落葉松八齒小蠹伴生致病菌的特異性快速檢測

劉學(xué)偉， 王 正， 呂 全， 張雪萍， 王秀芹， 孔祥波， 張星耀

（1.南京林業(yè)大學(xué) 南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3.天津市武清區(qū)林業(yè)局，天津301700；4.海拉爾國家森林公園，內(nèi)蒙古 海拉爾 021000；5.遼寧省朝陽師范高等?？茖W(xué)校 生化工程系，遼寧 朝陽122000）

落葉松八齒小蠹Ips subelongatus給東北以落葉松Larix spp.為建群樹種的森林生態(tài)系統(tǒng)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失［1－2］，被列為中國林業(yè)危險性有害生物。在森林生態(tài)系統(tǒng)中，小蠹蟲與真菌能夠形成穩(wěn)定的伴生關(guān)系，這種關(guān)系某種程度上屬于互惠共生。長喙殼類真菌（ophiostomatoid fungi）為小蠹蟲伴生真菌的主要類群［3－5］。許多情況下小蠹蟲危害寄主甚至導(dǎo)致寄主死亡的過程中，長喙殼類真菌起到關(guān)鍵作用［6－7］。一些長喙殼類真菌是重要的林木病原物，具有強(qiáng)致病力。如Endoconidiophora polonica在人工接種條件下可以將40年生云杉Picea abies致死［8］，而且伴生菌的侵染還可以增加小蠹的危害性［9］。近年來，中國也對落葉松八齒小蠹伴生真菌有一些研究和報道［10－12］，主要集中在對伴生菌的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析上［13－14］，發(fā)現(xiàn)了多種落葉松八齒小蠹伴生長喙殼真菌種類。野外落葉松成熟林接種實(shí)驗(yàn)表明：Ophiostoma olgensis和Endoconidiophora fujiensis等2個優(yōu)勢種表現(xiàn)出顯著的致病性，這2種真菌可以在內(nèi)韌皮部和形成層形成明顯壞死斑［10,15］。由于該類病害發(fā)生隱蔽，一般很難早期發(fā)現(xiàn)和診治。為了達(dá)到早發(fā)現(xiàn)早治療的目的，摸清病害的分布并評估其危害，需要實(shí)現(xiàn)對病原菌的快速和準(zhǔn)確檢測，從而為病害和蟲害的防治提供科學(xué)基礎(chǔ)?？焖贆z測技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病原物和害蟲的檢測，如線蟲、病原真菌、棗實(shí)蠅 Carpomya vesuviana和細(xì)菌等［16－21］。針對不同物種檢測所用方法也不同，特異引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測方法是設(shè)計(jì)特異性引物來實(shí)現(xiàn)對待檢目標(biāo)的特異性檢測，國外已有一些長喙殼真菌種類利用該方法實(shí)現(xiàn)檢測的報道［19－21］，但對中國北方落葉松林內(nèi)分布的病原菌的快速檢測一直是空白。傳統(tǒng)組織分離法是進(jìn)行病害鑒定的首要方法，然而受人為和環(huán)境因素，以及病原菌的生長特點(diǎn)等影響，往往不能對病原菌實(shí)現(xiàn)有效分離。嘗試直接從感病寄主組織中提取DNA進(jìn)行病原菌的特異性檢測，是本項(xiàng)研究希望解決的問題。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)菌株為分離自中國北方的興安落葉松Larix gmelini，長白落葉松L.olgensis，華北落葉松L.principis-rupprechtii和日本落葉松L.kaempferi林中的落葉松八齒小蠹伴生真菌，包括Endoconidiophora fujiensis等，分布于歐洲落葉松L.decidua林內(nèi)的近緣種歐洲落葉松八齒小蠹Ips cembrae和歐洲云杉Picea abies林內(nèi)的近緣種云杉八齒小蠹Ips typographus伴生的長喙殼真菌種類，包括Endoconidiophora laricicola等，以及其他長喙殼真菌近緣種，如分離自山東、浙江的松材線蟲病Bursaphelenchus xylophilus伴生長喙殼真菌，菌株詳細(xì)信息見表1。除分離自中國的長喙殼類真菌外，其余菌株購自荷蘭烏得勒支菌種保藏中心（CBS），或交流自南非林業(yè)和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)菌種保藏中心（CMW），加拿大國家真菌標(biāo)本和菌種保藏中心（DAOM）和日本筑波大學(xué)植物病理與真菌學(xué)、生命與環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)室（YCC）。上述菌株保存在中國林業(yè)科學(xué)研究院菌物保存中心（CFCC）與森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所森林病理實(shí)驗(yàn)室（CXY）。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀（Biometra，德國），Mixer/Mill 8000高能量球磨機(jī)（SPEX CertiPrep，美國），DYY-4型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠，中國），Alpha imager EP凝膠成像系統(tǒng)（ProteinSimple，美國），天根植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），核酸染料。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本的采集 在北方3種落葉松林內(nèi)進(jìn)行落葉松八齒小蠹蟲體樣本與坑道組織樣本的采集，每個蟲體單獨(dú)保存于滅菌1.5 mL的離心管內(nèi)，坑道標(biāo)本分裝于干凈牛皮紙信封內(nèi)，自然通風(fēng)保存。盡快帶回實(shí)驗(yàn)室用于真菌的分離和DNA的提取。

