醫(yī)療器械溶血性能評價方法-NIH法的直接接觸法和間接接觸法比較

喬春霞 屈秋錦 趙增琳 侯麗 楊婧 董秀麗

1 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心；山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室 （山東 濟南 250101）2 山東恒信檢測技術(shù)開發(fā)中心 （山東 濟南 250101）

醫(yī)療器械溶血性能評價方法-NIH法的直接接觸法和間接接觸法比較

喬春霞1屈秋錦2趙增琳2侯麗1楊婧2董秀麗2

1 國家食品藥品監(jiān)督管理局濟南醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心；山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室 （山東 濟南 250101）2 山東恒信檢測技術(shù)開發(fā)中心 （山東 濟南 250101）

根據(jù)ISO/TC194WG9的要求進行溶血比對（Round robin）試驗。采用NIH（National Institutes of Health，美國國立衛(wèi)生研究院）直接接觸法和間接接觸法測定了5種材料的溶血性能，結(jié)果顯示聚乙烯、丁腈手套、#1橡膠和#2橡膠的溶血等級判定結(jié)果在兩種方法是一致的，但是丁腈手套的兩種方法的溶血率值有顯著差異。乳膠手套的溶血率和判定結(jié)果不一致。作者分析了這些不一致產(chǎn)生的原因，為醫(yī)療器械或材料的溶血性能檢測提出了一些建議，為新標準的發(fā)布和實施提供數(shù)據(jù)支持。

醫(yī)療器械 溶血性能 NIH方法

醫(yī)療器械本身或使用不當可能會導致溶血的發(fā)生，從而為臨床帶來一些不利的影響，因此評價醫(yī)療器械的溶血性能是很有意義的篩選試驗。國際標準ISO 10993-4:2017（E）[1]中列出了三種試驗方法供選擇，分別是ASTM（American Society for Testing and Materials，美國材料與試驗協(xié)會）F756-08[2]、NIH[3]和MHLW[4]（日本勞動健康福利局）發(fā)布的關(guān)于溶血的方法。國內(nèi)的標準有GB/T14233.2-2005[5]和GB/T16175-2008[6]等。GB/T14233.2-2005和GB/T16175-2008的方法相似，其與NIH法也是基本一致的。在這些關(guān)于NIH方法的標準中只是推薦采用直接法，本文根據(jù)ISO/TC194WG9進行溶血比對（Round robin）試驗的要求，將NIH間接法與NIH直接法進行比較，探討NIH間接法在醫(yī)療器械溶血性能檢測中的可行性，為新標準制定提供數(shù)據(jù)支持。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

材料：材料有5種，分別是a：聚乙烯，b：丁腈手套，c：乳膠手套，d：#1橡膠，e：#2橡膠。

儀器設備：主要有分光光度計，水浴搖床和離心機。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

嚴格按照表1列出的樣品大小切割試驗樣品，每個試驗樣品平行3管，分別置于20mm×150mm玻璃試管中。

直接接觸法：每支試管中各加入10mL生理鹽水。同時制備陰性對照和陽性對照，分別加入10mL生理鹽水和0.1%碳酸鈉。制備1管空白管，加入10mL生理鹽水。

間接接觸法：每支試管中加入11mL生理鹽水。陰性對照、陽性對照和空白管制備方法同直接接觸法。將所有試管置于（37±2）?C水浴中，60r/min振蕩孵育（72±2）h。將孵育后各管中的浸提液移出10mL至新的玻璃試管中。

表1. 試驗樣品

1.2.2 兔血制備

新西蘭白兔3只，每只抽取頸靜脈血5mL，置于0.109M/3.2%枸櫞酸鈉抗凝的采血管中，混合得到15mL血液。取8mL，加入10mL生理鹽水中混勻，得到稀釋的兔血。

取10mL0.1%的碳酸鈉置于玻璃試管中，加入稀釋的兔血0.2mL。545nm條件下，用生理鹽水調(diào)0，立即測定混合物的吸光度。本試驗要求吸光度在0.90～1.00（透過率在10%～13%）稀釋的兔血才能用于試驗。

1.2.3 與血液接觸

將按照3.1制備的所有試管置于（37±2）?C水浴中孵育30min后加入3.2制備的稀釋兔血0.2mL，空白管除外。將所有試管置于（37±2）?C水浴中孵育（60±5）min。

1.2.4 結(jié)果測定

孵育結(jié)束后，所有試管中液體被移入到離心管中，500g離心5min。用空白管液體調(diào)0，545nm測定各管上清液的吸光度值。陽性對照管的吸光度值應大于0.90，否則應重新進行試驗。

1.2.5 計算溶血率

按下列公式，計算得出a-e每個試驗樣品每管的溶血率值：

溶血率（%）=(T–Navg)/(Pavg–Navg)×100

T=每管試驗樣品OD值

表2. NIH法溶血結(jié)果判定

N=3管陰性對照平均OD值

P=3管陽性對照平均OD值

1.2.6 判定標準

計算每個試驗樣品3管溶血率的平均值按表2進行結(jié)果判定。

1.3 統(tǒng)計學分析

分別計算每周試驗結(jié)果及3周試驗結(jié)果的±s，對各個試驗樣品的試驗結(jié)果（溶血率）的統(tǒng)計學分析采用方差分析，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學差異。

