乳源生物活性肽研究進(jìn)展

于洋，祁艷霞，靳艷

1(中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院 分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連，116023) 2(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連，116023)

乳源生物活性肽研究進(jìn)展

于洋1,2，祁艷霞2，靳艷1*

1(中國科學(xué)院 大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院 分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連，116023) 2(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連，116023)

乳蛋白是人類膳食蛋白質(zhì)的重要來源之一，乳蛋白在蛋白酶的作用下生成具有不同功能的肽，因其對(duì)人體生理功能潛在的調(diào)節(jié)作用得到了廣泛的研究和關(guān)注。為了更好地了解乳源生物活性肽，文章從生物功能、制備方法以及質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用等3個(gè)方面對(duì)乳源生物活性肽的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述。首先系統(tǒng)分析了目前已報(bào)道的具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、抗菌活性和阿片活性等功能的乳源生物活性肽的功能、來源和構(gòu)效關(guān)系；對(duì)乳源生物活性肽的制備方法及其優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了比較；最后對(duì)質(zhì)譜技術(shù)在乳源生物活性肽篩選、磷酸化乳源肽和糖基化乳源肽的鑒定等方面的最新應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了梳理。

乳蛋白；生物活性肽；質(zhì)譜技術(shù)；生物活性

乳蛋白是食源蛋白質(zhì)的重要組成部分，不僅可以為人體提供營養(yǎng)物質(zhì)，還可以產(chǎn)生多種對(duì)人體代謝和生理活動(dòng)具有積極影響的生物活性肽，是當(dāng)前國際食品界熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子。乳源生物活性肽活性強(qiáng)、易制備、來源廣泛且天然安全，受到人們的普遍關(guān)注。在過去的數(shù)十年中，利用不同的制備技術(shù)和方法，不斷從乳蛋白中發(fā)現(xiàn)具有新功能的生物活性肽。同時(shí)隨著組學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，基于生物質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于乳源生物活性肽的研究，使得乳源生物活性肽的研究更加深入。本文從乳源生物活性肽的活性、制備以及質(zhì)譜技術(shù)在乳源生物活性肽的鑒定和分析方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為后續(xù)的研究提供參考。

1 乳源生物活性肽

乳源生物活性肽是以乳蛋白為原料，經(jīng)過水解及分離純化后得到的具有特殊生物活性的蛋白水解物，能夠產(chǎn)生鎮(zhèn)靜止痛、調(diào)節(jié)血壓、機(jī)體防御與免疫調(diào)節(jié)以及促進(jìn)礦物質(zhì)吸收等促進(jìn)人體健康的功能[1-5]。文獻(xiàn)報(bào)道乳源生物活性肽具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme， ACE)抑制活性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗氧化活性、抗菌活性和阿片活性等功能，如表1所示。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道的具有5種生物功能的乳源生物活性肽