表1 特異性引物設(shè)計(jì)與檢測所用長喙殼真菌菌株信息Table 1 Ophiostoma and Endoconidiophora species used for developing species-specific sequences primers

1.2.2 真菌分離及鑒定 伴生真菌的分離采用組織分離法，用剪刀將坑道標(biāo)本切成5 mm×5 mm大小的組織塊，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%次氯酸鈉溶液進(jìn)行表面消毒處理50 s，后用無菌水沖洗干凈。將沖洗干凈的組織塊放在無菌濾紙上，待表面水分吸干后接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的水瓊脂培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿封口后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)4 d后挑取菌落外端的菌絲塊進(jìn)行分離純化，將純化后的真菌接種到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%MEA培養(yǎng)基（麥芽浸粉10 g，瓊脂粉10 g，加蒸餾水配制500 mL）進(jìn)行培養(yǎng)。基于形態(tài)學(xué)和DNA片段系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為Ophiostoma olgensis和Eudoconidiophora fujiensis［14－15］。

1.2.3 DNA提取 從菌絲塊和韌皮坑道組織樣本中提取DNA。菌絲塊DNA提?。菏紫扔脽o菌接種針挑取收集菌絲組織，將菌絲塊放入1.5 mL的離心管中，放在－20℃冰箱中冷凍，采用北京天根公司植物基因組DNA提取試劑盒推薦的方法來提取DNA。在分別分離到病原菌O.olgensis和E.fujiensis的感病韌皮部組織樣本中提取總DNA，方法如下：將樣本切成4 mm×4 mm大小的組織塊，放入1.5 mL的離心管中，放在－20℃冰箱中冷凍1晚，然后將其放在高能量球磨機(jī)中研磨7 min，余下步驟與菌絲組織DNA提取方法相同。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增條件 分別以O(shè)phiostoma olgensis和Eudoconidiophora fujiensis的ITS序列為目標(biāo)序列［22－23］，通過Blast在基因庫（GenBank）上搜索與之親緣關(guān)系較近的菌種已發(fā)表的ITS序列（表1），用MAFFT在線進(jìn)行序列比對分析。針對目標(biāo)菌種的特殊序列區(qū)域人工設(shè)計(jì)引物，之后針對引物是否存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體等使用Primer Premier 5.0進(jìn)行檢查。將設(shè)計(jì)好的引物序列在GenBank中檢查序列同源性。針對O.olgensis設(shè)計(jì)引物15對，針對E.fujiensis設(shè)計(jì)引物10對，并分別對目標(biāo)菌種純培養(yǎng)物DNA進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，通過觀察擴(kuò)增條帶的寬度和大小進(jìn)行篩選，各獲得特異引物1對，用于上述菌絲和寄主組織DNA的擴(kuò)增。引物由北京寶銳通生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：100 mmol·L－1氯化鉀，2×Taq PCR MasterMix ［500 μmol·L－1三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTP）， 0.1 U（1 U=16.67 nkat）Taq 聚合酶， 3 mmol·L－1氯化鎂， 20 mmol·L－1三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl， pH 8.3）］12.5 μL， 雙蒸水 9.5 μL， 模板 1.0 μL， 引物（濃度 1 μmol·L－1）各 1.0 μL。 針對 O.olgensis和O.kryptum的反應(yīng)條件為94℃3 min；94℃1 min，63℃45 s，72℃1 min，循環(huán)35次；72℃ 4 min。針對E.fujiensis的反應(yīng)條件為94℃ 3 min；94℃ 1min，64℃ 45 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃4 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠（2.2%）進(jìn)行電泳檢測（130 V,60 min），拍攝電泳照片，觀察擴(kuò)增條帶的寬度和大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢測

