B型肉毒毒素重組Hc亞單位疫苗的免疫原性研究

陳博陽，周果，師丹陽，周曉巍，余云舟

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

B型肉毒毒素重組Hc亞單位疫苗的免疫原性研究

陳博陽，周果，師丹陽，周曉巍，余云舟

軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100071

目的：用大腸桿菌表達(dá)重組B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc抗原（BHc）作為亞單位疫苗，并研究其免疫原性。方法：構(gòu)建pTIG-Trx-BHc原核表達(dá)載體，用大腸桿菌表達(dá)并純化重組BHc抗原；免疫BALB/c小鼠以研究它的免疫原性。結(jié)果：大腸桿菌表達(dá)并純化獲得了重組BHc抗原，免疫小鼠后能刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗BHc抗體和保護(hù)性免疫反應(yīng)。該重組BHc亞單位疫苗1μg劑量2次免疫小鼠即可產(chǎn)生對104LD50劑量B型肉毒毒素攻毒的完全保護(hù)，血清中和效價(jià)可達(dá)1.33 IU/mL。結(jié)論：大腸桿菌表達(dá)的重組BHc抗原具有良好的免疫原性，能夠有效地保護(hù)小鼠抵抗B型肉毒毒素的攻擊，該BHc抗原能夠作為亞單位候選疫苗預(yù)防B型肉毒毒素中毒。

B型肉毒毒素；重鏈?zhǔn)荏w結(jié)合區(qū)C端片段（Hc）；重組亞單位疫苗；免疫原性

肉毒毒素（botulinum neurotoxins，BoNT），又被稱為肉毒神經(jīng)毒素，是由厭氧的革蘭陽性菌肉毒梭菌（Clostridium botulinum）產(chǎn)生的毒素蛋白，是已知毒性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)，按血清型分為A～G共7個(gè)亞型，其中A、B、E和F型可以導(dǎo)致人類肉毒中毒[1-3]。各亞型肉毒毒素都是具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，如具有內(nèi)肽酶活性，相對分子質(zhì)量（Mr）約150 000，由一條重鏈（HC，Mr約 100 000）和一條輕鏈（LC，Mr約50 000）通過二硫鍵相連[4-5]。對肉毒毒素晶體結(jié)構(gòu)的分析表明，重鏈包含一個(gè)細(xì)胞受體結(jié)合域（HC，負(fù)責(zé)結(jié)合細(xì)胞表面的受體）和一個(gè)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域（HN，負(fù)責(zé)將毒素轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)）；輕鏈能夠靶向到可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（soluble N-ethyl?maleimide sensitive factorattachmentprotein re?ceptor，SNARE），LC將SNARE切割會抑制神經(jīng)遞質(zhì)小泡傳遞，從而抑制神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致肌肉松弛性麻痹[6-8]。

疫苗是預(yù)防肉毒毒素中毒最好的方法，早期的肉毒毒素疫苗研究主要集中在類毒素疫苗，然而后期的研究與應(yīng)用發(fā)現(xiàn)類毒素疫苗在免疫原性、安全性、免疫后副作用等方面存在較大的問題，導(dǎo)致類毒素疫苗一直未能得到廣泛使用。破傷風(fēng)毒素（tetanus neurotoxin，TeNT）和肉毒毒素具有很多相似的結(jié)構(gòu)，因此，研究人員借助于破傷風(fēng)毒素Hc（重鏈?zhǔn)荏w結(jié)合區(qū)C端片段，C-termi?nal fragment of heavy-chain receptor）片段亞單位疫苗研究成功的策略來研制肉毒毒素亞單位疫苗[7]。肉毒毒素的Hc片段能介導(dǎo)毒素特異性結(jié)合到神經(jīng)肌肉接點(diǎn)處的神經(jīng)末梢，此外，Hc片段不存在鋅肽鏈內(nèi)切酶活性，沒有毒性，免疫動物后能刺激產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[9-11]?；谶@一重要發(fā)現(xiàn)，人們開始研究更為安全的Hc片段作為新一代的肉毒毒素疫苗[12]。