2.結(jié)果

2.1 實驗3次結(jié)果比較

由表3可以看出，直接接觸法的樣品a、d和e的溶血率均小于5%，根據(jù)溶血等級判定為不溶血。樣品b和c的溶血率均高于5%，根據(jù)溶血等級判定為溶血，但樣品b的3次結(jié)果差異較明顯。間接接觸法的樣品b溶血率為100%，具有溶血活性。樣品a、c、d和e的溶血率均低于5%，判定為不溶血，5種試驗樣品3次結(jié)果判定一致。

2.2 直接接觸法和間接接觸法結(jié)果比較

由表4可以看出，樣品b和c在直接接觸法和間接接觸法的結(jié)果上有統(tǒng)計學差異，而樣品a、d和e的差異不顯著。

3.討論

NIH方法在醫(yī)療器械溶血檢測中因為其操作的簡便性，應用最為廣泛。本次研究主要是對NIH直接接觸法的重復性、間接接觸法的重復性以及直接接觸法和間接接觸法之間的一致性進行研究，為制定醫(yī)療器械材料介導的溶血試驗方法行業(yè)標準提供數(shù)據(jù)支持。

為了比較間接接觸法和直接接觸法之間的一致性，間接接觸法選用與直接接觸法相同的浸提比例和浸提溫度。試驗樣品b在直接接觸法3周試驗中的重復性較差，考慮可能的原因是由于手套比較柔軟，且試驗時切割的樣品比較大容易折疊在一起或容易緊貼管壁。

雖然試驗樣品b的直接接觸法和間接接觸法的溶血等級判定在同一個級別，但間接接觸法的溶血率顯著高于直接接觸法，說明經(jīng)過72 h的孵育，樣品中能影響紅細胞的物質(zhì)充分釋放至浸提液中，而直接接觸法因為樣品與浸提介質(zhì)之間的接觸時間只有90min，所以浸提出的有害物質(zhì)較少。試驗樣品c直接接觸法的溶血率顯著高于間接接觸法，兩種方法的溶血性能不在同一級別，樣品c是乳膠手套，質(zhì)地較柔軟，樣品制備成3cm×5cm大小的長方形，沒有尖銳的可以損傷紅細胞的邊角，因此溶血的發(fā)生與樣品物理性狀無關(guān)[7]。試驗樣品c在直接接觸法檢測時出現(xiàn)溶血現(xiàn)象的原因可能是某種物質(zhì)存在與樣品表面，直接與紅細胞接觸導致紅細胞膜破損，釋放血紅蛋白。但是這種物質(zhì)可能不溶于水，不會釋放入浸提液中，所以間接接觸法不會導致紅細胞膜損傷。

綜合分析結(jié)果，間接接觸法的重復性要優(yōu)于直接接觸，但是兩種方法檢測結(jié)果的一致性不能一概而論。同時進行直接接觸法和間接接觸法試驗，對一種未知醫(yī)療器械或材料的溶血性能檢測是最好的選擇。本次研究只是將NIH方法兩種方法進行比較，得到的數(shù)據(jù)有限，下一步還將進行NIH方法、ASTM方法和MHLW方法之間的一致性問題，同時考慮兔血和人血對溶血性能的影響，為三種方法和結(jié)果的互換性提供依據(jù)。

[1] ISO 10993-4:2017 (E).Biological evaluation of medical devices -- Part 4:Selection of tests for interactions with blood[S].2017.

[2] ASTM F 756-08.Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials[Z].Astm,2008.

[3] Evaluation of hemodialyzers and dialysis membranes.Report of a Study Group for the Artificial Kidney-Chronic Uremia Program NIAMDD-1977.Chapter two.In vitro characterization of hemodialyzers[J].Artif Organs 1977,1(2):59-77.

[4] MHLW Notification by Director,OMDE,Yakushokuki-hatsu 0301 No.20,March 1,2012,Basic Principles of Biological Safety Evaluation Required for Application for Approval to Market Medical Devices[Z].2012.

[5] GB/T 14233.2-2005 Infusion,transfusion,injection equipment for medical use -Part2:Biological test methods [醫(yī)用輸液、輸血醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗方法第2 部分:生物學試驗方法] [S].2005.

[6] GB/T 16175-1996,Organic silicone material for medical use — Biological evaluation test methods[S].1996.

[7] 孫皎,劉義榮,錢云芳.生物材料試樣形狀對溶血率的影響[J].口腔材料器械雜志,1993,2(2):17.

Comparison of Direct Contact Method and Indirect Contact Method for Evaluation of Hemolytic Performance of Medical Device-NIH Method

QIAO Chun-xia1QU Qiu-jin2ZHAO Zeng-lin2HOU Li1YANG Jing2DONG Xiu-li2
1 Jinan Quality Supevision and Inspection Center for Medical Device, CFDA; Shandong Provincial Key Laboratory of Biological Evaluation for Medical Devices (Shandong Jinan 250101)2 Shandong Hengxin Testing Technology Development Center (Shandong Jinan 250101)

1006-6586(2017)17-0042-02

R197.39

A

2017-07-12

表4. 直接接觸法和間接接觸法結(jié)果比較(±s，%)

表4. 直接接觸法和間接接觸法結(jié)果比較(±s，%)

*直接接觸法與間接接觸法相比，P＜0.01

試驗樣品 溶血率直接接觸法 間接接觸法a 0.53±0.4 1.50±1.5 b 61.97±31.6 104.51±7.5*c 19.48±2.1 1.08±1.6*d 0.40±0.5 0.38±1.0 e 0.14±0.6 0.30±0.7

表3. 試驗3次結(jié)果比較