結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293T細(xì)胞中的分泌性表達(dá)

白娜，毛瑩瑩，顏仁和，林明，陳興露，李青青，陳惠瑩，劉軍，李紅衛(wèi)

1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院生物治療研究所，廣東 廣州 510515；2.云南省玉溪市人民醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，云南 玉溪 653100；3.廣州伯尼茲生物科技有限公司，廣東 廣州 510663

結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293T細(xì)胞中的分泌性表達(dá)

白娜1，2，毛瑩瑩1，顏仁和3，林明2，陳興露1，李青青1，陳惠瑩1，劉軍1，李紅衛(wèi)1

1.南方醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院生物治療研究所，廣東 廣州 510515；2.云南省玉溪市人民醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，云南 玉溪 653100；3.廣州伯尼茲生物科技有限公司，廣東 廣州 510663

目的：構(gòu)建含結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白基因的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，高效表達(dá)分泌性38kD蛋白。方法：設(shè)計(jì)合成的結(jié)核分枝桿菌38kD基因被克隆到T載體，然后亞克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0，經(jīng)酶切鑒定正確后，PEI轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入293T細(xì)胞，換不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3d后收集細(xì)胞及上清，采用Western印跡檢測(cè)38kD蛋白的表達(dá)。結(jié)果：酶切結(jié)果顯示，獲得正確的含38kD基因的重組表達(dá)載體；Western印跡結(jié)果顯示表達(dá)載體導(dǎo)入293T細(xì)胞中后能在細(xì)胞及上清中檢測(cè)到38kD蛋白表達(dá)。結(jié)論：構(gòu)建了含重組結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.0-38kD，該載體可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T中高效分泌性表達(dá)38kD蛋白，為結(jié)核病診斷試劑盒研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白；真核表達(dá)載體；分泌表達(dá)；HEK293T細(xì)胞

近年來(lái)由于人口劇增、移民增加、旅游業(yè)發(fā)展、耐藥性產(chǎn)生、人類免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒與貧困等原因，結(jié)核病在全球范圍內(nèi)死灰復(fù)燃，呈回升趨勢(shì)[1-2]。我國(guó)結(jié)核病疫情目前依然很嚴(yán)重，是世界上結(jié)核病高負(fù)擔(dān)第二大國(guó)，僅次于印度[3-4]。結(jié)核桿菌的檢測(cè)方法主要有細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)方法等，前者是結(jié)核病控制、流行病學(xué)調(diào)查和臨床醫(yī)生用于診斷及鑒別診斷結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其耗時(shí)長(zhǎng)，陽(yáng)性率低而受限；分子生物學(xué)技術(shù)雖然檢查快速、靈敏，但也存在對(duì)技術(shù)及人員素質(zhì)要求高、操作復(fù)雜等問(wèn)題；免疫學(xué)診斷方法操作簡(jiǎn)便、快速，便于推廣，且有良好的特異性和敏感性，具有血清學(xué)診斷價(jià)值，成為結(jié)核病診斷的良好輔助方法[5-7]。研究表明，38kD抗原上具有結(jié)核復(fù)合體特異的T淋巴細(xì)胞抗原決定簇，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體和T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，部分對(duì)抗結(jié)核分枝桿菌感染作用[8]。在本研究中，我們利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白基因的表達(dá)載體，并以PEI轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入HEK293T細(xì)胞，高效分泌表達(dá)38kD蛋白，為結(jié)核病診斷試劑盒研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞系HEK293T、表達(dá)載體pcDNA3.0為本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α、報(bào)告基因增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；pcDNA3.0-EGFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；限制性內(nèi)切酶NheⅠ、MluⅠ、EcoRⅤ和DL2000 DNA marker購(gòu)自 TaKaRa公司；Blunting酶、1mmol/L dNTP購(gòu)自New England Biolabs公司；限制性內(nèi)切酶ApaⅠ購(gòu)自Thermo scientific公司；T4DNA連接酶購(gòu)自Roche公司；蛋白marker、質(zhì)?？焖傩√嵩噭┖匈?gòu)自GeneStar公司；瓊脂糖凝膠片段回收試劑盒購(gòu)自Magen生物公司；DNA清潔回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；脫脂奶粉、PVDF膜購(gòu)自Bio-Rad公司；抗6×His單克隆抗體購(gòu)自天根公司；羊抗小鼠IgG-HRP購(gòu)自Solarbio公司；細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清（FBS）、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末購(gòu)自Hyclone公司。

