• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    烏拉爾甘草查耳酮異構酶基因多態(tài)性分析

    2017-11-06 01:24:56馬永生張曉冬尹彥超周姍胡婷高智強劉穎
    生物技術通訊 2017年4期
    關鍵詞:異構酶烏拉爾甘草

    馬永生,張曉冬,尹彥超,周姍,胡婷,高智強,劉穎

    北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院,北京 100102

    烏拉爾甘草查耳酮異構酶基因多態(tài)性分析

    馬永生,張曉冬,尹彥超,周姍,胡婷,高智強,劉穎

    北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院,北京 100102

    目的:對烏拉爾甘草黃酮代謝途徑中的關鍵酶查耳酮異構酶(CHI)進行基因克隆及多態(tài)性分析。方法:取5株烏拉爾甘草新鮮根樣,提取RNA并逆轉錄得cDNA,利用特異引物克隆烏拉爾甘草CHI基因,測序并對所得序列進行多態(tài)性分析。結果:共獲得62條全長為690bp的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列,編碼229個氨基酸殘基。多態(tài)性分析顯示62條CHI基因cDNA序列存在47個變異位點,可分為20種不同單倍型(單倍型1~20),其相似度為99.62%;氨基酸序列存在30個變異位點,可分為16種類型(AA1~AA16),一致性為98.99%。CHI基因編碼蛋白為穩(wěn)定性親水蛋白,相對分子質量為24 400,等電點為5.3~6.7,二級結構以α螺旋和無規(guī)卷曲為主。同源性分析顯示,該基因序列與豆科植物大豆的CHI基因親緣性最近。結論:克隆了烏拉爾甘草CHI基因并對其進行了多態(tài)性分析,為進一步探究CHI基因對甘草苷生物合成的分子調(diào)控機制奠定基礎。

    烏拉爾甘草;查耳酮異構酶;甘草苷;基因克隆;多態(tài)性分析

    烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)為豆科甘草屬植物。2015版《中國藥典》規(guī)定栽培甘草的檢測指標為:甘草酸含量不低于2.0%,甘草苷含量不低于0.50%[1],因此甘草苷是評價甘草質量的重要指標之一。大量藥理學研究表明,甘草苷具有抗癌、抗糖尿病、抗病毒、抗抑郁等多種藥理活性[2]。《中國藥典》規(guī)定甘草有3種基原植物,即烏拉爾甘草、光果甘草(G.glabra L.)及脹果甘草(G.inflata Bat.)。本課題組前期對這3種基原甘草進行了4種主要黃酮類化合物的含量分析[3],發(fā)現(xiàn)烏拉爾甘草中甘草苷含量明顯高于其他2種基原植物。因此,對烏拉爾甘草中甘草苷的生物合成途徑開展相關研究,將有助于揭示高甘草苷積累的分子機制。

    多種酶參與甘草苷的生物合成,其中查耳酮異構酶(chalcone isomerase,CHI)催化分子內(nèi)環(huán)化反應,是甘草苷生物合成的關鍵酶之一[4]。1987年,研究者利用抗體技術首次從法國豌豆(Pisum sativum L.)中分離得到CHI基因[5],隨后陸續(xù)從矮牽牛(Petunia hybrida Vilmorin)[6]、菜豆(Phaseo?lus vulgaris L.)[7]、野茶樹(Camellia sinensis K.)[8]等植物中克隆得到該基因。迄今,GenBank數(shù)據(jù)庫中已注冊了1164條植物CHI的DNA序列及278條cDNA序列。有報道顯示,過表達CHI基因的甘草毛狀根中黃酮類化合物的含量明顯提高[9],從而證明了CHI基因對甘草黃酮生物合成的明確影響。然而,CHI基因在同一植物中通常以多拷貝形式存在,關于CHI基因多態(tài)性對黃酮代謝途徑影響的相關研究尚未見諸報道。

