脊髓損傷后外周組織炎癥反應(yīng)在并發(fā)2型糖尿病中的作用研究

朱根應(yīng)　　程瑞動(dòng)　　周亮　　李厥寶　　葉祥明

[摘要] 目的 通過(guò)觀察SD大鼠脊髓損傷后血糖的變化及其外周組織炎癥反應(yīng)狀態(tài)，探討脊髓損傷并發(fā)2型糖尿病的可能機(jī)制。 方法 將24只SD大鼠隨機(jī)分為兩組：假模組和脊髓損傷組，其中假模組又分為假模普通飼料組（Sham+LFD）和假模三高飼料組（Sham+HFD）兩個(gè)亞組，脊髓損傷組分為脊髓損傷普通飼料組（SCI+LFD）和脊髓損傷三高飼料組（SCI+HFD）兩個(gè)亞組。以改良的Allens撞擊法制作脊髓損傷動(dòng)物模型，在實(shí)驗(yàn)開始前及8周時(shí)監(jiān)測(cè)各組體重、血糖、葡萄糖耐量試驗(yàn)指標(biāo)。于8周時(shí)取大鼠肝臟、脾臟及內(nèi)臟脂肪組織，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法觀察各組織胰島素、TNF-α、IL-1β、IL-6 及IL-10等炎癥因子的表達(dá)情況。 結(jié)果 各組大鼠體重均有明顯增長(zhǎng)。脊髓損傷后大鼠血糖較損傷前明顯升高，外周組織 TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)較假模組明顯升高，IL-10則較假模組明顯下降。相比Sham+LFD組，Sham+HFD組、SCI+LFD組以及SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量顯著增加，IL-10顯著減少；相比Sham+HFD組，SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量進(jìn)一步增加，IL-10則進(jìn)一步減少。 結(jié)論 脊髓損傷后外周炎癥反應(yīng)在脊髓損傷后并發(fā)2型糖尿病中有重要作用。

[關(guān)鍵詞] SD大鼠；脊髓損傷；2型糖尿?。谎装Y反應(yīng)

[中圖分類號(hào)] R589 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）27-0038-04

Study on the effect of inflammatory reactions of peripheral tissues after spinal cord injury on concurrent type 2 diabetes mellitus

ZHU Genying CHENG Ruidong ZHOU Liang LI Juebao YE Xiangming

Department of Rehabilitative Medicine， Zhejiang Provincial Peoples Hospital， the Peoples Hospital Affiliated to Hangzhou Medical College， Hangzhou 310014， China

[Abstract] Objective To investigate the possible mechanism of spinal cord injury complicated with type 2 diabetes mellitus by observing the changes of blood glucose and the inflammatory response of peripheral tissue in SD rats after spinal cord injury. Methods A total of 24 SD rats were randomly divided into two groups： sham model group and spinal cord injury group. The sham model group was further divided into two subgroups： Sham+LFD group and Sham+HFD group. Spinal cord injury group was further divided into two groups： SCI+LFD group and SCI+HFD group. The animal model for spinal cord injury was made by modified Allen's impact method. Body weight， blood glucose and glucose tolerance indices were measured before experiment and 8 weeks after the experiment. At 8 weeks， the rat liver， spleen and visceral adipose tissues were collected. The expression of insulin and inflammatory factors such as TNF-α， IL-1β， IL-6 and IL-10 were observed by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The body weight in each group was increased significantly. Blood glucose in rats after spinal cord injury was significantly higher than that before injury. The expression of TNF-α， IL-1β and IL-6 in peripheral tissues was significantly higher than that in the sham model group， and IL-10 was significantly lower than that in the sham model group. Compared with the Sham+LFD group， the levels of insulin， TNF-α and IL-1β in Sham+HFD group， SCI+LFD group， and SCI+HFD group were significantly increased， and IL-10 was significantly decreased. Compared with Sham+HFD group， the levels of insulin， TNF-α and IL-1β in SCI+HFD group were increased further， and IL-10 was further decreased. Conclusion Peripheral inflammatory response after spinal cord injury plays an important role in the treatment of concurrrent type 2 diabetes mellitus after spinal cord injury.endprint

[Key words] SD rats； Spinal cord injury； Type 2 diabetes mellitus； Inflammatory response