1.2 重組表達(dá)載體pcDNA3.0-38kD的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)結(jié)核分枝桿菌國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株H37Rv（GenBank Accession：AL123456.3）的基因組序列，設(shè)計(jì)合成編碼38kD嵌合蛋白的cDNA片段，序列經(jīng)過(guò)優(yōu)化（http://www.jcat.de）以適于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)（圖1）。

合成的cDNA片段被克隆到T載體獲得重組質(zhì)粒pMD19T-38kD[通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司]，用NheⅠ、MluⅠ雙酶切獲得38kD基因片段約1152bp，進(jìn)行補(bǔ)平、清潔處理；真核表達(dá)載體pcDNA3.0用EcoRⅤ單酶切后去磷酸化處理。將pcDNA3.0酶切回收產(chǎn)物與38kD基因片段用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌，挑過(guò)夜培養(yǎng)的LB平板上的單克隆接種到5mL含100μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，得到重組載體質(zhì)粒pcDNA3.0-38kD。用ApaⅠ酶切pcDNA3.0和重組質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

圖1 結(jié)核分枝桿菌38kD嵌合蛋白cDNA編碼核苷酸序列

1.3 重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞

用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1d胰酶消化、傳代細(xì)胞，鋪于6孔板中，細(xì)胞匯合度約80％時(shí)即可用PEI法將pcDNA3.0-EGFP及pcDNA3.0-38kD重組載體質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染[9-10]。轉(zhuǎn)染24h后將培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后觀察細(xì)胞熒光，判斷轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Western印跡檢測(cè)38kD蛋白的表達(dá)

換液后第3d收集細(xì)胞上清，4℃、13 000r/min離心5min；每孔細(xì)胞用PBS洗滌2次后加入含1％PMSF的RIPA裂解液200μL，冰上裂解30min，收集細(xì)胞黏液于滅菌EP管中，加入50μL 5×還原上樣緩沖液，金屬浴煮沸10min裂解細(xì)胞，4℃、13 000r/min離心 5min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用10％脫脂奶粉液室溫?fù)u床溫和振蕩3h封閉，用1∶5000稀釋的His一抗于4℃孵育過(guò)夜；用1×TBST洗膜4次，每次 7min；用 1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗室溫?fù)u床溫和振蕩孵育 50min，用 1×TBST洗膜4次，每次7min；每張膜加500μL發(fā)光液，暗室中用感光膠片顯色。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白基因重組真核表達(dá)載體的鑒定

pcDNA3.0和pcDNA3.0-38kD的ApaⅠ酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。重組質(zhì)粒pcDNA3.0-38kD第2、10、12號(hào)酶切后獲的的小片段條帶位置與預(yù)期大小相符（正向連接小片段為984bp），表明38kD重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-38kD構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞

分別用pcDNA3.0-EGFP和pcDNA3.0-38kD重組載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48h時(shí)在熒光顯微鏡下觀察，判斷轉(zhuǎn)染效率。pcDNA3.0-EGFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有較強(qiáng)的熒光，pcDNA3.0-38kD轉(zhuǎn)染后細(xì)胞無(wú)熒光，與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功（圖3）。

2.3 Western印跡檢測(cè)38kD蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞24h后，換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基，換液后第3d收取細(xì)胞及上清蛋白，樣品處理后，用Western印跡在細(xì)胞及上清中均可檢測(cè)到38kD蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-EGFP的對(duì)照組沒(méi)有相應(yīng)條帶（圖4）。

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-38kD的單酶切鑒定

圖3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48h的熒光情況

圖4 Western印跡鑒定細(xì)胞及上清中38kD蛋白的表達(dá)