肉毒毒素Hc片段能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生很強(qiáng)的保護(hù)性免疫反應(yīng)，其作為新型亞單位疫苗非常具有研究價(jià)值及應(yīng)用前景。Holley等[13]用大腸桿菌表達(dá)的F型肉毒毒素Hc片段免疫小鼠，證明能夠產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，并且能維持長期保護(hù)作用，疫苗接種10個(gè)月后對104LD50的BoNT/F仍具有保護(hù)作用。Liu等[14]利用酵母表達(dá)純化制備了B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc，免疫動物證明其具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)。此外，本實(shí)驗(yàn)室也利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)了A、E和F型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc，并且得到純度很高的蛋白，免疫小鼠后能夠產(chǎn)生十分強(qiáng)大的保護(hù)性免疫反應(yīng)[15-16]。以上研究結(jié)果表明大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)各型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段的高效表達(dá)，使得以大腸桿菌表達(dá)的重組Hc片段作為新型肉毒毒素亞單位疫苗成為可能。在本研究中，我們利用大腸桿菌BL21（DE3）菌株實(shí)現(xiàn)了B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段的可溶性表達(dá)，并且得到了純度較高的重組BHc片段蛋白，通過免疫小鼠，初步評價(jià)了該原核表達(dá)的BHc的免疫原性和保護(hù)效果，為進(jìn)一步研究肉毒毒素亞單位疫苗和研制多價(jià)肉毒毒素疫苗奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c和KM小鼠（SPF級）購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；pABE293-BHc載體（含B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段基因）和pTIG-Trx原核表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞和DNA純化回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司；DNA聚合酶Prime STAR和T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；羊抗鼠IgG-HRP購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgM-HRP購自Santa Cruz公司；IPTG購自Promega公司；Western印跡顯色試劑盒購自Thermo公司；96孔酶聯(lián)板購自Coring公司；引物合成、基因測序由上海生工生物工程股份有限公司完成；其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pABE293-BHc載體為模板，PCR擴(kuò)增得到BHc基因片段，擴(kuò)增時(shí)在片段兩端分別加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，瓊脂糖凝膠電泳后純化回收目的DNA片段。將BHc基因片段和pTIG-Trx載體雙酶切，瓊脂糖電泳后用DNA純化回收試劑盒純化回收，回收產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶于4℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，次日挑取單克隆菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒酶切鑒定，選取陽性克隆測序驗(yàn)證。

1.3 重組BHc片段的表達(dá)和純化

首先將測序驗(yàn)證序列正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化（42℃，45s）大腸桿菌表達(dá)菌株 BL21（DE3），挑取單克隆于 5mL 2×YT培養(yǎng)基（含 100μg/mL氨芐西林）中，37℃搖床（220r/min）培養(yǎng)至菌液D600nm為0.6～1.0，按 1％的比例轉(zhuǎn)接至 400mL 2×YT培養(yǎng)基（含100μg/mL氨芐西林）中，37℃搖床（220r/min）培養(yǎng)至菌液 D600nm為 0.6～1.0，加入0.2mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)（30℃表達(dá)4～5h），8000r/min離心30min收集菌體沉淀，用20mmol/L的PB緩沖液（pH8.0）重懸菌體，用超聲細(xì)胞粉碎儀對菌懸液在冰水浴條件下進(jìn)行超聲波破碎，超聲完全后10000r/min離心20min，收集上清用0.45μm的濾膜過濾，過濾后的上清和HisTrap HP蛋白純化柱（GE公司）結(jié)合，之后用A液（20mmol/L PB緩沖液，pH8.0）平衡，然后用不同濃度的B液（20mmol/L PB緩沖液，500mmol/L咪唑，pH8.0）洗脫并收集蛋白，SDS-PAGE檢測純化結(jié)果。

1.4 Western印跡檢測目的蛋白

純化后的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE初步鑒定后，用Western印跡進(jìn)一步鑒定。目的蛋白電泳結(jié)束后，按照下層濾紙、PVDF膜、膠、上層濾紙的順序依次置于轉(zhuǎn)膜儀上，將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（600 mA，25min），用5％脫脂牛奶室溫封閉2h，一抗（抗BHc血清抗體）1∶1000稀釋室溫孵育 2h，TBS-T（8.0g/L NaCl，0.2g/L KCl，3.0g/L Tris，0.1％Tween-20，pH7.4）洗膜，二抗（羊抗鼠IgG-HRP）1∶5000稀釋室溫孵育30min，TBS-T洗膜，用Western印跡顯色液在成像儀中曝光顯影。

