長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)與乳腺癌多藥耐藥患者放療敏感性的相關(guān)性

邱 楊 張懷文 駱 萍 鐘曉鳴

長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)與乳腺癌多藥耐藥患者放療敏感性的相關(guān)性

邱 楊 張懷文 駱 萍 鐘曉鳴

目的探究長(zhǎng)非編碼RNA與乳腺癌多藥耐藥患者放療敏感性的相關(guān)性。方法BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7共5種人乳腺癌細(xì)胞株，采用細(xì)胞梯度照光細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)5種細(xì)胞株的存活分?jǐn)?shù)(SF)。采用高通量lncRNA芯片篩選BS517、BS524、BS525-1590細(xì)胞株表達(dá)量較高的lncRNA，并分析lncRNA與放療抵抗性的相關(guān)性。結(jié)果各細(xì)胞經(jīng)梯度照光后，各細(xì)胞株的SF值大小排列(由大到小)依次為BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7，該順序同樣由高到低地反映出各細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性；R05532、NR-015441、NR-033374 3種lncRNA在細(xì)胞系中表達(dá)明顯較高；R05532、NR-015441、NR-033374 3種lncRNA的表達(dá)水平與細(xì)胞放療抵抗性呈正相關(guān)，其γ值分別為0.931、0.926、0.928，且P<0.05；AA745020的表達(dá)水平與細(xì)胞放療抵抗性無(wú)明顯的相關(guān)性，γ=0.416，P>0.05。結(jié)論R05532、NR-015441、NR-033374 3種lncRNA在人乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且當(dāng)其高表達(dá)時(shí)呈現(xiàn)的放療抵抗性最高，這3種lncRNA高表達(dá)時(shí)可作為放療抵抗的預(yù)測(cè)分子。

乳腺癌；長(zhǎng)鏈非編碼RNA；放療敏感性；高通量lncRNA

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1416～1419)

目前治療乳腺癌主要手段是手術(shù)、放療和化療，由于乳腺癌組織與周圍組織的粘連固定等原因，目前放療已成治療的主要手段，經(jīng)放療可提高手術(shù)的切除率，并降低其復(fù)發(fā)率。然而患者對(duì)術(shù)前放療的敏感性不同，因此放療效果也不盡相同[1-4]。人類約有90%RNA不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，且有1/3的基因受到非編碼RNA的調(diào)控。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)可以參與調(diào)控上游分子，能夠在表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控3個(gè)方面對(duì)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。相關(guān)研究表明，lncRNA對(duì)于放療相關(guān)的信號(hào)通路及效應(yīng)分子的調(diào)控具有重大意義，因此篩查對(duì)放療敏感的lncRNA對(duì)提高放療療效意義深遠(yuǎn)[5-7]。本研究采用lncRNA芯片篩選放療敏感的lncRNA，檢測(cè)其在不同人乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)量，并分析其與放療的抵抗關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細(xì)胞株BS517(MDA-MB-435S)、BS524(T47D)、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；RNA提取試劑盒Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen生物公司；熒光定量SYBR Green和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；實(shí)時(shí)定量PCR引物由上海Invitrogen合成。實(shí)驗(yàn)儀器：ABI Real Time PCR擴(kuò)增儀；6 MV直線加速器(美國(guó)Varian)；LightCycle(Roche Diagonstics公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇人乳腺癌細(xì)胞株BS517(MDA-MB-435S)、BS524(T47D)、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基：10%FBS+1% 100×青鏈霉素溶液+DMEM，于細(xì)胞生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞放療敏感性檢測(cè) 采用醫(yī)用6 MV直線加速器(美國(guó)Varian)檢測(cè)細(xì)胞放療敏感性，將1.5 cm等效蠟板置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶上，源波距100 cm，設(shè)置Gy劑量照光梯度為0、2、4、6、8，劑量率為400 cGy/min?？寺⌒纬陕?PE)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)=照射組PE/對(duì)照組PE×100%。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次取平均值。