3 討論

結(jié)核病的快速準(zhǔn)確診斷是全球控制結(jié)核病的重要措施。1998年，Cole等分離和鑒定出一些極具輔助診斷潛力的特異性蛋白質(zhì)抗原[11]，為結(jié)核病特異性診斷奠定了基礎(chǔ)。結(jié)核桿菌分泌蛋白38kD的免疫學(xué)活性最強(qiáng)，其用于單項(xiàng)診斷結(jié)核病的效果優(yōu)于其他單一抗原[12-14]。38kD蛋白又名蛋白抗原b（Pab），是一種磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是結(jié)核桿菌分泌較多的抗原，日益成為研究熱點(diǎn)[15]。38kD蛋白屬于分泌蛋白，結(jié)核病患者體內(nèi)抗38kD蛋白的抗體水平較高，是結(jié)核桿菌最主要的免疫原[16]，目前被證明是最有效的單個(gè)血清學(xué)診斷抗原。有關(guān)學(xué)者對(duì)CFP10-ESAT6、38kD、Ag85B和HspX等4種結(jié)核相關(guān)抗原的研究顯示，單一抗原中38kD的診斷性能最佳，特異度和靈敏度均較高[16]。38kD蛋白廣泛用于結(jié)核病的血清學(xué)診斷試驗(yàn)，檢測(cè)的敏感性和特異性均較高[17]。

哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠正確有效地識(shí)別真核蛋白的合成、加工和分泌信號(hào)，識(shí)別并去除基因中的內(nèi)含子，再經(jīng)過(guò)剪切加工成為成熟的mRNA，并準(zhǔn)確地完成糖基化、磷酸化及蛋白水解等翻譯后加工過(guò)程，產(chǎn)生具有生物學(xué)活性，最接近天然蛋白的重組產(chǎn)物[18]。對(duì)比于胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，分泌表達(dá)有眾多優(yōu)勢(shì)：簡(jiǎn)化蛋白產(chǎn)物的檢測(cè)與純化，降低生物處理工藝的復(fù)雜性，減少細(xì)胞相關(guān)蛋白的降解，提高蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)量與質(zhì)量等[19]。

為了使重組結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平、分泌性表達(dá)，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了含小鼠Igk信號(hào)肽38kD嵌合蛋白的cDNA片段，并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.0中，通過(guò)PEI方法導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞HEK293T，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中都能檢測(cè)到38kD蛋白，說(shuō)明構(gòu)建了含結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白的重組真核表達(dá)載體，且能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中高效表達(dá)并分泌到細(xì)胞外。另外，由于嵌合蛋白C端含有6×His標(biāo)簽而可使用鎳柱進(jìn)行純化?？傊?，我們構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白重組真核表達(dá)質(zhì)粒，可將其用于轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞大量生產(chǎn)純化38kD蛋白，從而為結(jié)核病診斷試劑盒研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1] Mwinga A,Fourie P B.Prospects for new tuberculosis treatment in Africa[J].Trop Med Int Health,2004,9（7）:827-832.

[2]吳燕,朱中元.結(jié)核分支桿菌免疫學(xué)診斷抗原的研究進(jìn)展[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2006,6（2）:338-339.

[3] 王黎霞,成詩(shī)明,陳明亭,等.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34（8）:485-508.

[4] 韓洪祥.活動(dòng)性肺結(jié)核密切接觸者發(fā)病影響因素的Me?ta分析[J].黑龍江醫(yī)藥,2016,38（3）:168-170.

[5] 泮結(jié)超,石君帆,丁建祖,等.結(jié)核分枝桿菌融合蛋白ELISA方法檢測(cè)[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2012,28（4）:418-420.

[6] 鄒自英,朱冰,湯雪晴,等.結(jié)核桿菌的細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)方法評(píng)價(jià)[J].四川醫(yī)學(xué),2011,32（5）:756-758.

[7]李常教.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2006,33（11）:2068-2070.

[8] 吳燕,朱中元,王海波.結(jié)核分支桿菌38kD蛋白基因克隆及在大腸桿菌中的表達(dá)[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué),2005,5（9）:1786-1789.