1.5 重組亞單位疫苗免疫動物

6～8周齡的SPF級雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成3組，即 10μg組、1μg組和陰性對照組，每組 10只。將重組BHc亞單位疫苗用無菌PBS分別稀釋至100和10μg/mL，并在配制疫苗時(shí)加入1/10體積的鋁佐劑（10 mg/mL），采用肌內(nèi)注射方式，注射體積100μL。免疫2周后剪尾采血，分離血清用于抗體免疫反應(yīng)檢測，之后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫方案不變。

1.6 重組亞單位疫苗免疫后抗體水平、滴度和亞型測定

用原核表達(dá)的BHc抗原包被96孔酶聯(lián)板，碳酸鹽包被緩沖液稀釋抗原使其濃度為2μg/mL，每孔加入100μL，4℃過夜；用 0.01mmol/L 的PBS-T（8.0g/L NaCl，0.2g/L KCl，1.44g/L 無水Na2HPO4，0.24 g/L KH2PO4，0.05％ Tween-20，pH7.4）洗板6次；每孔加入200μL 2％的BSA封閉液在37℃恒溫箱中孵育2h；每孔加入100μL 1∶100稀釋的小鼠血清（測定抗體滴度和亞型的血清先1∶100稀釋，然后1/4梯度稀釋），37℃恒溫箱中孵育2h；用PBS-T洗板6次，加入1∶2000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP（或羊抗鼠IgG1/IgG2a/IgG2b/IgG3/IgM-HRP），37℃恒溫箱中孵育30min；用PBS-T洗板6次，加入新配制的ELISA顯色液（240mmol/L檸檬酸，50mmol/L Na2HPO4，0.4 mg/mL OPD，0.1％的 H2O2）50μL/孔，避光顯色 10min左右；加入終止液（2 mol/L H2SO4）50μL/孔終止顯色，用酶標(biāo)儀讀取D492nm/D630nm值。終末稀釋ELISA法計(jì)算小鼠血清中能特異性和BHc結(jié)合的抗體滴度，以D492nm≥0.3為陽性結(jié)果，免疫組小鼠血清抗體水平以單個(gè)血清樣品的平均值來表示。

1.7 免疫后小鼠血清中和活性和中和效價(jià)測定

將毒素稀釋至100 LD50/mL，每管加入1mL（每組5管），然后再依次加入不同劑量的2次免疫后的小鼠血清，最后用稀釋液補(bǔ)齊至終體積為2.5mL，將毒素和抗體混合均勻，于37℃溫箱中孵育15min，使毒素和抗體充分反應(yīng)，然后對KM小鼠進(jìn)行腹腔注射，每組4只小鼠，每只注射500μL，注射12h后觀察小鼠存活情況，每隔24h觀察一次，共觀察1周。

1.8 B型肉毒毒素保護(hù)性試驗(yàn)

對2次免疫2周后的小鼠分別用103和104LD50的B型肉毒毒素攻擊。將毒素稀釋到2×103LD50/mL或2×104LD50/mL濃度，然后每只小鼠注射500μL，攻毒12h后觀察小鼠存活情況，每隔24h觀察一次，共觀察1周，計(jì)算最終的小鼠存活率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，以單因素方差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，對于配對實(shí)驗(yàn)采用Stu?dent-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 pTIG-Trx-BHc表達(dá)載體的構(gòu)建

利用PCR從pABE293-BHc載體上擴(kuò)增全長的BHc基因（1317bp），并在兩端加入多克隆位點(diǎn)BamHⅠ和XhoⅠ。構(gòu)建完成后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖1），對鑒定正確的載體測序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)構(gòu)建的抗原序列與預(yù)期一致。

2.2 重組BHc片段在大腸桿菌的表達(dá)與純化

將pTIG-Trx-BHc表達(dá)載體轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌株BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用超聲波細(xì)胞粉碎儀對菌體沉淀進(jìn)行破碎，然后離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2，表達(dá)的目的蛋白BHc主要以可溶性方式存在于破菌上清中，Mr約為50 000，而空載體的破菌上清在同樣位置未出現(xiàn)表達(dá)條帶，說明誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物為特異性表達(dá)。用HisTrap HP蛋白純化柱對重組BHc蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE檢測（圖2），純化到的目的蛋白大小正確，純度達(dá)電泳級。West?ern印跡檢測（圖2）證實(shí)該重組BHc能特異性和抗BHc血清抗體結(jié)合，具有特異的結(jié)合活性。