    我們對烏拉爾甘草中甘草苷生物合成途徑的關鍵酶基因CHI進行了克隆及多態(tài)性分析,并對其主流單倍型做生物信息學分析,以期為進一步揭示CHI基因多態(tài)性對甘草苷生物合成的影響機制奠定基礎,并為篩選甘草優(yōu)良基因、分子育種、提高栽培甘草質量提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    取5株新鮮烏拉爾甘草主根,立即液氮速凍,-80℃保存?zhèn)溆?。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD-19T載體、ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、M-MLV(Rnase H-)反轉錄試劑盒均購于北京博邁德生物技術有限公司;LA-Taq DNA聚合酶、oligo(dT)購于TaKaRa公司。微量移液器(Eppendorf公司);1-13000型離心機(Sigma公司);DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠);BG-gdsAUTO510型凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司);酶標儀(Biotek Epoch公司)。

    1.2 RNA提取及逆轉錄

    取新鮮烏拉爾甘草主根于液氮中迅速研磨成細粉,取適量用ESPY spin植物RNA快速提取試劑盒逐步提取總RNA,經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性,用酶標儀對所得RNA的D260nm/D280nm值及濃度進行測定,以確定RNA的純度和濃度。用M-MLV反轉錄試劑盒,以oligo(dT)為引物進行逆轉錄。

    1.3 烏拉爾甘草CHI基因擴增及測序

    根據(jù)文獻報道[10],用Primer 5.0設計上游引物GF(5′-ATGGCGGGAGCAGCACCAGTA-3′)、下 游引物 GR(5′-TCAGTTTCCGTTTCCAAT-3′),采用50μL反應體系[包括模板cDNA 2.0μL、10×緩沖液 5.0μL、dNTP(2.5mmol/L)5.0μL、引物 GF和 GR 各 2.0μL(5μmol/L)、LA-Taq 酶 1.0μL、無RNase的水33.0μL]進行PCR(反應程序:95℃預變性2min;95℃變性20s,58℃退火30s,72℃延伸45s,35個循環(huán);72℃延伸5min,4℃保存),經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果,然后對產(chǎn)物進行膠回收純化。將膠回收產(chǎn)物與pMD-19T載體連接,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,涂于含有氨芐西林(Amp,50 mg/L)的LB平板上培養(yǎng),每個樣品隨機挑取20個以上單克隆進行PCR驗證,陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測至飽和。

    1.4 烏拉爾甘草CHI生物信息學分析

    利用DNAMAN對所得CHI序列進行比對分析,利用Editseq將其翻譯成氨基酸序列,通過DNASTAR7.0、ExPASy等分析其二級結構、三級結構及基本理化性質,并通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫查找其他物種的CHI序列,利用MEGA5.1構建系統(tǒng)進化樹。

    2 結果

    2.1 烏拉爾甘草CHI的克隆及序列分析

    共獲得62條長度約為690bp的烏拉爾甘草CHI基因cDNA序列(圖1),與目標條帶長度一致。測序結果顯示,所得62條cDNA序列長度均為690bp。DNAMAN比對結果顯示62條cDNA序列中存在47個變異位點,可確定為20種單倍型(1~20),一致性為99.62%,各單倍型變異位點統(tǒng)計于表1。20種烏拉爾甘草CHI單倍型均編碼229個氨基酸殘基,可確定為16種氨基酸序列類型(AA1~AA16),一致性為 98.99%,存在 30個變異位點,詳見表2。

    表1 20種烏拉爾甘草CHI基因單倍型變異位點統(tǒng)計表

    在GenBank中對20種烏拉爾甘草CHI單倍型進行注冊,序列登錄號及各序列所占比例見表3。在62條烏拉爾甘草CHI cDNA序列中,單倍型3為19條,出現(xiàn)頻率最高(30.7%),為主流單倍型;單倍型3、8、13、18及20編碼相同的氨基酸序列,即AA3,其所占比例可達43.5%,為主流氨基酸序列類型,推測其在甘草苷生物合成中起關鍵作用。

    2.2 烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列理化性質分析

    通過ExPASy在線分析了16種烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列的基本理化性質,結果如表4。烏拉爾甘草CHI編碼蛋白由229個氨基酸殘基組成,相對分子質量為24 400,等電點為5.3~6.7;總平均親水性(GRAVY)均為負值,表明烏拉爾甘草CHI為親水性蛋白;不穩(wěn)定指數(shù)均小于40,表明其為穩(wěn)定性蛋白;半衰期為30h