篩選獲得針對 O.olgensis特異性檢測的引物 1對：OK1（5′-CTCGAACCTTTTTTTTAAACCGT-3′）和OK2（5′-GCCAGCGCACCCAGAA-GGTTGCGC-3′）。對 O.olgensis和從落葉松八齒小蠹上分離到的Ophiostoma屬真菌及與之親緣關(guān)系較近的其他長喙殼類真菌一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果表明除了O.olgensis和O.kryptum的菌株在248 bp處有一條清晰明亮的條帶外，其他菌株均無任何條帶（圖1）。

圖1 特異性引物檢測Ophiostoma olgensis和其他長喙殼真菌純培養(yǎng)物的凝膠圖譜Figure 1 Agarose gel images of PCR amplicons obtained with the specific primers of Ophiostoma olgensis

篩選獲得針對E.fujiensis特異性檢測的引物1對：EFU1（5′-CTAGAGAATTTATTTTCATTGCTGA-3′）和EFU2（5′-GCAAAGATATGC-GGGTCCT-3′）。對E.fujiensis和從落葉松八齒小蠹上分離到的Ophiostoma屬真菌及與之親緣關(guān)系較近的其他Endoconidiophora屬真菌一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離。除了E.fujiensis的菌株在251 bp處有1條清晰明亮的條帶外，其他菌株均無任何條帶（圖2）。

2.2 感病韌皮部組織樣本病原物特異性檢測

提取感染O.olgensis真菌的韌皮部組織樣本DNA，以O(shè).olgensis和O.kryptum純培養(yǎng)物DNA為對照，用特異性引物OK1/OK2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，均檢測到1條248 bp大小的條帶（圖3A）。但韌皮部組織DNA的PCR產(chǎn)物條帶與O.olgensis和O.kryptum純培養(yǎng)物DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相比，條帶不夠清晰。為了獲取清晰條帶，以本次感病組織PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第2次PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃3 min；94℃ 1 min，68℃ 45 s，72℃ 1 min， 循環(huán)35次；72℃4 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到與純培養(yǎng)物擴(kuò)增產(chǎn)物一樣清晰的248 bp大小的條帶（圖3B）。

提取感染E.fujiensis真菌的韌皮部組織樣本DNA，以E.fujiensis純培養(yǎng)物DNA模板為對照，用特異性引物EFU1/EFU2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離。韌皮部組織樣本DNA的PCR產(chǎn)物與E.fujiensis純培養(yǎng)物DNA的PCR產(chǎn)物在251 bp處都有1條較清晰的條帶（圖3C）。

圖2 特異性引物檢測Endoconidiophora fujiensis和其他長喙殼真菌純培養(yǎng)物的凝膠圖譜Figure 2 Agarose gel images of PCR amplicons obtained with specific primers of Endoconidiophora fujiensis

