討

范釗坤 ，秦 甜 ，鄭 潔 ，曹澤標(biāo) ，周小青 *

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)科，中醫(yī)診斷湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

蜘蛛絲蛋白促凝血作用及其機(jī)制的初步探討

范釗坤1，秦 甜1，鄭 潔1，曹澤標(biāo)1，周小青2*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)科，中醫(yī)診斷湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

目的探索蜘蛛絲蛋白的促凝血作用，初步探討其作用機(jī)制。方法通過體外凝血實(shí)驗(yàn)(凝血板法、試管法、血漿復(fù)鈣時(shí)間測定)及創(chuàng)面止血實(shí)驗(yàn)(以SD大鼠為研究對象，進(jìn)行皮膚創(chuàng)面、肝臟創(chuàng)面、股動脈切開進(jìn)行局部創(chuàng)面止血實(shí)驗(yàn))，比較蜘蛛絲蛋白組、云南白藥組、生理鹽水組各組的凝血時(shí)間及止血時(shí)間；并采用凝固法測定各組大鼠活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和凝血酶時(shí)間(TT)。結(jié)果與生理鹽水組比較，蜘蛛絲蛋白組與云南白藥組均能顯著縮短大鼠體外凝血時(shí)間及大鼠皮膚創(chuàng)面、肝臟創(chuàng)面及股動脈切口的止血時(shí)間（P＜0.01 或P＜0.05），且能縮短大鼠的 APTT、PT 和 TT（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論蜘蛛絲蛋白具有較明顯的促凝血作用，激活內(nèi)源性凝血系統(tǒng)和外源性凝血系統(tǒng)可能為其作用機(jī)制之一。

蜘蛛絲蛋白；促凝血試驗(yàn)；凝血時(shí)間；止血時(shí)間

蜘蛛絲在民間作為醫(yī)療用品已經(jīng)有很長的歷史，《圣惠方》記載：“療瘡毒，止金瘡血出。炒黃研末，酒服，治吐血”，也有《千金方》“蜘蛛膜貼瘡上，數(shù)易之，瘥止”，可見其具有良好的凝血及促進(jìn)傷口痊愈的功效，因此在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方面有著廣泛的運(yùn)用。此外，蜘蛛絲還具有強(qiáng)度大、韌性好、可降解、與人體的相容性好、無毒副作用等特點(diǎn)[1]，這也使得它具有極大的醫(yī)學(xué)研究價(jià)值。特別是將蜘蛛絲用作高性能的生物醫(yī)用材料，可制成傷口封閉材料和生理組織工程材料，如人工關(guān)節(jié)、韌帶及組織修復(fù)等手術(shù)中的可降解超細(xì)傷口縫線等產(chǎn)品[2]。蜘蛛絲是一種天然蛋白纖維，各個(gè)領(lǐng)域已經(jīng)對其獨(dú)特的理化性能、力學(xué)性能及超收縮性能等方面進(jìn)行過深入研究[3]，而目前關(guān)于蜘蛛絲蛋白在凝血功效及機(jī)制探討方面的研究尚少。本實(shí)驗(yàn)將研究蜘蛛絲蛋白的促凝血作用，并初步探討其作用機(jī)制，以期為開發(fā)出一種高效、便捷、安全、價(jià)廉的生物可吸收性止血產(chǎn)品提供新的實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級健康 SD大鼠 30只,體質(zhì)量為300～350g,雌雄各半，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號:SCXK(湘)2011-0003，動物合格證號:NO.43004700015690。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SYXK(湘)2013-0005。用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組、云南白藥組和蜘蛛絲蛋白組，每組各10只，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥品與試劑

蜘蛛絲蛋白(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳資源研究所提供)；1%戊巴比妥鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；真空枸櫞酸鈉(9∶1)抗凝管；云南白藥(云南省大理制藥廠生產(chǎn))；秒表(深圳市良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)；APTT試劑盒(貨號 F008-1)、TT試劑盒(貨號 F009)、PT 試劑盒(貨號 F007)，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 藥物制備

將蜘蛛絲蛋白用75%乙醇回流提取3次；合并提取液，減壓回收乙醇至無醇味，依次用等體積石油醚、乙酸乙醋、正丁醇萃取3次；合并萃取液，減壓蒸餾得各提取部分干粉，待用。云南白藥粉按相同的方法，得粗提物干粉，待用。