續(xù)表1

源蛋白片段肽段序列生物活性參考文獻(xiàn)β-酪蛋白f(132-138)NLHLPLP[9]β-酪蛋白f(133-138)LHLPLP[9]β-酪蛋白f(133-139)LHLPLPL[9]β-酪蛋白f(170-175)VLPVPQ[6]β-酪蛋白f(193-198)YQEPVL[9]β-酪蛋白f(193-201)YQEPVLGPV[9]β-酪蛋白f(193-202)YQEPVLGPVR[9]β-酪蛋白f(194-209)QEPVLGPVRGPFPIIV[7]β-酪蛋白f(195-206)EPVLGPVRGPFP[8]β-酪蛋白f(197-206)VLGPVRGPFP[8]β-酪蛋白f(201-209)VRGPFPIIV[8]κ-酪蛋白f(18-24)FSDKIAK[15]κ-酪蛋白f(25-30)YIPIQY[16]α-乳白蛋白f(50-52)YGL[17]α-乳白蛋白f(50-53)YGLF[1]α-乳白蛋白f(99-108)VGINYWLAHK[17]α-乳白蛋白f(104-108)WLAHK[17]β-乳球蛋白f(22-25)LAMA[17]β-乳球蛋白f(32-40)LDAQSAPLR[17]β-乳球蛋白f(94-100)VLDTDYK[17]β-乳球蛋白f(102-105)YLLF[18]β-乳球蛋白f(142-148)ALPMHIR[1]乳鐵蛋白f(17-41)FKCRRWQWRMKKLGAP-SITCVRRAF[1]αs1-酪蛋白f(1-23)RPKHPIKHQGLPQEVLNENLL-RF免疫調(diào)節(jié)活性[8]αs1-酪蛋白f(194-199)TTMPLW[19]β-酪蛋白f(1-28)RELEELNVPGEIVESLSSSEESI-TRINK[8]β-酪蛋白f(60-66)YPFPGPI[9]β-酪蛋白f(63-68)PGPIPN[9]β-酪蛋白f(191-201)LLYQEPVLGPV[9]β-酪蛋白f(192-206)LYQEPVLGPVRGPFP[9]β-酪蛋白f(192-207)LYQEPVLGPVRGPFPI[9]β-酪蛋白f(192-208)LYQEPVLGPVRGPFPII[9]β-酪蛋白f(192-209)LYQEPVLGPVRGPFPIIV[8]β-酪蛋白f(193-205)YQEPVLGPVRGPF[9]β-酪蛋白f(193-206)YQEPVLGPVRGPFP[9]β-酪蛋白f(193-207)YQEPVLGPVRGPFPI[9]β-酪蛋白f(193-209)YQEPVLGPVRGPFPIIV[8]αs1-酪蛋白f(1-23)RPKHPIKHQGLPQEVLNENLL-RF抗菌活性[8]αs1-酪蛋白f(15-22)VLNENLLR[8]αs1-酪蛋白f(21-29)LRFFVAPFP[4]αs1-酪蛋白f(30-38)EVFGKEKVN[4]αs1-酪蛋白f(99-109)LRLKKYKVPQL[4]αs2-酪蛋白f(164-169)LKKISQ[4]αs2-酪蛋白f(165-170)KKISQR[4]αs2-酪蛋白f(165-181)KKISQRYQKFALPQYLK[4]αs2-酪蛋白f(183-207)VYQHQKAMKPWIQPKT-KVIPYVRYL[4]β-酪蛋白f(193-209)YQEPVLGPVRGPFPIIV[8]κ-酪蛋白f(18-24)FSDKIAK[4]

續(xù)表1

源蛋白片段肽段序列生物活性參考文獻(xiàn)κ-酪蛋白f(106-169)MAIPPKKNQDKTEIPTINTIAS-GEPTSTPTTEAVESTVATLEDSPEVIESP-PEINTVQVTSTAV[20]乳鐵蛋白f(17-41)FKCRRWQWRMKKLGAP-SITCVRRAF[1]αs1-酪蛋白f(80-90)HIQKEDVPSER抗氧化活性[8]αs1-酪蛋白f(157-164)DAYPSGAW[21,22]αs2-酪蛋白f(174-181)FALPQYLK[8]β-酪蛋白f(170-176)VLPVPQK[9]κ-酪蛋白f(96-106)ARHPHPHLSFM[23]αs1-酪蛋白f(90-96)RYLGYLE阿片活性[1]β-酪蛋白f(60-63)YPFP[9]β-酪蛋白f(60-65)YPFPGP[9]β-酪蛋白f(60-66)YPFPGPI[9]β-酪蛋白f(60-67)YPFPGPIP[9]κ-酪蛋白f(25-34)YIPIQYVLSR[8]

1.1ACE抑制肽

高血壓是心血管疾病的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素，是目前影響人類健康的主要疾病之一。在各種生物活性肽中，抗高血壓生物活性肽的研究最為深入和廣泛。ACE是一種在血壓調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的酶，抑制ACE的活性會(huì)降低血壓。ACE抑制肽的氨基酸序列結(jié)構(gòu)和肽鏈長度各不相同，大多含2～14個(gè)氨基酸殘基，但都具有類似的生理功能[24]。對(duì)ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系研究表明，C末端三肽殘基在競爭性結(jié)合ACE活性位點(diǎn)中起關(guān)鍵作用。大多數(shù)有效的ACE 抑制肽在C末端包含Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸殘基和Pro殘基時(shí)最有利于其與ACE的結(jié)合，而且 Leu可能對(duì)增加多肽的ACE 抑制潛力具有顯著作用。