圖3 特異性引物直接在感病韌皮部組織中檢測Ophiostoma olgensis，O.kryptum和Endoconidiophora fujiensis的凝膠圖譜Figure 3 Agarose gel images of PCR amplicons obtained with specific primers for Ophiostoma olgensis,O.kryptum and Endoconidiophora fujiensisfrom infectious phloem tissues

3 結(jié)論與討論

本研究針對落葉松八齒小蠹在中國的優(yōu)勢伴生病原菌O.olgensis和E.fujiensis，分別篩選出2對檢測引物OK1/OK2和EFU1/EFU2，能夠?qū)崿F(xiàn)從伴生菌區(qū)系和其他長喙殼類真菌近緣種中特異性檢測到這2個種，并且得以從感病寄主組織中對病原菌進(jìn)行直接檢測，為實(shí)現(xiàn)這2種病原菌的檢疫和早期監(jiān)測提供了條件。

O.olgensis是中國最近發(fā)現(xiàn)的 一 個 新 種［15］，與 O.kryptum 的親緣關(guān)系十分接近，這2個近緣種的ITS一級結(jié)構(gòu)差異僅在序列兩翼。為了能夠與其他更廣泛的長喙殼類真菌區(qū)分，本研究篩選出的特異性PCR引物（OK1/OK2）是選取ITS序列中間區(qū)段設(shè)計(jì)出來的，因此無法區(qū)分這2個種。O.kryptum是歐洲落葉松八齒小蠹伴生的病原菌種類［24］，目前未發(fā)現(xiàn)在中國分布。因此，該引物可以在中國落葉松林內(nèi)實(shí)現(xiàn)對O.olgensis的特異性檢測。但由于歐亞大陸的一體性以及落葉松林的廣泛分布，O.kryptum有傳入中國的潛在威脅，因此下一步工作仍需針對區(qū)分這2個近似種進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)和檢測。對包括日本在內(nèi)4個地區(qū)不同寄主的E.fujiensis菌株進(jìn)行了檢測，均可得到特異性擴(kuò)增，表明此方法對E.fujiensis的檢測具有普遍適用性。E.fujiensis是落葉松八齒小蠹伴生菌區(qū)系中的先鋒種和致病力最強(qiáng)的病原菌［14］，對它實(shí)現(xiàn)特異性快速檢測將為制定防治病蟲復(fù)合危害的有效策略和措施提供科學(xué)依據(jù)。

近幾年，越來越多的分子生物學(xué)快速檢測技術(shù)被運(yùn)用到病原物和害蟲的檢疫檢測當(dāng)中，如特異性PCR方法，免疫層析法，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)檢測法等［25－29］。特異性PCR檢測方法相對于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)檢測方法優(yōu)勢明顯：采用特定序列擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SCAR-PCR）的方法研制松材線蟲快速檢測試劑盒，對松材線蟲的檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%，彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)鑒定的不足［16］；利用棗實(shí)蠅mtDNA的COI基因片段設(shè)計(jì)并篩選出的特異性引物的SS-PCR方法，實(shí)現(xiàn)了對不同蟲態(tài)棗實(shí)蠅的特異性快速檢測［17］；簡單重復(fù)序列-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SS-PCR）技術(shù)也能夠提升美洲斑潛蠅Liriomgza sativae的鑒定與檢測效率和準(zhǔn)確性［18］。目前國外對約7種長喙殼類伴生菌開展了基于PCR的特異性檢測［21,30－33］。鑒于長喙殼類真菌的致病性及其與昆蟲復(fù)合危害寄主的特殊性，有必要進(jìn)一步開展國內(nèi)其他重要長喙殼類病原真菌的檢測研究。本研究僅對感病寄主組織開展了病原菌的檢測，下一步仍需對蟲體帶菌、人工接種等方式優(yōu)化檢測反應(yīng)體系和定量評估檢測的靈敏度。

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