圖2 目的蛋白表達(dá)后的SDS-PAGE和Western印跡鑒定圖

2.3 重組亞單位疫苗免疫小鼠后體液免疫反應(yīng)的測定

通過ELISA測定小鼠免疫后的體液免疫反應(yīng)，結(jié)果如圖3。雖然2組小鼠在初次免疫后產(chǎn)生的抗體水平都相對不高，且無明顯差異（P＞0.05），但加強(qiáng)免疫后抗體水平迅速增強(qiáng)，10μg組和1μg組的抗體水平相對于初次免疫有很明顯的提高，抗體水平差異明顯（P＜0.001）；此外，10μg組加強(qiáng)免疫后的抗體水平相對于1μg組也具有較大的差異（P＜0.05）。抗體滴度測定結(jié)果表明（圖4），初次免疫后10μg組和1μg組的血清抗體滴度均較低，加強(qiáng)免疫后抗體滴度明顯增強(qiáng)，平均抗體滴度分別為1∶110 000和1∶80 000，最高抗體滴度可達(dá)1∶150 000左右，相對于初次免疫明顯增強(qiáng)（P＜0.001），而且免疫10μg組的抗體滴度相對于免疫1μg組也有較大的增強(qiáng)（P＜0.05）。這些結(jié)果初步表明該原核表達(dá)的抗原BHc具有良好的免疫原性，作為亞單位疫苗免疫能刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)，并且在加強(qiáng)免疫后抗體滴度達(dá)到很高的水平，而這種特異性抗體的產(chǎn)生在對B型肉毒毒素的保護(hù)過程中起著至關(guān)重要的作用。

圖3 重組亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生特異性抗體水平

圖4 重組亞單位疫苗免疫小鼠后的抗體滴度

對免疫后小鼠產(chǎn)生的抗體亞類的測定結(jié)果表明（圖5），小鼠產(chǎn)生的特異性抗體主要為IgG1，同時(shí)也有較多的IgG2b，IgG2a的數(shù)量極少，IgG1/IgG2a的比值可達(dá)20，證明疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體主要來源于Th2型免疫應(yīng)答途徑。

2.4 小鼠血清的中和抗體活性和中和效價(jià)檢測

小鼠血清中和抗體測定結(jié)果表明10μg組和1μg組血清均可對小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，而陰性對照組小鼠無一幸存，證明該重組亞單位疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生的抗體具有較強(qiáng)的中和活性，能夠中和B型肉毒毒素的毒性。通過對中和實(shí)驗(yàn)的結(jié)果估算，10μg組和1μg組小鼠血清的中和效價(jià)分別為3.33和1.33 IU/mL（表1）。

2.5 重組亞單位疫苗免疫小鼠后對BoNT/B的保護(hù)作用

用B型肉毒毒素對2次免疫后的小鼠進(jìn)行103LD50劑量攻擊，結(jié)果表明（表1）10μg和1μg劑量免疫后均能夠完全保護(hù)，提高攻毒劑量至104LD50后仍能夠完全保護(hù)。這些結(jié)果表明該原核表達(dá)純化的重組BHc亞單位疫苗具有良好的免疫原性和保護(hù)效果，可以作為候選疫苗進(jìn)行更深層次的研究，尤其是為多價(jià)肉毒毒素疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段能特異性結(jié)合到神經(jīng)肌肉接點(diǎn)處的神經(jīng)末梢細(xì)胞膜上，然后在HN片段的作用下將毒素轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)發(fā)揮作用。此外，Hc片段不存在鋅肽鏈內(nèi)切酶活性，沒有毒性，免疫動物后能刺激產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)[9-11]。基于這些研究背景，以肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc為靶標(biāo)研制新型肉毒毒素亞單位疫苗，成為肉毒毒素疫苗研制的新方向。因此，科研人員開始研究用大腸桿菌或酵母表達(dá)肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段。雖然利用酵母表達(dá)系統(tǒng)提高了可溶性蛋白的表達(dá)量，并且分泌性表達(dá)可降低純化難度，但原核表達(dá)系統(tǒng)相對于酵母表達(dá)系統(tǒng)具有一定的優(yōu)勢，如表達(dá)工藝簡單、成本低廉。最重要的還有免疫原性的差異，酵母屬于真核生物，能夠?qū)Ψg后的抗原進(jìn)行糖基化修飾，糖基化抗原的免疫原性會降低；而大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物則不存在糖基化修飾，且其表達(dá)產(chǎn)物和肉毒梭菌一致，同為原核表達(dá)產(chǎn)物，可能更接近天然的表達(dá)產(chǎn)物的構(gòu)象[14,17-18]。因此，為了獲得更為有效的B型肉毒毒素亞單位疫苗，我們更傾向于對大腸桿菌表達(dá)的重組BHc片段進(jìn)行研究，提高可溶性蛋白的表達(dá)量及免疫原性。