2 方法

2.1 體外凝血實(shí)驗(yàn)的觀察

2.1.1 抗凝血液及抗凝血漿的制備 用一次性真空枸櫞酸鈉(9∶1)抗凝管(血與抗凝劑按 9∶1)自大鼠內(nèi)眥球后靜脈叢采血，輕輕混勻即成；抗凝血液經(jīng)離心機(jī)離心制備，分離血漿時(shí)要求相對離心力3 000r/min，15℃離心30min，待測。

2.1.2 凝血時(shí)間測定 將蜘蛛絲蛋白、云南白藥粉粗提物溶于生理鹽水配制成0.5%濃度，經(jīng)一次性進(jìn)口濾器抽濾成清亮、不同色澤的提取液，用此溶液進(jìn)行凝血時(shí)間(凝血板法、試管法、血漿復(fù)鈣時(shí)間)的測定。以云南白藥組為陽性對照組，并設(shè)生理鹽水陰性對照組。凝血時(shí)間縮短率=（對照組血凝時(shí)間-給藥組血凝時(shí)間）/對照組血凝時(shí)間×100%，一般以藥物凝血時(shí)間比對照組縮短30%以上者認(rèn)為有效。

2.2 局部創(chuàng)面止血試驗(yàn)

2.2.1 藥液及輔料的制備 將蜘蛛絲蛋白、云南白藥粗提物用生理鹽水溶解配制成2%濃度；體表創(chuàng)面止血用2cm×2cm浸有藥液紗布兩層；肝臟創(chuàng)面止血用1.5cm×1.5cm浸有藥液紗布兩層；股動脈切開止血用2cm×2cm浸有藥液紗布四層。

2.2.2 止血時(shí)間測定 將各組大鼠用1%戊巴比妥鈉按30mg/kg劑量腹腔注射麻醉后，備皮，在無菌條件下分別進(jìn)行皮膚創(chuàng)面（在大鼠背部左右兩側(cè)制造 1.5cm×1.5cm 大小的出血創(chuàng)面）、肝臟創(chuàng)面（開腹，暴露肝臟，并在肝表面切開大小1cm×0.5cm，深3cm大小肝組織，造成出血創(chuàng)面）、股動脈切開（鈍性分離暴露兩側(cè)股動脈，橫剪血管周徑1/3左右切口）進(jìn)行局部創(chuàng)面止血實(shí)驗(yàn)，擦拭去噴出的血液后，分別在出血創(chuàng)面平鋪蜘蛛絲蛋白紗布、云南白藥紗布、生理鹽水紗布，約30s左右揭開紗布觀察出血情況，以后每隔30s觀察1次，觀察指標(biāo)以不出血為止，記錄止血時(shí)間，觀察止血效果，計(jì)算其平均止血時(shí)間。

2.3 凝血指標(biāo)測定

各組大鼠用1%戊巴比妥鈉按30mg/kg劑量腹腔注射麻醉，10min后腹主動脈取血，置于一次性真空枸櫞酸鈉(9∶1)抗凝管中，輕輕顛倒混勻，3 000r/min，離心30min，收集上清液，即待測血漿。取待測血漿按照蜘蛛絲蛋白組、云南白藥組加入樣品，生理鹽水組則加入生理鹽水，混勻，37℃水浴預(yù)溫后按照各試劑盒的要求分別進(jìn)行活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間(PT)和凝血酶時(shí)間(TT)的測定。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料以“±s”表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體外凝血實(shí)驗(yàn)的觀察

與生理鹽水組相比，蜘蛛絲蛋白組及云南白藥組均能顯著縮短體外凝血時(shí)間（P＜0.01），但蜘蛛絲蛋白組與云南白藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表中亦可見蜘蛛絲蛋白組凝血時(shí)間縮短率在30%以上，表明蜘蛛絲蛋白有明顯促凝血作用。見表1。

表1 蜘蛛絲蛋白對大鼠體外凝血時(shí)間的影響 (±s，n=10，s)

表1 蜘蛛絲蛋白對大鼠體外凝血時(shí)間的影響 (±s，n=10，s)