    圖1 烏拉爾甘草CHI擴增結果

    表2 16種烏拉爾甘草CHI氨基酸序列變異位點統(tǒng)計表

    2.3 烏拉爾甘草CHI的二級結構分析及三級結構預測

    以主流氨基酸序列AA3為目標序列,利用DNASTAR7.0和ExPASy分析其二級結構,結果如圖2,α螺旋占34.06%,β轉角占11.79%,延長鏈占21.40%,無規(guī)卷曲占32.75%。SWISS-MODEL在線預測的AA3三級結構如圖3,表明CHI含有較多的α螺旋和無規(guī)卷曲,與二級結構預測相符。

    2.4 烏拉爾甘草CHI同源性分析

    按照親緣關系遠近,從NCBI數(shù)據(jù)庫中挑選了有代表性的17個物種的CHI氨基酸序列,利用DNAMAN將本研究獲得的16條烏拉爾甘草CHI氨基酸序列與其進行序列比對分析,發(fā)現(xiàn)相似度最高的為豆科植物大豆(Glycine max)(75.55%),相似度最低的為單子葉植物大葉藻(Zostera mari?na L.)(13.28%)。利用 ClustalW1.8和 MAGA5.1,將上述33條CHI氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹(圖4),所有序列聚類可聚為3支,所有豆科植物聚為1支,其他雙子葉植物聚為1支,單子葉植物聚為1支。在豆科植物中,16條烏拉爾甘草CHI氨基酸序列單獨聚為1小支。整體而言,烏拉爾甘草CHI氨基酸序列與大豆在進化關系上相距最近,而與大葉藻和玉米在進化關系上最遠,這與序列比對分析結果相符。

    表3 烏拉爾甘草20種CHI單倍型GenBank登錄號及所占比例

    表4 烏拉爾甘草CHI編碼氨基酸序列理化性質

    圖2 烏拉爾甘草CHI二級結構預測

    圖3 烏拉爾甘草CHI三級結構預測

    3 討論

    甘草作為我國最常用的大宗藥材之一,國內(nèi)外需求量巨大。但由于野生甘草資源匱乏,近年來國務院明令禁止采挖野生甘草,因此栽培甘草已成為商品甘草的主流產(chǎn)品。本課題組前期對來自全國7個甘草主產(chǎn)區(qū)的532株兩年生栽培甘草樣品的調(diào)查研究顯示,栽培甘草中甘草苷的含量差異十分顯著,分布范圍為0.058%~3.43%,且60%左右的栽培甘草中甘草苷的含量難以達到藥典規(guī)定的最低標準,嚴重影響到栽培甘草的質量。而功能基因的多態(tài)性是影響甘草質量的重要分子基礎,因此對甘草黃酮代謝途徑中的關鍵功能基因開展研究,對于提高栽培甘草質量具有深遠意義。

    CHI作為黃酮類化合物生物合成的關鍵酶之一,是第一個被認識的類黃酮生物合成的相關酶。目前,CHI已經(jīng)在矮牽牛[11]、銀杏(Ginkgo bi?loba L.)[12]、百合(Lilium speciosum T.)[13]等多種植物中得到克隆。此外,在一些細菌和真菌中也克隆到CHI基因[14]。本研究共克隆得到62條烏拉爾甘草CHI序列,可分為20種單倍型,其一致性相對較好,為99.62%,主流單倍型為單倍型3,所占比重為30.7%。20種CHI單倍型編碼16條氨基酸序列,一致性為98.99%,主流氨基酸序列類型為AA3,所占比重為43.5%,因此推測AA3在甘草苷的生物合成中起關鍵作用。但是,CHI在不同物種間同源性相對較低,聚類分析顯示同源性相對最近的大豆CHI與本實驗中所得烏拉爾甘草CHI序列的一致性也只有75.55%,因此給同源克隆造成一定的難度。