1.2.3 lncRNA 芯片的制備 提取BS517、BS524、BS525-1590放療敏感性差異大的細(xì)胞株RNA制備cDNA樣本。采用高通量lncRNA芯片(美國(guó)Arraystar公司)，于標(biāo)準(zhǔn)條件下，將標(biāo)記好的探針和高密度基因組芯片雜交，采用芯片掃描儀(Gene Pix)檢測(cè)芯片熒光強(qiáng)度。

1.2.4 lncRNA的篩選 選取表達(dá)量較高的lncRNA，再經(jīng)UCSC基因數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)序列進(jìn)行排查，確定4條序列全長(zhǎng)明確的非編碼RNA，分別為R05532(chr8:114557150-115165825)、NR-015441(chr16:2653385-26804095)、NR-033374(chr9:130873450-130881013)、AA745020(chr8:114557150-115165825)。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR提取 BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7的RNA，特異性轉(zhuǎn)錄lncRNA為cDNA，采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞lncRNA的表達(dá)水平，檢測(cè)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)40。采用GAPDH作為內(nèi)參，引物序列如下：R05532：上游：5’GCATAGGATGTGCCAACAA3’，下游：5’GTGACCTGAAGTTCCCCATT-3’；NR-033374：上游：5’GCTGGGATTACAGGTGTGAG3’，下游5’CAAAGGTTCGTGGTGGTT3’；NR-033374：上游5’CCCATTCGGTTGCTGAGTAG3’，下游5’TCACAGAGGCTTCATTTGTAA 3’；AA745020：上游5’ CCAAGGTTTCCGAAGACAAT3’，下游5’ AGGGTGATGCCAGGTTCTA3’；GAPDH：上游5’ GGGAAACTGTGGCCTGAT3’，下游5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’。采用2-△△CT計(jì)算RNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各細(xì)胞株對(duì)放療敏感性的檢測(cè)

各細(xì)胞經(jīng)梯度照光后，各細(xì)胞株的SF值根據(jù)大小排列(由大到小)依次為BS517(0.82±0.02)、BS524(0.67±0.01)、BS525-1590(0.59±0.03)、SKBR-3(0.42±0.01)、MCF-7(0.030±0.01)，該順序同樣由高到低地反映出各細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性。

2.2 各細(xì)胞株表達(dá)lncRNA水平的比較

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均經(jīng)3次重復(fù)取平均值所得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，R05532、NR-015441、NR-033374 3種lncRNA在細(xì)胞系中表達(dá)明顯較高。見(jiàn)表1，圖1～3。

表1 各細(xì)胞株表達(dá)lncRNA水平的比較

2.3 lncRNA與細(xì)胞放療抵抗的關(guān)系

細(xì)胞放療抵抗性與R05532、NR-015441、NR-033374 的lncRNA表達(dá)水平呈正相關(guān)，其γ值分別為0.931、0.926、0.928，且P<0.05；與AA745020的表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性，γ=0.416，P>0.05。見(jiàn)圖4。

圖1 各細(xì)胞株中RO5532相對(duì)表達(dá)量

圖2 各細(xì)胞株中NR-05441相對(duì)表達(dá)量

圖3 各細(xì)胞株中NR-033374相對(duì)表達(dá)量

圖4 各細(xì)胞株與放療抵抗性的關(guān)系

3 討論

在手術(shù)治療乳腺癌前，多采用放療進(jìn)行輔助治療，如果患者對(duì)放療敏感性較高，則放療可以有效降低腫瘤體積，提高手術(shù)的切除率，同時(shí)降低復(fù)發(fā)率，顯著延長(zhǎng)患者的生存期。如果患者對(duì)放療敏感性較低，則放療作用不明顯，手術(shù)治療的難度大大增加，術(shù)后復(fù)發(fā)的幾率也隨之提高。因此，患者對(duì)放療的個(gè)體差異顯著影響治療的成功率，如何提高患者對(duì)放療的敏感性是目前研究的主要目標(biāo)。

