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    烏拉爾甘草查耳酮異構酶基因多態(tài)性分析

    2017-11-06 01:24:56馬永生張曉冬尹彥超周姍胡婷高智強劉穎
    生物技術通訊 2017年4期
    關鍵詞:異構酶烏拉爾甘草

    馬永生,張曉冬,尹彥超,周姍,胡婷,高智強,劉穎

    北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院,北京 100102

    烏拉爾甘草查耳酮異構酶基因多態(tài)性分析

    馬永生,張曉冬,尹彥超,周姍,胡婷,高智強,劉穎

    北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院,北京 100102

    目的:對烏拉爾甘草黃酮代謝途徑中的關鍵酶查耳酮異構酶(CHI)進行基因克隆及多態(tài)性分析。方法:取5株烏拉爾甘草新鮮根樣,提取RNA并逆轉錄得cDNA,利用特異引物克隆烏拉爾甘草CHI基因,測序并對所得序列進行多態(tài)性分析。結果:共獲得62條全長為690bp的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列,編碼229個氨基酸殘基。多態(tài)性分析顯示62條CHI基因cDNA序列存在47個變異位點,可分為20種不同單倍型(單倍型1~20),其相似度為99.62%;氨基酸序列存在30個變異位點,可分為16種類型(AA1~AA16),一致性為98.99%。CHI基因編碼蛋白為穩(wěn)定性親水蛋白,相對分子質量為24 400,等電點為5.3~6.7,二級結構以α螺旋和無規(guī)卷曲為主。同源性分析顯示,該基因序列與豆科植物大豆的CHI基因親緣性最近。結論:克隆了烏拉爾甘草CHI基因并對其進行了多態(tài)性分析,為進一步探究CHI基因對甘草苷生物合成的分子調(diào)控機制奠定基礎。

    烏拉爾甘草;查耳酮異構酶;甘草苷;基因克隆;多態(tài)性分析

    烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)為豆科甘草屬植物。2015版《中國藥典》規(guī)定栽培甘草的檢測指標為:甘草酸含量不低于2.0%,甘草苷含量不低于0.50%[1],因此甘草苷是評價甘草質量的重要指標之一。大量藥理學研究表明,甘草苷具有抗癌、抗糖尿病、抗病毒、抗抑郁等多種藥理活性[2]。《中國藥典》規(guī)定甘草有3種基原植物,即烏拉爾甘草、光果甘草(G.glabra L.)及脹果甘草(G.inflata Bat.)。本課題組前期對這3種基原甘草進行了4種主要黃酮類化合物的含量分析[3],發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草中甘草苷含量明顯高于其他2種基原植物。因此,對烏拉爾甘草中甘草苷的生物合成途徑開展相關研究,將有助于揭示高甘草苷積累的分子機制。

    多種酶參與甘草苷的生物合成,其中查耳酮異構酶(chalcone isomerase,CHI)催化分子內(nèi)環(huán)化反應,是甘草苷生物合成的關鍵酶之一[4]。1987年,研究者利用抗體技術首次從法國豌豆(Pisum sativum L.)中分離得到CHI基因[5],隨后陸續(xù)從矮牽牛(Petunia hybrida Vilmorin)[6]、菜豆(Phaseo?lus vulgaris L.)[7]、野茶樹(Camellia sinensis K.)[8]等植物中克隆得到該基因。迄今,GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊了1164條植物CHI的DNA序列及278條cDNA序列。有報道顯示,過表達CHI基因的甘草毛狀根中黃酮類化合物的含量明顯提高[9],從而證明了CHI基因對甘草黃酮生物合成的明確影響。然而,CHI基因在同一植物中通常以多拷貝形式存在,關于CHI基因多態(tài)性對黃酮代謝途徑影響的相關研究尚未見諸報道。

    我們對烏拉爾甘草中甘草苷生物合成途徑的關鍵酶基因CHI進行了克隆及多態(tài)性分析,并對其主流單倍型做生物信息學分析,以期為進一步揭示CHI基因多態(tài)性對甘草苷生物合成的影響機制奠定基礎,并為篩選甘草優(yōu)良基因、分子育種、提高栽培甘草質量提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    取5株新鮮烏拉爾甘草主根,立即液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD-19T載體、ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、M-MLV(Rnase H-)反轉錄試劑盒均購于北京博邁德生物技術有限公司;LA-Taq DNA聚合酶、oligo(dT)購于TaKaRa公司。微量移液器(Eppendorf公司);1-13000型離心機(Sigma公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);BG-gdsAUTO510型凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司);酶標儀(Biotek Epoch公司)。

    1.2 RNA提取及逆轉錄

    取新鮮烏拉爾甘草主根于液氮中迅速研磨成細粉,取適量用ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒逐步提取總RNA,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性,用酶標儀對所得RNA的D260nm/D280nm值及濃度進行測定,以確定RNA的純度和濃度。用M-MLV反轉錄試劑盒,以oligo(dT)為引物進行逆轉錄。