    植物CHI是否表達及表達量的高低都會影響黃酮含量的變化,如缺乏CHI的玉米突變體,其查耳酮積累下降,導致玉米呈現(xiàn)古銅色[15];通過對黃芩毛狀根CHI基因過表達或基因沉默處理,發(fā)現(xiàn)其黃酮含量相應地增加或減少[16];將紅花CHI轉到擬南芥中過表達,結果表明轉基因擬南芥中黃酮含量比野生型擬南芥高2.3倍[17];此外,還有研究表明,在西紅柿中超量表達矮牽牛CHI,結果導致果皮中黃酮醇含量比對照品高78倍[18]。這些研究在一定程度上說明了CHI在黃酮代謝途徑中的重要性。本研究克隆得到20種甘草CHI單倍型,這將為進一步分析甘草中CHI基因多態(tài)性與甘草苷生物合成的相關性,以及提高栽培甘草中甘草苷的含量奠定基礎。

    圖4 CHI系統(tǒng)進化樹分析

    [1] 中華人民共和國藥典I部[M].北京:化學工業(yè)出版社,2015:86-87.

    [2] 馮月,吳文夫,魏建華,等.甘草酸及甘草苷的提取純化方法和藥理作用研究進展[J].人參研究,2012,24(3):46-50.

    [3] 楊瑞,袁伯川,馬永生,等.3種不同基原甘草中4個主要黃酮類化合物的含量分析[J].藥物分析雜志,2016,10:1729-1736.

    [4] 康亞蘭,裴瑾,蔡文龍,等.藥用植物黃酮類化合物代謝合成途徑及相關功能基因的研究進展[J].中草藥,2014,(9):1336-1341.

    [5] Mehdy M C,Lamb C J.Chalcone isomerase cDNA cloning and mRNA induction by fungal elicitor,wounding and infection.[J].EMBO J,1988,86(1):1527-1533.

    [6] Van Tunen A J,Koes R E,Spelt C E,et al.Cloning of the two chalcone flavanone isomerase genes from Petunia hybrida:coordinate,light-regulated and differ?ential expression of flavonoid genes.[J].EMBO J,1988,7(5):1257-1263.

    [7] Blyden E R,Doerner P W,Lamb C J,et al.Se?quence analysisofa chalcone isomerase cDNA of Phaseolus vulgaris L.[J].Plant Mol Biol,1991,16(1):167-169.

    [8] 馬春雷,趙麗萍,張亞麗,等.茶樹查爾酮異構酶基因克隆及序列分析[J].茶葉科學,2007,27(2):127-132.

    [9] Zhang H C,Liu J M,Lu H Y,et al.Enhanced flavo?noid production in hairy root cultures of Glycyrrhiza uralensis Fisch.by combining the over-expression of chalcone isomerase gene with the elicitation treatment[J].Plant Cell Rep,2009,28(8):1205-1213.

    [10]李建華.烏拉爾甘草黃酮異戊烯基轉移酶研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學院,2014.

    [11]Tunen A J V,Hartman S A,Mur L A,et al.Regula?tion of chalcone flavanone isomerase(CHI)gene expres?sion in Petunia hybrida:the use of alternative promot?ers in corolla,anthers and pollen[J].Plant Mol Biol,1989,12(5):539-551.

    [12]Cheng H,Li L,Cheng S,et al.Molecular cloning and function assay of a chalcone isomerase gene(Gb?CHI)from Ginkgo biloba[J].Plant Cell Rep,2011,30(1):49-62.

    [13]Wiermann R.Chalcone-flavanoneisomeraseactivity and accumulation of phenylpropanoid compounds in an?thers.[J].Planta,1971,102(1):55-60.

    [14]Fischerová I,Repka V,Silhárová K.Bilogical activity of the elicitor released from mycelium of a grapevine isolate of the necrotropic fungus Botrytis cinerea[J].Vi?tis J Grapevine Res,2001,40(4):205-212.

    [15]王晨晨,畢瑋,王娟,等.七彩紅竹查爾酮異構酶基因IhCHI1的克隆與表達分析[J].西部林業(yè)科學,2014,43(2):85-90.

    [16]Park N I,Xu H,Li X,et al.Enhancement of flavone levels through overexpression of chalcone isomerase in hairy root cultures of Scutellaria baicalensis[J].Funct Integr Genomics,2011,11(3):491-496.

    [17]劉秀明,李曉璇,姚娜,等.紅花查耳酮異構酶基因植物表達載體的構建及擬南芥轉化[J].中草藥,2016,47(18):3279-3283.