表1 重組亞單位疫苗免疫小鼠2次后保護(hù)性試驗(yàn)和中和效價(jià)測定

圖5 重組亞單位疫苗免疫小鼠后抗體亞型測定

在本研究中，利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了能表達(dá)B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)Hc片段的原核表達(dá)載體pTIG-Trx-BHc，并且實(shí)現(xiàn)了BHc在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，通過HisTrap HP蛋白純化柱純化到了純度較高、穩(wěn)定性良好的重組BHc抗原。通過Western印跡對純化的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明抗BHc血清抗體能特異性地結(jié)合該重組BHc片段蛋白，提示該蛋白可能具有天然的B型肉毒毒素受體結(jié)合區(qū)構(gòu)象。通過免疫小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究該原核表達(dá)的BHc的免疫原性，結(jié)果表明該重組BHc亞單位疫苗免疫小鼠后能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的抗體反應(yīng)，最高滴度達(dá)1∶150 000，且其血清中的抗體具有良好的中和活性，中和效價(jià)可達(dá)3.33 IU/mL。攻毒試驗(yàn)也證明該重組BHc亞單位疫苗具有十分強(qiáng)大的保護(hù)效果，1μg劑量免疫2次就能對104LD50的B型肉毒毒素產(chǎn)生完全保護(hù)作用?？贵w亞型測定結(jié)果表明，該重組BHc亞單位疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要以IgG1和IgG2b為主，IgG2a含量極少，證明疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體主要來源于Th2型免疫應(yīng)答途徑，Th2型免疫應(yīng)答主要刺激機(jī)體的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，這種以Th2型免疫應(yīng)答為主的特點(diǎn)能夠產(chǎn)生較多的有效抗體，在抵抗毒素的攻擊過程中具有極其重要的意義。后續(xù)，還要對該重組BHc亞單位疫苗進(jìn)行深入研究，以獲取更為詳盡的數(shù)據(jù)，為B型肉毒毒素亞單位疫苗的研制提供可靠依據(jù)。同時(shí)，本研究也為肉毒毒素多價(jià)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

[1] Smith L A,Rusnak J M.Botulinum neurotoxin vac?cines:past,present,and future[J].Crit Rev Immunol,2007,27（4）:303-318.

[2] Dembek Z F,Smith L A,Rusnak J M.Botulism:cause,effects,diagnosis,clinical and laboratory identi?fication,and treatment modalities[J].Disaster Med Pub?lic Health Prep,2007,1（2）:122-134.

[3] Schiavo G,Matteoli M,Montecucco C.Neurotoxins af?fecting neuroexocytosis[J].Physiol Rev,2000,80（2）:717.

[4] Smith L A,Barrett A D T,Lu S,et al.Botulism and vaccines forits prevention[J].Vaccine,2009,27（47）:D33-D39.

[5] Turton K,Chaddock J A,Acharya K R.Botulinum and tetanus neurotoxins:structure,function and thera?peutic utility[J].Trends Biochem Sci,2002,27（11）:552-558.

[6] Shukla H D,Sharma S K.Clostridium botulinum:a bug with beauty and weapon[J].Crit Rev Microbiol,2005,31（1）:11.

[7] Matak I,Lackovic'Z.Botulinum toxin A,brain and pain[J].Prog Neurobiol,2014,119-120（5）:39-59.