臨床中脊髓損傷患者胰島素抵抗、糖耐量異常發(fā)生率明顯增高，近年有研究表明[1，2]，脊髓損傷與2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）發(fā)生幾率顯著增加相關(guān)，而在進(jìn)一步校正其他相關(guān)危險(xiǎn)因素后，該相關(guān)性仍然存在，表明脊髓損傷是2型糖尿病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。2型糖尿病系外周細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，血糖升高，體內(nèi)胰島素代償性增加，導(dǎo)致糖代謝紊亂[3，4]。研究證實(shí)機(jī)體的慢性炎癥狀態(tài)是導(dǎo)致脂肪、肌肉及肝臟等胰島素抵抗的主要原因[5]，外周慢性炎癥在2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[6]。脊髓損傷后機(jī)體相對(duì)會(huì)產(chǎn)生異常應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，過(guò)度活化的免疫細(xì)胞分泌多種炎性介質(zhì)，IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子通過(guò)干擾胰島素信號(hào)傳遞，在胰島素抵抗的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7，8]。臨床證實(shí)，給予糖尿病患者胰島素增敏劑治療，可明顯改善其慢性炎癥水平，提示胰島素抵抗與慢性炎癥緊密關(guān)聯(lián)[9]。脊髓損傷后腦與脊髓之間的生理性聯(lián)系和解剖連續(xù)性被破壞，反饋機(jī)制中斷或受損，使脊髓損傷后外周長(zhǎng)期處于異常應(yīng)激狀態(tài)，但相關(guān)研究目前尚無(wú)明確報(bào)道。本研究擬通過(guò)觀察SD大鼠脊髓損傷后外周組織炎癥反應(yīng)狀態(tài)及其對(duì)胰島素敏感性的影響，探討脊髓損傷并發(fā)2型糖尿病的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物及分組：選取24只健康SD大鼠（8周齡，雄性大鼠，體重150～180 g，普通級(jí)）為研究對(duì)象，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為假模對(duì)照組：假模普通飼料組（Sham+LFD）、假模三高飼料組（Sham+HFD），脊髓損傷組：脊髓損傷普通飼料組（SCI+LFD）、脊髓損傷三高飼料組（SCI+HFD），每組6只。普通飼料組進(jìn)食國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料，三高飼料組進(jìn)食配方三高飼料，誘發(fā)胰島素抵抗及糖尿病，每日自由飲水。各組在實(shí)驗(yàn)前（0周）及實(shí)驗(yàn)8周后進(jìn)行體重測(cè)量。脊髓損傷組行改良Allens法造成脊髓不完全性損傷，具體方法如下所述，假模組行相同手術(shù)操作但不進(jìn)行脊髓打擊損傷。

1.2 模型制備

采用改良的Allens撞擊法制作SCI動(dòng)物模型[10]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)5%水合氯醛（300 mg/kg體重）腹腔注射麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒，定位棘突后以T10為中心作長(zhǎng)約3 cm皮膚切口，鈍性剝離脊旁肌肉暴露脊椎后，微型咬骨鉗咬除T10及部分T9、T11棘突和椎板，暴露脊髓，以上操作過(guò)程中特別注意使硬脊膜完整。使用MASCIS Impactor（W.M. Keck Center of Rutgers University，USA）精確撞擊（10 g，11.5 cm），制作脊髓不完全損傷模型，模型成功標(biāo)志：可見大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng)，脊髓打擊部位淤血，雙下肢弛緩性癱瘓。假模組同樣進(jìn)行上述操作，咬除椎板并暴露脊髓，但不進(jìn)行重物撞擊。所有實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)畢均逐層縫合切口，并消毒表面。術(shù)后注意保溫，單籠飼養(yǎng)，仔細(xì)護(hù)理。

1.3 血糖指標(biāo)監(jiān)測(cè)

各組動(dòng)物禁食8 h，尾部取血，采用便攜式血糖檢測(cè)儀（美國(guó)強(qiáng)生公司）檢測(cè)空腹血糖，再以2 g/kg體重腹腔注射葡萄糖，分別于注射后15、30、45、120、180 min尾部采血，測(cè)定血糖濃度。在8周后重復(fù)進(jìn)行上述檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本取材

實(shí)驗(yàn)8周時(shí)，在禁食8 h后，斷頭處死迅速取腦，盡快分離出下丘腦后浸入液氮中急凍，同時(shí)取肝臟、脾臟、睪周脂肪（內(nèi)臟脂肪），分裝做好標(biāo)記后置于-80℃的超低溫冰箱中保存，用于免疫熒光檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定所取各組大鼠肝臟、脾臟、睪周脂肪組織胰島素、IL-10、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)：取組織粉碎（脂肪組織按5 mL/1 g比例于含1 mg/mL膠原酶的緩沖液中消化45 min），加入裂解液勻漿，低溫離心，抽提總蛋白在SDS2聚丙烯酰胺凝膠上電泳，30 mA恒流條件下，4℃過(guò)夜，將蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，封閉后，加入一抗（美國(guó)Abcam公司）后4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜后加二抗羊抗IgG（北京中山生物技術(shù)有限公司），常溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)Pierce公司）檢測(cè)陽(yáng)性信號(hào)，采用ScionImage軟件計(jì)算條帶的相對(duì)光密度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相對(duì)光密度值=實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M光密度值/β-actin光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組內(nèi)不同時(shí)間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析Oneway Annova，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化

干預(yù)前（0周）及干預(yù)8周后在同等條件下進(jìn)行體重測(cè)量，Sham+LFD組及Sham+HFD組大鼠體重較干預(yù)前均有明顯增加，三高飼料組增加幅度更高；類似的情況在脊髓損傷組大鼠中同樣可以看到，表明三高飼料及脊髓損傷對(duì)體重的增加均有明顯影響。見表1。