1965年，F(xiàn)ERREIRA等[25]首次從南美洲蝮蛇的毒液中發(fā)現(xiàn)了一種具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE) 活性的小肽之后，ACE抑制肽的研究引起了各國科學(xué)家們的興趣。目前在乳制品中已從牛奶、發(fā)酵乳和奶酪中分離純化得到了各種結(jié)構(gòu)、序列及長度大小不一的具有降血壓功能的 ACE 抑制肽。由于ACE抑制肽具有降血壓的作用，因此通過控制發(fā)酵條件來得到含有更高活性 ACE 抑制肽的發(fā)酵乳制品已經(jīng)得到商業(yè)應(yīng)用。例如，日本的一種名為“Calpis”的軟飲料，是由乳酸桿菌發(fā)酵的脫脂牛奶，其中含有三氨基酸多肽，序列分別為Val-Pro-Pro和Ile-Pro Pro，具有明顯的降血壓作用[26]。

1.2阿片肽

阿片肽是免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)因子，是最早在酪蛋白的酶解產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)的生物活性肽。阿片肽是一類具有嗎啡受體配體活性的生物活性肽，能夠作為激素和神經(jīng)遞質(zhì)與體內(nèi)的μ-、δ-和γ-受體相互作用，具有鎮(zhèn)靜止痛、調(diào)節(jié)人體情緒、呼吸、脈搏、體溫、延長胃腸蠕動(dòng)和刺激胃腸激素的釋放等生理功能[1-2]。

β-酪啡肽是由β-酪蛋白酶解得到的一類阿片活性肽，其中研究最多的β-酪啡肽 5 (β-casomorphin-5，β-CM5)和β-酪啡肽 7 (β-casomorphin-7，β-CM7) 是來源于β-酪蛋白 60-64 位 (YPFPG) 和60-66 位(YPFPGPI)的2種具有阿片活性的多肽物質(zhì)。1979年，BRANTL[27]從牛乳β-酪蛋白的酶解物中發(fā)現(xiàn)了對(duì)豚鼠回腸縱肌神經(jīng)節(jié)具嗎啡樣活性的物質(zhì), 并首次從中分離出β-酪啡肽5 (β-casomorphin-5，β-CM5) Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly和β-酪啡肽7 (β-casomorphin-7，β-CM7) Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile，這是源于食品蛋白活性肽的最早報(bào)道，并證實(shí)與內(nèi)源性阿片樣肽具有相同的活性。

1.3抗氧化肽

人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處在動(dòng)態(tài)平衡中，但當(dāng)人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生過量時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體的損傷進(jìn)而引起多種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，通過膳食供應(yīng)來提高機(jī)體的抗氧化能力是降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平的一種現(xiàn)實(shí)和可行的方法。

FARVIN[28]等在酸奶中鑒定到一系列源于酪蛋白的抗氧化肽，并提出將抗氧化肽作為一種食品添加劑應(yīng)用于易氧化的魚油食品中以延緩氧化的可能性。他們之后的一篇報(bào)道[29]進(jìn)一步研究了抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系，發(fā)現(xiàn)這些肽幾乎都至少含有一個(gè)Pro殘基，部分鑒定到的肽段N端為疏水性氨基酸(如Val或Leu)并且肽段序列中含有Pro，His 或Tyr，這些被認(rèn)為是抗氧化肽的特征結(jié)構(gòu)。

1.4抗菌肽

抗菌肽又稱為肽類抗生素，是由生物體產(chǎn)生的具有抗菌作用的小分子蛋白質(zhì)，是宿主先天性非特異性防御系統(tǒng)的重要組分，多數(shù)相對(duì)分子質(zhì)量小于10 kDa，由20～60個(gè)氨基酸殘基組成，是多樣性的陽離子型兩親性肽類。這類肽的N末端富含親水性氨基酸殘基，如Lys、Arg等；C末端富含疏水性氨基酸殘基，如Ala、Gly，且通常被酰胺化，這是抗菌肽具有抗菌活性的關(guān)鍵因素之一。同時(shí)這類活性多肽多數(shù)具有兩親性和電正性等特點(diǎn)，與免疫調(diào)節(jié)肽之間還有互相協(xié)同和增效作用[30]。

最早被發(fā)現(xiàn)的乳源抗菌肽是用凝乳蛋白酶酶解αs1-酪蛋白獲得有抗菌特點(diǎn)的物質(zhì)。這種物質(zhì)被命名為Casecidin，并通過實(shí)驗(yàn)證明其在體外可抑制葡萄球菌、八疊球菌、枯草桿菌、肺炎雙球菌和化膿性鏈球菌的生長[31]。MALKOSKI等[20]從κ-酪蛋白的水解產(chǎn)物中分離得到具有抗菌活性的肽，經(jīng)鑒定為κ-酪蛋白106-169序列片段，并將其命名為Kappacin?？咕氖墙鼛啄陙硌芯枯^多的一類生物活性肽，對(duì)人體特別是新生兒正常生理功能發(fā)揮著不可替代的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1.5免疫調(diào)節(jié)肽