[8] Rummel A,Bade S,Alves J,et al.Two carbohydrate binding sites in the H（CC）-domain of tetanus neurotox?in are required for toxicity[J].J Mol Biol,2003,326（3）:835-847.

[9] Lapenotiere H F,Clayton M A,Middlebrook J L.Ex?pression of alarge,nontoxicfragment of botulinum neurotoxin serotype A and its use as an immunogen[J].Toxicon,1995,33（10）:1383.

[10]Atassi M Z.Basic immunological aspects of botulinum toxin therapy[J].Mov Disord,2004,19（S8）:S68.

[11]Villaflores O B,Hsei C M,Teng C Y,et al.Easy ex?pression of the C-terminal heavy chain domain of bot?ulinum neurotoxin serotype A as a vaccine candidate using a bi-cistronic baculovirus system[J].J Virol Methods,2013,189（1）:58.

[12]Keller J E.Characterization of new formalin-detoxified botulinum neurotoxin toxoids[J].Clin Vaccine Immu?nol,2008,15（15）:1374-1379.

[13]Holley J L,Elmore M,Mauchline M,et al.Cloning,expression and evaluation of a recombinant sub-unit vaccine againstClostridium botulinum,type F toxin[J].Vaccine,2000,19（2-3）:288-297.

[14]Liu B,Shi D Y,Chang S H,et al.Characterization and immunological activity of different forms of recom?binant secreted Hc of botulinum neurotoxin serotype B products expressed in yeast[J].Sci Rep,2015,5（13）:7678.

[15]Yu Y Z,Li N,Zhu H Q,et al.The recombinant Hc subunit of Clostridium botulinum,neurotoxin serotype A is an effective botulism vaccine candidate[J].Vac?cine,2009,27（21）:2816-2822.

[16]Yu Y Z,Zhang S M,Ma Y,et al.Development and evaluation of candidate vaccine and antitoxin against botulinum neurotoxin serotype F[J]. Clin Immunol,2010,137（2）:271-280.

[17]Moreira G M,Cunha C E,Salvarani F M,et al.Pro?duction of recombinant botulism antigens:a review of expression systems[J].Anaerobe,2014,28:130-136.

[18]Gurkan C,Ellar D J.Recombinant production of bacte?rial toxins and their derivatives in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Microb Cell Fact,2005,4（1）:33.

Study on the Immunogenicity of Recombinant Hc Subunit Vaccine of Botulinum Neurotoxin Serotype B

CHEN Bo-Yang,ZHOU Guo,SHI Dan-Yang,ZHOU Xiao-Wei*,YU Yun-Zhou*
Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071,China
*Co-corresponding authors,YU Yun-Zhou,E-mail:yunzhouyu@163.com;ZHOU Xiao-Wei,E-mail:amms832@126.com

Objective:The recombinant Hc domain antigen of botulinum neurotoxin serotype B（BoNT/B） was ex?pressed in Escherichia coli as a subunit vaccine,and its immunogenicity was studied.Methods:The prokaryotic expression vector pTIG-Trx-BHc was constructed,recombinant antigen BHc was expressed in E.coli and purified.BALB/c mice were immunized to study its immunogenicity.Results:The recombinant BHc antigen protein was suc?cessfully expressed and purified from E.coli and could stimulate the body to produce high titers of anti-BHc anti?bodies,and induce protective immune responses in immunized mice.The recombinant BHc subunit vaccine provid?ed complete protection against challenge with 104LD50of BoNT/B only after 1μg of two doses immunization,and serum neutralization titers reached 1.33 IU/mL.Conclusion:These findings suggest that the recombinant BHc anti?gen expressed in E.coli is efficacious in protecting mice against challenge with BoNT/B and that the recombinant BHc subunit vaccine may be a subunit candidate vaccine for prophylaxis against BoNT/B.

botulinum neurotoxin serotype B;C-terminal fragment of heavy-chain receptor（Hc）;recombinant subunit vaccine;immunogenicity

R392.1;Q78

A

1009-0002（2017）04-0435-06

2017-03-09

陳博陽（1991- ），男，碩士研究生，（E-mail）chenboyang1991@163.com

余云舟，（E-mail）yunzhouyu@163.com；周曉巍，（E-mail）amms832@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.006