    [18]Muir S R,Collins G J,Robinson S,et al.Overexpres?sion of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruitcontaining increased levels offlavonols.[J].Nat Biotechnol,2001,19(5):470-474.

    Polymorphism Analysis of Chalcone Isomerase Gene of Glyc?yrrhiza uralensis Fisch.

    MA Yong-Sheng,ZHANG Xiao-Dong,YIN Yan-Chao,ZHOU Shan,HU Ting,GAO Zhi-Qiang,LIU Ying*
    School of Life Science,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100102,China
    *Corresponding author,E-mail:liuyliwd@sina.com

    Objective:To clone and analyze chalcone isomerase(CHI) gene of Glycyrrhiza uralensis Fisch.Meth?ods:RNA was extracted from the fresh root of G.uralensis,cDNA was reversely transcribed,and then CHI was cloned using specific primers.The obtained CHI cDNA sequences were analyzed using bioinformatics.Results:Six?ty-two CHI cDNA sequences with a full length of 690bp were obtained.Forty-seven variable sites were present in these CHI cDNA sequences,and twenty haplotypes were determined,the similarity of which was 99.62%.Thir?ty variable sites were present in the amino acid sequences,and sixteen types were determined,the similarity of which was 98.99%.Bioinformatic analysis shows that G.uralensis CHI cDNA sequence has a complete open read?ing frame,encoding a stable hydrophilic protein with 229 amino acids.Its isoelectric point is between 5.3 and 6.7,molecular weight is about 24.4 kD.Most of secondary structure are α-helix and random coil.The homolo?goue analysis indicates it has the closest relationship to Glycine max.Conclusion:The CHI cDNA of G.uralensis was successfully cloned and analyzed.And we hope this work will provide a basis for exploring the function of CHI and revealing the molecular regulation mechanisms of liquiritinin biosynthesis in G.uralensis.

    Glycyrrhiza uralensis Fisch.;chalcone isomerase;liquiritinin;clone;polymorphism analysis

    Q943.2

    A

    1009-0002(2017)04-0471-07

    2017-01-12

    北京中醫(yī)藥大學杰出青年人才項目(2016JYBXJQ002)