免疫調(diào)節(jié)肽是一類從乳酪蛋白的胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等酶水解物中分離出來的、具有刺激吞噬功能的肽類，這些免疫活性肽不僅在生物體內(nèi)起重要的免疫調(diào)節(jié)作用，而且還刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提高機(jī)體抗病原物質(zhì)的感染能力。

GILL等[32]證實(shí)了來源于牛乳蛋白的低分子質(zhì)量肽可以調(diào)節(jié)人外周血液淋巴細(xì)胞的增生。MIGHORE-SAMOUR 等[33]發(fā)現(xiàn)酪蛋白酶解后獲得了2條具有刺激巨噬細(xì)胞活性功能的免疫調(diào)節(jié)肽，不僅可以在體外實(shí)驗(yàn)中刺激小眼吞噬細(xì)胞的活性，在人體內(nèi)也可刺激巨噬細(xì)胞的吞噬活性。其他一些活性肽(如抗高血壓肽、阿片肽等)也具有一定的免疫調(diào)節(jié)活性，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。還有研究表明免疫調(diào)節(jié)肽能夠抑制艾滋病早期感染的發(fā)展和腫瘤生長。盡管如此，目前對(duì)于免疫刺激肽如何發(fā)揮其功能的生理機(jī)制還不清楚，有待于進(jìn)一步深入研究。

1.6促進(jìn)礦物質(zhì)吸收

酪蛋白是牛奶、酸奶以及奶酪等乳制品中主要的磷酸化蛋白，由酪蛋白水解得到的磷酸化片段稱為酪蛋白磷酸肽(caseinophosphopeptides，CPPs)。CPPs的經(jīng)典制備方式是用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等適宜pH值為7.0～8.0的酶進(jìn)行酶解，將pH值調(diào)至4.6沉淀蛋白，上清液調(diào)至7.0后加入CaCl2振蕩，使用冰乙醇沉淀得到CPPs[34]。許多CPPs具有一種3個(gè)磷酸絲氨酸殘基后接2個(gè)谷氨酸殘基的特征結(jié)構(gòu)，即Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu，這種結(jié)構(gòu)使CPPs具有較強(qiáng)的結(jié)合二價(jià)金屬離子(如鈣、鐵、鋅)的功能[3]。CPPs與鈣離子結(jié)合可防止鈣離子在小腸內(nèi)生成磷酸鈣沉淀，提高鈣離子的溶解度，促進(jìn)鈣離子的吸收和利用。多項(xiàng)研究表明CPPs還具有預(yù)防齲齒的作用[35-36]。

可以看出酪蛋白(casein)和乳清蛋白(whey protein)均可釋放生物活性肽，而在4種酪蛋白(αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白)中，β-酪蛋白產(chǎn)生最多的活性肽，其次是αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和αs2-酪蛋白[37]。

2 乳源生物活性肽的制備方法

乳源生物活性肽被編碼在對(duì)應(yīng)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中，只有在水解后從蛋白中釋放出來時(shí)才會(huì)被激活從而具備生物活性[3]。酶解法和微生物發(fā)酵法對(duì)乳蛋白進(jìn)行水解是常用的制備乳源生物活性肽的方法。

2.1酶解法制備生物活性肽

酶法制備乳源生物活性肽以其成本低，安全性高，條件溫和，水解進(jìn)程易于控制，可特異性生產(chǎn)特定的肽等優(yōu)勢(shì)，一直以來都是活性肽的主要制備方法。常用的蛋白水解酶有三類：動(dòng)物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等；植物蛋白酶如木瓜蛋白酶及菠蘿蛋白酶等；微生物蛋白酶如細(xì)菌膠原酶、嗜熱菌蛋白酶等[38]。由于酶的專一性，蛋白酶的水解位點(diǎn)存在差異，當(dāng)2種或2種以上蛋白酶同時(shí)作用于底物時(shí)，往往具有協(xié)同增效作用，因此采用復(fù)合酶水解蛋白的方法可提高酶解效率。酶解產(chǎn)物一般是各種活性肽的混合物，活性效果也往往是多種肽段活性協(xié)作的結(jié)果。