注：與生理鹽水組比較，**P＜0.01。

組別生理鹽水組云南白藥組蜘蛛絲蛋白組凝血板法250.45±40.01 87.56±12.72**75.02±13.45**試管法290.15±57.66 101.45±15.34**85.87±18.01**血漿復(fù)鈣時(shí)間(RT)200.45±35.81 70.34±19.48**60.07±15.36**凝血時(shí)間縮短率/%-65.69±3.34 70.68±2.96

3.2 創(chuàng)面止血試驗(yàn)

與生理鹽水組相比，蜘蛛絲蛋白組及云南白藥組均能顯著縮短大鼠皮膚創(chuàng)面、肝臟創(chuàng)面及股動脈切口的止血時(shí)間（P＜0.01 或P＜0.05），且蜘蛛絲蛋白組與云南白藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說明蜘蛛絲蛋白有良好的創(chuàng)面止血作用。見表2。

表2 蜘蛛絲蛋白對大鼠局部創(chuàng)面的止血作用 (±s，n=10，s)

表2 蜘蛛絲蛋白對大鼠局部創(chuàng)面的止血作用 (±s，n=10，s)

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別止血時(shí)間皮膚創(chuàng)面 肝臟創(chuàng)面 股動脈切口生理鹽水組云南白藥組蜘蛛絲蛋白組90.11±20.88 54.53±9.27**45.12±11.29**96.32±16.73 62.57±10.69**57.89±14.36**104.37±19.22 74.46±11.43*61.07±15.58*

3.3 凝血功能試驗(yàn)（APTT，PT，TT 測定）

與生理鹽水組相比，蜘蛛絲蛋白組及云南白藥組均能夠顯著縮短大鼠的APTT、PT 和TT(P＜0.01或P＜0.05)，但蜘蛛絲蛋白組及云南白藥組兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示蜘蛛絲蛋白促凝血作用可能是通過內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑共同起作用的。見表3。

4 討論

蜘蛛絲治出血，古籍中早有記載，如《退齋閑錄》云：“凡人卒暴吐血者，用大蜘蛛網(wǎng)搓成小團(tuán)，米飲吞下，一服立止”，可見蜘蛛絲作為止血之物的歷史由來已久。《中華本草》上也有記載蜘蛛網(wǎng)粉能明顯縮短家兔凝血時(shí)間，且與劑量呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究顯示：在體外凝血實(shí)驗(yàn)及局部創(chuàng)面止血試驗(yàn)中，與生理鹽水組比較，蜘蛛絲蛋白組與云南白藥組均能顯著縮短大鼠體外凝血時(shí)間及大鼠皮膚創(chuàng)面、肝臟創(chuàng)面及股動脈切口的止血時(shí)間（P＜0.01 或P＜0.05），且凝血時(shí)間縮短率大于30%，證明蜘蛛絲蛋白確實(shí)具有良好的促凝血作用，促凝效果與云南白藥陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?，F(xiàn)代生物研究表明蜘蛛絲是具有多級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)纖維[4]，因其特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使得它能夠起到類似血小板的凝血作用，同時(shí)蜘蛛絲這種細(xì)的纖維具有良好的止血作用并可促進(jìn)傷口痊愈，在傷口包覆材料方面諸如脈管傷口修復(fù)材料、止血敷料、止血片、止血膠和縫合線等獲得了廣泛的應(yīng)用[5]。面對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中現(xiàn)有止血材料的種種弊端，例如臨床運(yùn)用最廣泛的可吸收性明膠海綿易繼發(fā)感染、黏附性差，且組織排異反應(yīng)大；膠原蛋白類材料止血速度慢、創(chuàng)面組織附著力差、容易破裂等[6]，因此開發(fā)止血效果更佳、更適用于臨床的新型止血材料勢在必行。目前中醫(yī)藥研究止凝血方較多，如膠艾湯[7]等，但蜘蛛絲蛋白無疑是具有極大研究價(jià)值及開發(fā)前景的止血材料選擇，因此本實(shí)驗(yàn)對蜘蛛絲蛋白的促凝血作用及機(jī)制探討的研究將為以后開發(fā)更佳的止血生物制品提供重要的借鑒意義。

表3 蜘蛛絲蛋白對大鼠APTT、PT 和TT 的影響 (±s，n=10，s)