    馬永生(1993- ),男,碩士研究生,(E-mail)mayscn@126.com

    劉穎,(E-mail)liuyliwd@.sina.com

    10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.013

    猜你喜歡
    異構酶烏拉爾甘草
    竟然是甘草惹的禍
    炙甘草湯,適用于哪些病癥
    中老年保健(2021年9期)2021-08-24 03:51:00
    印度合成新型化合物可殺死癌細胞
    祝您健康(2019年7期)2019-07-12 03:11:52
    紅花查爾酮異構酶基因的克隆及表達分析
    烏拉爾甘草種子處理及滴灌肥水試驗初報
    俄陸軍首輛烏拉爾—VV裝甲人員輸送車計劃于2016年生產(chǎn)
    建立NHEJ修復定量體系并檢測拓撲異構酶抑制劑依托泊苷對NHEJ的影響
    中俄資源型城市工業(yè)遺產(chǎn)的保護理念對比——以烏拉爾、大慶地區(qū)為例
    芍藥甘草湯加味治療坐骨神經(jīng)痛42例
    活化條件對固定化葡萄糖異構酶酶活的影響
    青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品一二三| 色94色欧美一区二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲综合色网址| 日韩欧美精品免费久久| 男女午夜视频在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲伊人久久精品综合| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美 日韩 精品 国产| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人精品无人区| 少妇人妻久久综合中文| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久国产欧美日韩av| 欧美激情高清一区二区三区 | 丝袜脚勾引网站| tube8黄色片| 亚洲人成77777在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产男人的电影天堂91| 欧美日韩av久久| 国产色婷婷99| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲精品乱久久久久久| av电影中文网址| 国产精品久久久久久久久免| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 国产片内射在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产男女内射视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 十八禁网站网址无遮挡| 久久这里只有精品19| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品三级大全| 9热在线视频观看99| 日韩视频在线欧美| 最新的欧美精品一区二区| 一级毛片电影观看| 妹子高潮喷水视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 成人国语在线视频| a 毛片基地| 日韩精品免费视频一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 国产在线免费精品| 亚洲av成人精品一二三区| 久久 成人 亚洲| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲在久久综合| 一区在线观看完整版| 天美传媒精品一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 叶爱在线成人免费视频播放| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲一区中文字幕在线| 人妻 亚洲 视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品少妇久久久久久888优播| 如何舔出高潮| 国产精品av久久久久免费| e午夜精品久久久久久久| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美黑人精品巨大| 国产精品无大码| 人人澡人人妻人| 超碰97精品在线观看| 国产精品二区激情视频| 在线观看免费午夜福利视频| 最近手机中文字幕大全| 国产xxxxx性猛交| 满18在线观看网站| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 女性生殖器流出的白浆| 各种免费的搞黄视频| 一本大道久久a久久精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 精品免费久久久久久久清纯 | 97人妻天天添夜夜摸| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产 一区精品| 国产99久久九九免费精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 午夜福利在线免费观看网站| 2018国产大陆天天弄谢| 激情视频va一区二区三区| 国产精品二区激情视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 久久久久网色| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久性视频一级片| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久久亚洲精品成人影院| 丰满乱子伦码专区| 婷婷色av中文字幕| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品国产色婷婷电影| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av在线观看视频网站免费| 久久久久久久久久久久大奶| 黄片无遮挡物在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 精品午夜福利在线看| 青青草视频在线视频观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 999久久久国产精品视频| 久久久精品免费免费高清| 看免费成人av毛片| 亚洲第一区二区三区不卡| 一区二区三区精品91| 亚洲熟女精品中文字幕| 免费不卡黄色视频| 综合色丁香网| www.自偷自拍.com| 欧美xxⅹ黑人| 91老司机精品| 在线观看人妻少妇| 在线观看免费日韩欧美大片| 午夜91福利影院| 国产日韩欧美在线精品| 又大又爽又粗| 久久韩国三级中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久免费观看电影| av卡一久久| 丝袜喷水一区| 久久精品亚洲av国产电影网| 9191精品国产免费久久| 国产色婷婷99| 免费在线观看黄色视频的| av国产久精品久网站免费入址| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜av观看不卡| 久久韩国三级中文字幕| 久久狼人影院| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲国产欧美网| 精品一区二区三卡| 99热国产这里只有精品6| 美国免费a级毛片| 丝袜喷水一区| 久久99精品国语久久久| av电影中文网址| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜老司机福利片| 在线 av 中文字幕| 黄片小视频在线播放| 午夜老司机福利片| 麻豆乱淫一区二区| 女人久久www免费人成看片| 成人国产av品久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品一区二区在线不卡| 波多野结衣av一区二区av| 电影成人av| 久久青草综合色| av在线app专区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 观看美女的网站| 十八禁高潮呻吟视频| 永久免费av网站大全| 国产一区二区 视频在线| 亚洲专区中文字幕在线 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 丰满乱子伦码专区| 久久久久久人妻| 国产免费福利视频在线观看| 人人澡人人妻人| 丁香六月天网| 