lncRNA是位于真核細(xì)胞中的非編碼RNA，研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物的基因組序列中，有4%～9%是非編碼RNA，其量大大超過(guò)編碼RNA。雖然非編碼RNA不能夠轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)，但是其具有重要的生物學(xué)意義。lncRNA能夠參與X染色體的沉默、基因組印記、修飾染色質(zhì)，對(duì)于編碼基因的轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾及核內(nèi)運(yùn)輸都具有重要的作用。此外，lncRNA內(nèi)部含有類似于啟動(dòng)子的關(guān)鍵序列，具有更為敏感的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)具備順式調(diào)控作用和反式調(diào)控作用。但是目前大多數(shù)lncRNA的調(diào)控作用尚不清楚，但是諸多的研究表明，lncRNA參與了機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等生理和病理過(guò)程，并在其中扮演著重要的調(diào)控作用[8]。且相關(guān)報(bào)道表明lncRNA與腫瘤的關(guān)系密切，其可以調(diào)控DNA損傷的應(yīng)答通路，DNA損傷應(yīng)答使得腫瘤細(xì)胞在活性氧、化療、電離輻射等條件下保持基因組的完整，因此DNA損傷應(yīng)答是抗腫瘤的阻礙[9-10]。據(jù)此，我們推測(cè)，lncRNA可能參與放療敏感性的調(diào)節(jié)。本研究采用lncRNA芯片篩選放療敏感的lncRNA，檢測(cè)其在不同人乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)量，并分析不同lncRNA的表達(dá)和放療敏感性的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各細(xì)胞經(jīng)梯度照光后，檢測(cè)各細(xì)胞株的SF值，根據(jù)SF值的大小排列(由大到小)依次為BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7，該順序同樣由高到底地反映出各細(xì)胞株對(duì)放療的敏感性；R05532、NR-015441、NR-0333743種lncRNA在細(xì)胞系中表達(dá)明顯較高；R05532、NR-015441、NR-0333743種lncRNA的表達(dá)水平與細(xì)胞放療抵抗性呈正相關(guān)，其γ值分別為0.931、0.926、0.928，且P<0.05；AA745020的表達(dá)水平與細(xì)胞放療抵抗性無(wú)明顯的相關(guān)性，γ=0.416，P>0.05。

綜上所述，lncRNA確實(shí)和放療敏感性相關(guān)，且其表達(dá)量和放療抵抗呈正相關(guān)，因此可作為放療敏感性的預(yù)測(cè)因子，為今后的放療提供參考。

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(編輯：甘艷)

CorrelationbetweenLongNoncodingRNA(lncRNA)andRadiotherapySensitivityinMultidrugResistantBreastCancerPatients

QIUYang,ZHANGHuaiwen,LUOPing,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang，330029

ObjectiveTo study the correlation between long noncoding RNA (lncRNA) and radiotherapy sensitivity of multidrug resistance in breast cancer.Methods5 kinds of human breast cancer cell lines of BS517,BS524,BS525-1590,SKBR-3 and MCF-7 were used to detect the survival fraction (SF) by cell gradient photographers.Long noncoding RNA (lncRNA) with high expression of BS517,BS524 and BS525-1590 were screened by high-throughput lncRNA chip,and the correlation between lncRNA and radiotherapy resistance was analyzed.ResultsAfter the cells were irradiated with gradient,the SF values of each cell line were in the order of BS517,BS524,BS525-1590,SKBR-3 and MCF-7,which was also reflected resistance to radio-therapy from high to low.The expression of 3 kinds of lncRNA likes R05532,NR-015441,NR-031374 in the cell lines was significantly higher than others.The expression levels of R05532,NR-015441 and NR-033374 were positively correlated with the radiotherapy resistance (γ=0.931，γ=0.926,γ=0.928),(P<0.05).There was no significant correlation between AA745020 expression level and cell radioactivity resistance,γ=0.416,P>0.05.ConclusionThree kinds of lncRNA such as R05532,NR-015441 and NR-033374 are highly expressed in human breast cancer cells and have the highest resistance to radiotherapy when they are highly expressed.These 3 genes can be used as predictors of radiation resistance.

Breast cancer;Long noncoding RNA;Radiotherapy sensitivity;High-throughput lncRNA

330029 江西省腫瘤醫(yī)院(邱 楊，張懷文，鐘曉鳴)；330009 江西省南昌市第三醫(yī)院(駱 萍)

鐘曉鳴

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.006

R737.9

A

1001-5930(2017)09-1416-04

2016-09-22

2017-03-09)