2.2 各組大鼠血糖指標(biāo)比較

Sham+HFD組、SCI+LFD組及SCI+HFD組8周時(shí)的血糖水平較0周時(shí)均明顯增加，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Sham+LFD組8周時(shí)的血糖水平與0周相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。推測(cè)三高飼料及脊髓損傷后均易出現(xiàn)血糖增高。見表2。

2.3各組大鼠組織中胰島素及IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6的含量比較

相比Sham+LFD組，LFD飼料飼養(yǎng)的SCI+LFD組、HFD飼料飼養(yǎng)的Sham+HFD組以及SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量顯著增加，IL-10顯著減少；相比Sham+HFD組，HFD飼料飼養(yǎng)的SCI+HFD組大鼠組織中胰島素、TNF-α、IL-1β含量亦有明顯增加，IL-10則顯著減少，結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，HFD飼養(yǎng)條件下，脊髓損傷對(duì)大鼠組織中胰島素、IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6含量有著重要的影響。大鼠組織中胰島素、IL-10、TNF-α、IL-1β及IL-6含量的ELISA檢測(cè)結(jié)果見表3。endprint

3 討論

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由各種原因引起的脊髓結(jié)構(gòu)、功能的損害，造成損傷水平以下不同程度的運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)功能障礙。脊髓損傷的治療與康復(fù)是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)界的一大難題，脊髓損傷后并發(fā)癥的多發(fā)性也嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，其對(duì)代謝的影響近年來(lái)也越來(lái)越引起重視[1]。許多研究表明，脊髓損傷與2型糖尿病之間存在著密切的關(guān)系[1，2]。有文獻(xiàn)報(bào)道脊髓損傷后發(fā)生2型糖尿病的幾率從10%～22%不等[11-13]。

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）系外周細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性降低，血糖升高，體內(nèi)胰島素代償性增加，導(dǎo)致糖代謝紊亂。以往研究一般認(rèn)為脊髓損傷患者血糖濃度常升高是應(yīng)激反應(yīng)所引起[14]，臨床上證實(shí)，給予糖尿病患者胰島素增敏劑治療，可明顯改善患者的慢性炎癥水平，提示胰島素抵抗與慢性炎癥緊密相關(guān)。近年研究表明，胰島素抵抗與慢性炎癥交互作用，促進(jìn)2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[15]。慢性炎癥導(dǎo)致胰島素抵抗的機(jī)制主要是多種促炎細(xì)胞因子通過(guò)刺激炎癥信號(hào)通路干擾胰島素的信號(hào)傳遞過(guò)程所致，胰島素抵抗又可加重慢性炎癥。在2型糖尿病時(shí)脂肪細(xì)胞會(huì)分泌一系列的炎癥因子，包括TNF-α、IL-1β、IL-6等，會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞向脂肪組織遷移、浸潤(rùn)，產(chǎn)生更多的炎癥因子，而炎癥因子會(huì)導(dǎo)致胰島素敏感細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而造成胰島素抵抗[16，17]。肝臟的胰島素抵抗表現(xiàn)為血胰島素水平的升高，升高的胰島素不能有效地抑制肝糖的異生和餐后糖原的儲(chǔ)存減少，導(dǎo)致空腹和餐后血糖水平的升高。

以往研究多集中于糖尿病危險(xiǎn)因素與胰島素抵抗之間的關(guān)系[18]，以及β細(xì)胞上胰島素信號(hào)通路的缺陷與β細(xì)胞凋亡的增加和糖尿病發(fā)生之間的關(guān)系[19，20]。近年來(lái)，氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)生和發(fā)展中的作用逐漸引起人們的重視。有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期的血糖控制不佳導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激損傷是糖尿病并發(fā)癥的共同機(jī)制，而氧化應(yīng)激狀態(tài)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)反過(guò)來(lái)又可加重氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)并抑制炎性因子可有效防治糖尿病并發(fā)癥[21]。

本研究通過(guò)對(duì)脊髓損傷大鼠的炎性因子的檢測(cè)，并與假模組進(jìn)行比較，表明脊髓損傷后大鼠無(wú)論是正常飲食組還是高脂飲食組，其外周組織中胰島素、TNF-α、IL-1β及IL-6含量均較假模組顯著增加，而IL-10則顯著降低。而且高脂飲食組的變化較正常飲食組變化更為明顯。提示脊髓損傷后大鼠體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生明顯的外周炎性反應(yīng)，生成更多的炎癥因子，這些炎癥因子可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，從而造成胰島素抵抗，更進(jìn)一步則會(huì)發(fā)展為2型糖尿病，部分揭示了脊髓損傷后2型糖尿病發(fā)生幾率上升的可能機(jī)制。這就為臨床上脊髓損傷后并發(fā)糖尿病進(jìn)行干預(yù)提供了思路，即如何減輕機(jī)體的外周炎性反應(yīng)，減少生成炎癥因子，從而降低脊髓損傷后發(fā)生2型糖尿病的幾率。

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（收稿日期：2017-07-11）endprint