欧美日韩视频精品一区| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲,欧美,日韩| 色婷婷av一区二区三区视频| 老司机在亚洲福利影院| 99国产综合亚洲精品| 亚洲欧洲日产国产| 伊人久久国产一区二区| 国产黄频视频在线观看| 高清欧美精品videossex| 熟女av电影| 色婷婷av一区二区三区视频| 999精品在线视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 精品一区二区三区av网在线观看 | 午夜老司机福利片| 亚洲三区欧美一区| 高清黄色对白视频在线免费看| av天堂久久9| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日本av免费视频播放| 国产精品久久久久成人av| 亚洲国产精品999| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产熟女欧美一区二区| 国产99久久九九免费精品| 精品一区二区三卡| 亚洲av男天堂| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 黄频高清免费视频| 丁香六月欧美| 亚洲成人国产一区在线观看 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产伦理片在线播放av一区| 少妇的丰满在线观看| 婷婷成人精品国产| 国产成人精品久久久久久| xxxhd国产人妻xxx| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久精品国产a三级三级三级| 1024视频免费在线观看| 在线 av 中文字幕| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产成人av激情在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av | 午夜影院在线不卡| 国产一区二区在线观看av| 少妇人妻精品综合一区二区| av.在线天堂| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | av不卡在线播放| 不卡视频在线观看欧美| 丰满乱子伦码专区| 新久久久久国产一级毛片| 中文欧美无线码| www日本在线高清视频| av有码第一页| 黄片播放在线免费| 亚洲第一av免费看| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品在线美女| 又大又爽又粗| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久热爱精品视频在线9| 午夜福利免费观看在线| 国产av国产精品国产| 赤兔流量卡办理| 国产国语露脸激情在线看| 国产极品天堂在线| 亚洲一区中文字幕在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产一区有黄有色的免费视频| 看非洲黑人一级黄片| 在线免费观看不下载黄p国产| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产成人午夜福利电影在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 国产日韩欧美在线精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 啦啦啦啦在线视频资源| 婷婷色麻豆天堂久久| 亚洲四区av| videosex国产| av国产精品久久久久影院| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av福利一区| 亚洲伊人色综图| 69精品国产乱码久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清黄色对白视频在线免费看| 嫩草影院入口| 成人亚洲精品一区在线观看| 91精品国产国语对白视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 一级黄片播放器| 精品免费久久久久久久清纯 | 午夜福利视频在线观看免费| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲专区中文字幕在线 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产一级毛片在线| 亚洲人成电影观看| 最近的中文字幕免费完整| 免费观看人在逋| 黄色毛片三级朝国网站| 不卡视频在线观看欧美| 校园人妻丝袜中文字幕| 男女床上黄色一级片免费看| 在线观看国产h片| 男女无遮挡免费网站观看| 最新在线观看一区二区三区 | 巨乳人妻的诱惑在线观看| bbb黄色大片| 婷婷色av中文字幕| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人精品久久二区二区91 | 国产成人精品福利久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲第一青青草原| 黑人欧美特级aaaaaa片| 91成人精品电影| 久久久亚洲精品成人影院| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 少妇人妻久久综合中文| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 男女免费视频国产| 最近中文字幕高清免费大全6| 如何舔出高潮| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲五月色婷婷综合| 十八禁网站网址无遮挡| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久网色| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 国产在视频线精品| 国产日韩欧美在线精品| 伊人亚洲综合成人网| 国产一区二区 视频在线| 如何舔出高潮| 国产精品av久久久久免费| 2018国产大陆天天弄谢| 一区二区三区激情视频| 亚洲成色77777| 啦啦啦在线观看免费高清www| 欧美国产精品va在线观看不卡| 考比视频在线观看| 久久99精品国语久久久| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产男女内射视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 宅男免费午夜| bbb黄色大片| www日本在线高清视频| 久久亚洲国产成人精品v| 国产精品一国产av| xxxhd国产人妻xxx| 新久久久久国产一级毛片| 久久人妻熟女aⅴ| 高清av免费在线| 99热全是精品| 欧美人与善性xxx| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产最新在线播放| 午夜影院在线不卡| 午夜福利网站1000一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 老司机在亚洲福利影院| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产精品一国产av| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产野战对白在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品 | av免费观看日本| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 国产野战对白在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 丁香六月天网| 国产av码专区亚洲av| 爱豆传媒免费全集在线观看| av女优亚洲男人天堂| 一级爰片在线观看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 91老司机精品| 另类精品久久| 天天添夜夜摸| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 超色免费av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲精品自拍成人| 搡老乐熟女国产| 婷婷成人精品国产| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 1024香蕉在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕最新亚洲高清| 