表3 蜘蛛絲蛋白對大鼠APTT、PT 和TT 的影響 (±s，n=10，s)

注：與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別生理鹽水組云南白藥組蜘蛛絲蛋白組APTT 52.81±8.05 48.11±5.42*41.11±7.84**PT 18.95±3.64 12.61±3.14**10.58±2.09**TT 30.11±4.92 27.11±4.01*22.11±3.82**

目前公認(rèn)凝血過程是一個(gè)由多因子共同參與的復(fù)雜過程，主要分為“內(nèi)源性凝血途徑”和“外源性凝血途徑”[7]。前者是由血管內(nèi)膜損傷激活所引發(fā)，后者則通過血管外的凝血因子與血液接觸而啟動。本實(shí)驗(yàn)測定的三個(gè)凝血功能指標(biāo)中，APTT主要反映內(nèi)源性凝血系統(tǒng)狀況，PT主要反映外源性凝血系統(tǒng)狀況，TT則主要反映纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白所需時(shí)間及內(nèi)、外源凝血途徑是否存在抗凝和纖溶亢進(jìn)[8]，通過測定此三項(xiàng)指標(biāo)，可以檢測實(shí)驗(yàn)樣品是否通過激活凝血系統(tǒng)中的多種凝血因子起作用。在該凝血功能測定中，蜘蛛絲蛋白組及云南白藥組均能夠顯著地縮短大鼠的 APTT、PT 和 TT(P＜0.01 或P＜0.05)，說明蜘蛛絲蛋白促凝血作用機(jī)制可能是通過內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑共同起作用的，即對內(nèi)源性和外源性凝血途徑的多種凝血因子具有激活作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究表明蜘蛛絲蛋白具有明顯的促凝血作用，初步探討其作用機(jī)制可能與激活內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)中的多種凝血因子有關(guān)系，但是其對各凝血因子的具體影響程度方面還需要進(jìn)一步的研究，因此更深層次的機(jī)制還有待深入探討。

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Preliminary Discussion on Procoagulant Role and Mechanism of Spider Silk Protein

FAN Zhaokun1，QIN Tian1，ZHENG Jie1，CAO Zebiao1，ZHOU Xiaoqing2*
(1.Graduate School,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Institute of Diagnostics of Chinese Medicine,Hunan University of Chinese Medicine;Key Laboratory of Diagnostics of Chinese Medicine in Hunan province;Collaborative Center for Research and Innovation of Digital Chinese Medicine;Changsha,Hunan 410208,China)

ObjectiveTo investigate the procoagulant role of spider silk protein and discuss its mechanism.MethodsTo compare the clotting time in vitro and hemostatic time of spider silk protein group,Yunnan Baiyao group and saline group through coagulation experiment conducted in vitro(coagulation method,tube method and recalfication time)and hemostatic experiment in wound surfaces(skin,liver,and femoral artery)in SD rats.Activated partial thromboplastin in time(APTT),prothrombin time(PT)and thrombin time(TT)were evaluated by solidification method in rats of each group.ResultsThe clotting time in vitro and hemostatic time of spider silk protein group and Yunnan Baiyao group were obviously shortened compared with that of saline group(P＜0.01orP＜0.05).Moreover,APTT,PT and TT were also obviously shortened compared with those of saline group (P＜0.01orP＜0.05).ConclusionSpider silk protein shows obvious blood clotting effect.Activating endogenous coagulation and extrinsic coagulation may be one of its procoagulant mechanisms.

spider silk protein； procoagulant test； clotting time； hemostatic time

本文引用：范釗坤，秦 甜，鄭 潔，曹澤標(biāo)，周小青.蜘蛛絲蛋白促凝血作用及其機(jī)制的初步探討[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（10）：1052-1055.

R285.5;Q51

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2017.010.002

2015-12-17

國家自然科學(xué)基金（81373702，81473567，81202632），教育部博士點(diǎn)基金（20124323120003），湖南省自然科學(xué)基金（13JJ3097），湖南省教育廳科研項(xiàng)目（14B134，15K092），湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（2014cx04）。

范釗坤，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)槟X血管病中西醫(yī)結(jié)合防治。

* 周小青，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：zxq5381@sohu.com。

（本文編輯 李 杰）