酶膜反應(yīng)器是一種高效制備生物活性肽的反應(yīng)器，系統(tǒng)可以持續(xù)穩(wěn)定反應(yīng)達(dá)8 h 以上，大大提高了原料和蛋白酶的利用率[39]。超聲波、微波等方法也可提高酶解效率、縮短酶解時(shí)間，作為一種輔助手段越來越多地應(yīng)用到了蛋白質(zhì)酶解工藝中[40]。

酶法制備活性肽具有效率高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，因此是目前最常用的方法。但是由于酶的品種有限，利用該方法制備活性肽具有一定的局限性。

2.2微生物發(fā)酵法制備生物活性肽

微生物發(fā)酵是一個(gè)古老的制備生物活性肽的方法。微生物酶解蛋白釋放乳源生物活性肽主要發(fā)生于酸奶、酸奶油、干酪和乳酒的制作中。酸奶中的肽主要是由乳酸菌發(fā)酵得到的，常用的乳酸菌有嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和乳雙歧桿菌等。在酸奶發(fā)酵過程中，有20%左右的蛋白質(zhì)在乳酸菌的作用下被分解，產(chǎn)生對(duì)人體健康有重要影響的活性肽等物質(zhì)。開菲爾粒(Kefir grains)是一個(gè)復(fù)雜的微生物共生體系，主要由酸菌，酵母菌和醋酸菌的某些屬種組成。JENNIFER等[37]使用開菲爾粒制作俄羅斯傳統(tǒng)發(fā)酵乳Kefir，然后對(duì)其中的活性肽進(jìn)行分析，共鑒定到有16條活性肽具有ACE抑制活性、阿片活性、抗氧化、抗菌、抗血栓形成和礦物質(zhì)結(jié)合等不同活性。PAN等[41]使用瑞士乳桿菌LB10發(fā)酵牛奶并檢測了產(chǎn)物的ACE抑制活性，ACE抑制率為75.46%，并從β-乳球蛋白中篩選出了一個(gè)新的肽段RLSFNP，其對(duì)ACE的半抑制濃度(hemi-inhibitory concentration，IC50)為177.39 mmol/L。

微生物發(fā)酵法是最傳統(tǒng)的活性肽的制備方法，在食品中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。發(fā)酵所使用的微生物具有特殊的蛋白酶體系，而且還可使用多種微生物組合進(jìn)行發(fā)酵，因此所制備的活性肽的功能更豐富。但是與酶法相比較，發(fā)酵所用微生物的蛋白酶體系效率較低，發(fā)酵并不能使乳蛋白完全降解，一般只有20%左右的乳蛋白被降解。

3 質(zhì)譜技術(shù)在乳源生物活性肽中的應(yīng)用

得益于質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究步入快速發(fā)展軌道，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也從生物醫(yī)學(xué)拓展到食品領(lǐng)域，形成食物蛋白質(zhì)組學(xué)(food proteomics)?；谏镔|(zhì)譜的食物蛋白質(zhì)組學(xué)在乳蛋白中的主要應(yīng)用有：乳蛋白消化組學(xué)、乳源生物活性肽的篩選、磷酸化乳源肽及糖基化乳源肽的研究。

3.1乳蛋白質(zhì)消化組學(xué)

乳蛋白消化組學(xué)是食源蛋白質(zhì)消化組學(xué)的重要組成部分，主要是利用以質(zhì)譜技術(shù)為核心的蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析乳蛋白質(zhì)經(jīng)過人體胃腸道消化后的去向以及蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物對(duì)人體健康的影響，是目前國際上一個(gè)活躍的研究領(lǐng)域。