    1.3 烏拉爾甘草CHI基因擴增及測序

    根據(jù)文獻報道[10],用Primer 5.0設計上游引物GF(5′-ATGGCGGGAGCAGCACCAGTA-3′)、下 游引物 GR(5′-TCAGTTTCCGTTTCCAAT-3′),采用50μL反應體系[包括模板cDNA 2.0μL、10×緩沖液 5.0μL、dNTP(2.5mmol/L)5.0μL、引物 GF和 GR 各 2.0μL(5μmol/L)、LA-Taq 酶 1.0μL、無RNase的水33.0μL]進行PCR(反應程序:95℃預變性2min;95℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸45s,35個循環(huán);72℃延伸5min,4℃保存),經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果,然后對產(chǎn)物進行膠回收純化。將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體連接,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,涂于含有氨芐西林(Amp,50 mg/L)的LB平板上培養(yǎng),每個樣品隨機挑取20個以上單克隆進行PCR驗證,陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測至飽和。

    1.4 烏拉爾甘草CHI生物信息學分析

    利用DNAMAN對所得CHI序列進行比對分析,利用Editseq將其翻譯成氨基酸序列,通過DNASTAR7.0、ExPASy等分析其二級結構、三級結構及基本理化性質,并通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫查找其他物種的CHI序列,利用MEGA5.1構建系統(tǒng)進化樹。

    2 結果

    2.1 烏拉爾甘草CHI的克隆及序列分析

    共獲得62條長度約為690bp的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列(圖1),與目標條帶長度一致。測序結果顯示,所得62條cDNA序列長度均為690bp。DNAMAN比對結果顯示62條cDNA序列中存在47個變異位點,可確定為20種單倍型(1~20),一致性為99.62%,各單倍型變異位點統(tǒng)計于表1。20種烏拉爾甘草CHI單倍型均編碼229個氨基酸殘基,可確定為16種氨基酸序列類型(AA1~AA16),一致性為 98.99%,存在 30個變異位點,詳見表2。

    表1 20種烏拉爾甘草CHI基因單倍型變異位點統(tǒng)計表

    在GenBank中對20種烏拉爾甘草CHI單倍型進行注冊,序列登錄號及各序列所占比例見表3。在62條烏拉爾甘草CHI cDNA序列中,單倍型3為19條,出現(xiàn)頻率最高(30.7%),為主流單倍型;單倍型3、8、13、18及20編碼相同的氨基酸序列,即AA3,其所占比例可達43.5%,為主流氨基酸序列類型,推測其在甘草苷生物合成中起關鍵作用。

    2.2 烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列理化性質分析

    通過ExPASy在線分析了16種烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列的基本理化性質,結果如表4。烏拉爾甘草CHI編碼蛋白由229個氨基酸殘基組成,相對分子質量為24 400,等電點為5.3~6.7;總平均親水性(GRAVY)均為負值,表明烏拉爾甘草CHI為親水性蛋白;不穩(wěn)定指數(shù)均小于40,表明其為穩(wěn)定性蛋白;半衰期為30h

    圖1 烏拉爾甘草CHI擴增結果

    表2 16種烏拉爾甘草CHI氨基酸序列變異位點統(tǒng)計表

    2.3 烏拉爾甘草CHI的二級結構分析及三級結構預測

    以主流氨基酸序列AA3為目標序列,利用DNASTAR7.0和ExPASy分析其二級結構,結果如圖2,α螺旋占34.06%,β轉角占11.79%,延長鏈占21.40%,無規(guī)卷曲占32.75%。SWISS-MODEL在線預測的AA3三級結構如圖3,表明CHI含有較多的α螺旋和無規(guī)卷曲,與二級結構預測相符。

    2.4 烏拉爾甘草CHI同源性分析

    按照親緣關系遠近,從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選了有代表性的17個物種的CHI氨基酸序列,利用DNAMAN將本研究獲得的16條烏拉爾甘草CHI氨基酸序列與其進行序列比對分析,發(fā)現(xiàn)相似度最高的為豆科植物大豆(Glycine max)(75.55%),相似度最低的為單子葉植物大葉藻(Zostera mari?na L.)(13.28%)。利用 ClustalW1.8和 MAGA5.1,將上述33條CHI氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖4),所有序列聚類可聚為3支,所有豆科植物聚為1支,其他雙子葉植物聚為1支,單子葉植物聚為1支。在豆科植物中,16條烏拉爾甘草CHI氨基酸序列單獨聚為1小支。整體而言,烏拉爾甘草CHI氨基酸序列與大豆在進化關系上相距最近,而與大葉藻和玉米在進化關系上最遠,這與序列比對分析結果相符。