激情视频va一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 男人操女人黄网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男女午夜视频在线观看| 电影成人av| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 综合色丁香网| 99久久人妻综合| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄片播放在线免费| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人毛片60女人毛片免费| 国产高清国产精品国产三级| 久久久久久人人人人人| 国产熟女欧美一区二区| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 黑丝袜美女国产一区| 多毛熟女@视频| av女优亚洲男人天堂| 欧美变态另类bdsm刘玥| 国产精品av久久久久免费| 日韩精品有码人妻一区| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲视频免费观看视频| 日韩大片免费观看网站| 一级黄片播放器| 女人久久www免费人成看片| 亚洲国产欧美在线一区| 免费黄色在线免费观看| 国产在线视频一区二区| 国产男人的电影天堂91| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲国产欧美在线一区| 高清在线视频一区二区三区| 免费观看a级毛片全部| 午夜激情av网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 欧美日韩成人在线一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 另类亚洲欧美激情| 国产男人的电影天堂91| 一级爰片在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 日韩一区二区三区影片| 国产免费现黄频在线看| 国产精品 欧美亚洲| 丝袜在线中文字幕| 男女免费视频国产| 国产精品一区二区在线不卡| 精品亚洲成a人片在线观看| 十八禁人妻一区二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 精品国产一区二区久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲久久久国产精品| 狂野欧美激情性xxxx| 青春草国产在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 伊人久久国产一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| av国产精品久久久久影院| 精品视频人人做人人爽| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 五月天丁香电影| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美日韩av久久| 国产成人精品在线电影| 女人精品久久久久毛片| 国产精品一二三区在线看| 欧美xxⅹ黑人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩一区二区视频免费看| 精品国产一区二区久久| 国产乱来视频区| 黄频高清免费视频| 一区二区三区四区激情视频| 日韩一区二区视频免费看| 少妇人妻 视频| 久久人人爽人人片av| 久久人妻熟女aⅴ| 国产成人免费无遮挡视频| 久久天堂一区二区三区四区| 日韩伦理黄色片| 少妇 在线观看| 国产免费福利视频在线观看| 高清不卡的av网站| 91成人精品电影| 69精品国产乱码久久久| 亚洲精品第二区| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久久精品精品| 国产又爽黄色视频| 少妇人妻 视频| 亚洲av综合色区一区| 精品福利永久在线观看| 91精品国产国语对白视频| 热99久久久久精品小说推荐| 女人精品久久久久毛片| 黄色 视频免费看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一本大道久久a久久精品| 黄色视频不卡| 中文字幕最新亚洲高清| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | √禁漫天堂资源中文www| 国产野战对白在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 综合色丁香网| 国产午夜精品一二区理论片| 国产97色在线日韩免费| 悠悠久久av| 91国产中文字幕| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 精品国产国语对白av| 欧美黄色片欧美黄色片| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 午夜福利视频在线观看免费| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品久久久久久精品古装| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 国产99久久九九免费精品| av视频免费观看在线观看| 香蕉丝袜av| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 成人漫画全彩无遮挡| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲精品乱久久久久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美精品一区二区免费开放| 日韩一区二区三区影片| 日韩人妻精品一区2区三区| 99久国产av精品国产电影| 丝袜美腿诱惑在线| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在线天堂中文资源库| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 1024香蕉在线观看| 国产亚洲最大av| 日韩一区二区视频免费看| 色综合欧美亚洲国产小说| 少妇精品久久久久久久| av片东京热男人的天堂| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产极品天堂在线| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久国产精品人妻一区二区| 伊人亚洲综合成人网| 国产老妇伦熟女老妇高清| 满18在线观看网站| 国产老妇伦熟女老妇高清| 满18在线观看网站| 国产精品熟女久久久久浪| 免费观看人在逋| 老司机深夜福利视频在线观看 | av不卡在线播放| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 观看美女的网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产男人的电影天堂91| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲精品乱久久久久久| 少妇精品久久久久久久| 少妇人妻久久综合中文| 国产乱人偷精品视频| av片东京热男人的天堂| av在线app专区| 午夜老司机福利片| 老熟女久久久| 精品国产一区二区久久| 久久精品国产a三级三级三级| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 伊人久久大香线蕉亚洲五| av免费观看日本| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本一区二区免费在线视频| 高清在线视频一区二区三区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 色吧在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av免费观看日本| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 99精品久久久久人妻精品| 999久久久国产精品视频| 成人国产麻豆网| 亚洲伊人色综图| 国产麻豆69| 日本91视频免费播放| 一级毛片 在线播放| 亚洲成人免费av在线播放| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| av一本久久久久| 国产伦理片在线播放av一区| 久久热在线av| 亚洲久久久国产精品|