[9] 陳曉,蔣捍東,路新枝,等.一種用磷酸鈣法高效轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞方法的建立[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2005,35（5）:807-810.

[10]Segura I,González M A,Serrano A,et al.High trans?fection efficiency of human umbilical vein endothelial cells using an optimized calcium phosphate method[J].Anal Biochem,2001,296（1）:143-147.

[11]Cole S T,Brosch R,Parkhill J,et al.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from thecom?plete genome sequence[J].Nature,1998,6685（393）:537-544.

[12]Bothamley G H,Rudd R,Festenstein F,et al.Clini?cal value of the measurement of Mycobacterium tuber?culosis specific antibody in pulmonary tuberculosis[J].Thorax,1992,47（4）:270-275.

[13]Wilkinson R J,Zhu X,Wilkinson K A,et al.38 000 MW antigen-specific major histocompatibility complex class I restricted interferon-y-secreting CD8+T cells in healthy contacts of tuberculosis[J]. Immunology,1998,95:585-590.

[14]Andersen P.Effective vaccination of mice against My?cobacterium tuberculosis infection with a soluble mix?ture of secreted mycobacterial proteins[J].Infect Im?mun,1994,62（6）:2536-2544.

[15]趙海,李艷,朱虹.結(jié)核分枝桿菌重要診斷用抗原研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通訊,2009,20（3）:436-438.

[16]林楠.四種結(jié)核分枝桿菌特異蛋白抗原的克隆表達(dá)和血清學(xué)評(píng)價(jià)[D].北京:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心,2014:67.

[17]石磊,陳蘇紅.結(jié)核分枝桿菌抗原及其研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18（11）:1609-1611.

[18]畢永春,張建瓊,利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè),2001,23（5）:299-301.

[19]Choi J H,Lee S Y.Secretory and extracellular produc?tion of recombinant proteins using Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2004,64（5）:625-635.

Construction of Eukaryotic Expression Vector of Mycobacte?rium tuberculosis38kD Protein and its Secretory Expres?sion in HEK293T Cells

BAI Na1,2,MAO Ying-Ying1,YAN Ren-He3,LIN Ming2,CHEN Xing-Lu1,LI Qing-Qing1,CHEN Hui-Ying1,LIU Jun1,LI Hong-Wei1*
1.School of Laboratory Medicine and Biotechnology,Southern Medical University,Guangzhou 510515;2.Department of Nuclear Medicine,Yuxi People's Hospital of Yunnan Province,Yuxi 653100;3.Guangzhou Bioneeds Biotechnology Co.,Ltd,Guangzhou 510663;China.

Objective:To construct a robust expressing vector of Mycobacterium tuberculosis 38kD protein,which is able to induce high efficient and secretory expression of 38kD protein in transfected HEK293T cells.Methods:The 38kD gene of M.tuberculosis was synthesized and cloned to T-vector,and then subcoloned into the pcDNA3.0 vector.The recombinant pcDNA3.0-38kD was verified by enzyme digestion,and then transfected into HEK293T cells by polyethylenemine（PEI）-based transfection.The transfected cells and supernatants were collected separately for the detection of 38kD protein by Western blot after the media were changed to serum-free DMEM media for 3 days.Results:We have obtained a robust M.tuberculosis 38kD protein expressing vector,pcDNA3.0-38kD,which can elicit the expression of high level of 38kD protein in both cell supernatants and lysates in transfectedHEK293T cells.Conclusion:High level of secretory M.tuberculosis 38kD protein was expressed in mammalian cells,and it can be potentially used in the development of serological diagnostic kit for tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis 38kD protein;eukaryotic expression system;secretory expression;HEK293T cells

Q78

A

1009-0002（2017）04-0451-04

2017-02-27

白娜（1984- ），女，檢驗(yàn)技師，碩士研究生，（E-mail）bn_281525013@163.com；毛瑩瑩（1988- ），女，博士，（E-mail）maoyy2011@163.com；二者為并列第一作者

李紅衛(wèi)，（E-mail）hongweil@yahoo.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.009