對(duì)人體胃腸道消化的研究可分為體內(nèi)消化和體外消化2種模式。體外消化是在生物體外模擬人體胃腸道的消化環(huán)境，研究各種食物或藥物成分的消化和代謝情況。由于對(duì)蛋白質(zhì)消化酶及消化條件有比較好的研究基礎(chǔ)，因此針對(duì)蛋白質(zhì)尤其是乳蛋白質(zhì)體外消化模型的研究較多。PICARIELLO等[42]建立體外模擬胃腸道消化體系研究了牛奶蛋白的消化過程，模擬消化體系主要為胃蛋白酶、由胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和羧肽酶組成的胰酶、以及人體小腸BBM酶，分別在模擬胃液(pH 2.0)、模擬胰液(pH 7.0)和模擬腸液中反應(yīng)1 h，研究了經(jīng)過模擬消化后牛奶肽的存在情況。結(jié)果顯示β-乳球蛋白的特定區(qū)域(f 125-135)具有耐酶解的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室[7]利用基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了酸奶的蛋白消化組學(xué)，在酸奶、酸奶胃酶解和酸奶胰酶解樣品通過質(zhì)譜檢測分別鑒定到250、434和466條酪蛋白肽，并對(duì)消化過程中ACE和DPP-IV抑制活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明酸奶的ACE和DPP-IV抑制活性均隨著消化程度的加深而增加。STUKNYTE等[43]使用混合四極靜態(tài)軌道阱質(zhì)譜Q Exactive研究了12種不同的奶酪樣品經(jīng)過模擬胃腸道消化的主要的ACE抑制肽并主要研究了其中的8條：VPP、IPP、RYLG、RYLGY、AYFYPE、HLPLP、AYFYPEL和LHLPLP。不同的奶酪樣品經(jīng)消化后產(chǎn)生ACE抑制肽的數(shù)量和種類均會(huì)發(fā)生變化，但VPP和IPP幾乎存在于所有的樣品中。SANCHEZ-RIVERA等[44]以西班牙藍(lán)紋奶酪為樣品進(jìn)行模擬胃腸道消化。在十二指腸消化時(shí)，除了胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶之外，還使用了胰脂肪酶(pancreatic lipase)和輔脂肪酶(colipase)對(duì)乳蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的消化。結(jié)果顯示經(jīng)過模擬胃腸道消化之后，包括ACE抑制肽、抗氧化肽、阿片肽和抗菌肽等活性肽的數(shù)量顯著增加。

乳蛋白的消化研究在人體或動(dòng)物體內(nèi)能最準(zhǔn)確地反映實(shí)際情況，但是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)往往存在研究周期長、動(dòng)物個(gè)體間的差異、結(jié)果重現(xiàn)性差、費(fèi)用高、倫理等問題，而體外消化模型則憑借其簡單方便、便宜、可再生的優(yōu)點(diǎn)逐漸得到了廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。隨著研究發(fā)展，體外消化模型的模擬條件逐漸細(xì)化和精確，越來越向體內(nèi)真實(shí)的狀態(tài)靠攏，大大提高了使用體外模型得到研究結(jié)果的可信度。

3.2基于蛋白質(zhì)組學(xué)的乳源生物活性肽篩選

傳統(tǒng)活性肽制備方法需經(jīng)過分離純化，得到單一組分后通過結(jié)構(gòu)解析獲得活性肽的信息，這種傳統(tǒng)的方法效率低下，往往獲得一個(gè)肽需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和化學(xué)試劑。本實(shí)驗(yàn)室將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與構(gòu)效關(guān)系相擬合，建立了基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的生物活性肽快速篩選方法[45-46]，該技術(shù)可通過質(zhì)譜分析獲得大量的肽序列信息，結(jié)合活性肽的構(gòu)效分析可實(shí)現(xiàn)快速篩選生物活性肽。

利用該技術(shù)使用RPLC串聯(lián)質(zhì)譜LTQ-Orbitrap XL對(duì)市面上4種酸奶進(jìn)行研究，通過質(zhì)譜檢測分別鑒定到152、125、364和274條肽段。以對(duì)ACE的抑制能力為指標(biāo)對(duì)鑒定到的肽活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在相同濃度2 mg/L時(shí)，4種酸奶 ACE 抑制率分別為 46.84%、42.75%、77.41%和 63.84%。另外還利用這種高效、快速篩選活性肽的方法，在酸奶中獲得FVAPFPEVF、PPFLQPEVM和QEPVLGPVRGPFPIIV 3個(gè)新的活性肽，其中FVAPFPEVF和PPFLQPEVM對(duì)ACE和DPP-IV均具有抑制作用，F(xiàn)VAPFPEVF對(duì)ACE和DPP-IV的IC50分別為35.76 μmol/L和2.52 μmol/L；PPFLQPEVM對(duì)ACE和DPP-IV的IC50分別為34.63 μmol/L和0.44 μmol/L；QEPVLGPVRGPFPIIV只對(duì)ACE有抑制作用，IC50為160.76 μmol/L[7]。