    表3 烏拉爾甘草20種CHI單倍型GenBank登錄號及所占比例

    表4 烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列理化性質

    圖2 烏拉爾甘草CHI二級結構預測

    圖3 烏拉爾甘草CHI三級結構預測

    3 討論

    甘草作為我國最常用的大宗藥材之一,國內(nèi)外需求量巨大。但由于野生甘草資源匱乏,近年來國務院明令禁止采挖野生甘草,因此栽培甘草已成為商品甘草的主流產(chǎn)品。本課題組前期對來自全國7個甘草主產(chǎn)區(qū)的532株兩年生栽培甘草樣品的調(diào)查研究顯示,栽培甘草中甘草苷的含量差異十分顯著,分布范圍為0.058%~3.43%,且60%左右的栽培甘草中甘草苷的含量難以達到藥典規(guī)定的最低標準,嚴重影響到栽培甘草的質量。而功能基因的多態(tài)性是影響甘草質量的重要分子基礎,因此對甘草黃酮代謝途徑中的關鍵功能基因開展研究,對于提高栽培甘草質量具有深遠意義。

    CHI作為黃酮類化合物生物合成的關鍵酶之一,是第一個被認識的類黃酮生物合成的相關酶。目前,CHI已經(jīng)在矮牽牛[11]、銀杏(Ginkgo bi?loba L.)[12]、百合(Lilium speciosum T.)[13]等多種植物中得到克隆。此外,在一些細菌和真菌中也克隆到CHI基因[14]。本研究共克隆得到62條烏拉爾甘草CHI序列,可分為20種單倍型,其一致性相對較好,為99.62%,主流單倍型為單倍型3,所占比重為30.7%。20種CHI單倍型編碼16條氨基酸序列,一致性為98.99%,主流氨基酸序列類型為AA3,所占比重為43.5%,因此推測AA3在甘草苷的生物合成中起關鍵作用。但是,CHI在不同物種間同源性相對較低,聚類分析顯示同源性相對最近的大豆CHI與本實驗中所得烏拉爾甘草CHI序列的一致性也只有75.55%,因此給同源克隆造成一定的難度。

    植物CHI是否表達及表達量的高低都會影響黃酮含量的變化,如缺乏CHI的玉米突變體,其查耳酮積累下降,導致玉米呈現(xiàn)古銅色[15];通過對黃芩毛狀根CHI基因過表達或基因沉默處理,發(fā)現(xiàn)其黃酮含量相應地增加或減少[16];將紅花CHI轉到擬南芥中過表達,結果表明轉基因擬南芥中黃酮含量比野生型擬南芥高2.3倍[17];此外,還有研究表明,在西紅柿中超量表達矮牽牛CHI,結果導致果皮中黃酮醇含量比對照品高78倍[18]。這些研究在一定程度上說明了CHI在黃酮代謝途徑中的重要性。本研究克隆得到20種甘草CHI單倍型,這將為進一步分析甘草中CHI基因多態(tài)性與甘草苷生物合成的相關性,以及提高栽培甘草中甘草苷的含量奠定基礎。

    圖4 CHI系統(tǒng)進化樹分析

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    Polymorphism Analysis of Chalcone Isomerase Gene of Glyc?yrrhiza uralensis Fisch.

    MA Yong-Sheng,ZHANG Xiao-Dong,YIN Yan-Chao,ZHOU Shan,HU Ting,GAO Zhi-Qiang,LIU Ying*
    School of Life Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
    *Corresponding author,E-mail:liuyliwd@sina.com

    Objective:To clone and analyze chalcone isomerase(CHI) gene of Glycyrrhiza uralensis Fisch.Meth?ods:RNA was extracted from the fresh root of G.uralensis,cDNA was reversely transcribed,and then CHI was cloned using specific primers.The obtained CHI cDNA sequences were analyzed using bioinformatics.Results:Six?ty-two CHI cDNA sequences with a full length of 690bp were obtained.Forty-seven variable sites were present in these CHI cDNA sequences,and twenty haplotypes were determined,the similarity of which was 99.62%.Thir?ty variable sites were present in the amino acid sequences,and sixteen types were determined,the similarity of which was 98.99%.Bioinformatic analysis shows that G.uralensis CHI cDNA sequence has a complete open read?ing frame,encoding a stable hydrophilic protein with 229 amino acids.Its isoelectric point is between 5.3 and 6.7,molecular weight is about 24.4 kD.Most of secondary structure are α-helix and random coil.The homolo?goue analysis indicates it has the closest relationship to Glycine max.Conclusion:The CHI cDNA of G.uralensis was successfully cloned and analyzed.And we hope this work will provide a basis for exploring the function of CHI and revealing the molecular regulation mechanisms of liquiritinin biosynthesis in G.uralensis.

    Glycyrrhiza uralensis Fisch.;chalcone isomerase;liquiritinin;clone;polymorphism analysis

    Q943.2

    A

    1009-0002(2017)04-0471-07

    2017-01-12

    北京中醫(yī)藥大學杰出青年人才項目(2016JYBXJQ002)

    馬永生(1993- ),男,碩士研究生,(E-mail)mayscn@126.com

    劉穎,(E-mail)liuyliwd@.sina.com

    10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.013

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