3.3基于蛋白質(zhì)組學(xué)的磷酸化肽和糖基化肽的研究

利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定蛋白磷酸化和糖基化是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中的主要研究方向之一，該技術(shù)也應(yīng)用于乳蛋白中的酪蛋白磷酸化以及糖基化肽的研究中。乳蛋白磷酸化的研究主要集中在具有促進(jìn)鈣吸收的酪蛋白磷酸肽的研究中。由于乳蛋白肽中發(fā)生磷酸化修飾和糖基化修飾的肽段豐度較低，非修飾肽會(huì)抑制修飾肽的信號(hào)，降低質(zhì)譜檢測的靈敏度，因此通常需要進(jìn)行富集來取得更好的鑒定效果。CRUZ-HUERTA等[47]使用UPLC連接Esquire-LC四極離子阱質(zhì)譜分析酪蛋白副產(chǎn)物中的CPPs，共鑒定到37條CPPs，其中源于αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白的分別有13條、8條、16條和2條，顯示酪蛋白副產(chǎn)物可以成為CPPs的來源。ADT等[48]使用RPLC連接納升級(jí)電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜研究波弗特奶酪以及酶解產(chǎn)物中的CPPs。72條波弗特奶酪中水溶性的CPPs大部分源于β-酪蛋白，而酶解產(chǎn)物中的79條CPPs則主要來源于αs1-酪蛋白。大部分鑒定到CPPs是單磷酸化的，只有17條含有CPPs的特征結(jié)構(gòu)Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu。乳蛋白的糖基化與哺乳期密切相關(guān)，相關(guān)的研究并不太多。CHEN等[49]研究了牛乳中葉酸結(jié)合蛋白中的糖基化肽。葉酸結(jié)合蛋白的酶解物富集后使用PNGase F 酶去除糖基化肽上的糖鏈，使用MALDI-TOF-MS鑒定到NACCSVNTSIEAHK和GWNWTSGYNQCPVK兩條肽段。結(jié)果表明牛乳中的葉酸結(jié)合蛋白的49位和141位天冬氨酸殘基會(huì)發(fā)生N-糖基化，其發(fā)生的概率分別為96%和74%。

4 總結(jié)與展望

隨著人們健康意識(shí)的日益增強(qiáng)以及對(duì)強(qiáng)化食品、膳食補(bǔ)充劑和保健功能食品需求的增長，活性強(qiáng)、天然安全、資源豐富且易于進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的乳源生物活性肽將具有強(qiáng)大的發(fā)展趨勢(shì)。同時(shí)高分辨率的分離技術(shù)與功能強(qiáng)大的生物質(zhì)譜技術(shù)的迅猛發(fā)展，使乳源生物活性肽的研究水平發(fā)生了質(zhì)的飛躍，其具備的各種生物活性對(duì)尋找疾病的治療條件以及研究藥物的先導(dǎo)化合物等具有重要意義，因此利用新技術(shù)新方法研究開發(fā)乳源生物活性肽具有十分優(yōu)越的應(yīng)用前景。

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Milk-derivedbioactivepeptides:Areview

YU Yang1,2,QI Yan-xia2,JIN Yan1*

1(Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry,Dalian Institute of Chemical and Physics, Chinese Academy of Sciences,Dalian 116023,China) 2(College of Food Science and Engineering College,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China)

Milk protein is a kind of significant high-value and digestible protein, which could be hydrolyzed by proteases and release various functional bioactive peptides. Milk-derived bioactive peptides has

wide interests and extensive research for their regulating effects on human body. The biological function, preparation and mass spectrometry application on milk-derived bioactive peptides were systematically summarized. Milk-derived bioactive peptides’ have angiotensin converting enzyme inhibitory activities, immunoregulatory, antioxidant, antibacterial and opioid bioactivities. The biological functions, sources and structure-function relationship of milk-derived bioactive peptides were analyzed. The enzymatic hydrolysis and fermentation are two main preparation methods of milk-derived bioactive peptides. The advantages and disadvantages of two techniques were compared. Finally, the application of mass spectrometry technology on the screening and identifying of milk-derived bioactive peptides, including phosphopeptides and glycopeptides were reviewed.

milk protein; bioactive peptides; mass spectrometry technology; bioactivity

碩士研究生(靳艷研究員為通訊作者，E-mail：yanjin@dicp.ac.cn)。

國家自然科學(xué)基金(31601538)；中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(KL-1602)

2017-01-16，改回日期：2017-02-14

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013847