食品中銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測的研究

楊滴，劉彥泓，劉岑杰，夏元鳳

（大連市食品檢驗所，遼寧大連116600）

食品中銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測的研究

楊滴，劉彥泓，劉岑杰，夏元鳳

（大連市食品檢驗所，遼寧大連116600）

根據(jù)銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，用Primer express 3.0設(shè)計一對特異性引物和一個TaqMan探針，建立銅綠假單胞菌實時熒光PCR檢測方法。通過對梯度含量的銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌液樣品DNA和多種細(xì)菌的DNA進(jìn)行實時熒光PCR檢測，來檢測其靈敏度和驗證引物和探針的特異性。試驗結(jié)果表明，只有銅綠假單胞菌產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，其他細(xì)菌無擴(kuò)增，說明引物及TaqMan探針特異性較好，檢測靈敏度為1×103CFU/mL。該方法具有很好的研究價值和應(yīng)用前景。

銅綠假單胞菌；實時PCR；檢測

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aernginosa）又稱綠膿桿菌，屬假單胞菌屬，在自然界分布廣泛，是條件致病菌，在機(jī)體免疫力低下時可引起敗血癥，具有較高的死亡率[1-2]。在日常食品檢測過程中，銅綠假單胞菌未列為常規(guī)項目，但銅綠假單胞菌已被確認(rèn)為食源性和水源性致病菌[3]。銅綠假單胞菌產(chǎn)生的外毒素、腸毒素、致死毒素能夠嚴(yán)重污染食品[4]，在GB 8538-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法》中將銅綠假單胞菌列為致病菌，GB 19298-2014《包裝飲用水》明確規(guī)定每250 mL水樣中銅綠假單胞菌不得檢出。傳統(tǒng)的檢測方法為細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定，該過程時間長同時易受環(huán)境及抗生素的影響。目前，PCR技術(shù)和實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于細(xì)菌和病毒的快速篩查檢測。但是PCR法需要電泳后處理，基于SYBR Green I染料的實時熒光PCR法特異性不強(qiáng)[5]?；赥aqMan探針實時熒光PCR檢測具有、快速、簡便、定量準(zhǔn)確的優(yōu)勢，在病原菌檢測中得到廣泛的應(yīng)用[6-7]。因此本研究旨在采用TaqMan探針實時熒光PCR技術(shù)建立食品中銅綠假單胞菌檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等21株標(biāo)準(zhǔn)菌株購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。試驗用菌株見表1。

1.1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：北京陸橋公司；DNA提取試劑盒：廣州迪奧公司；實時熒光PCR反應(yīng)試劑、Taq酶：寶生物工程（大連）有限公司。

表1 試驗用菌株Table 1 Test strains

1.1.3 主要儀器

QS7 Flex熒光定量PCR儀：美國Applied Biosystems公司；5427R超低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司；BWS-12恒溫水浴：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV2550分光光度計：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 引物及探針的設(shè)計

根據(jù)GenBank中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，用Primer express 3.0設(shè)計一對特異性引物和一個TaqMan探針，探針的熒光標(biāo)記選擇FAM作為報告發(fā)光基團(tuán)，TAMRA為淬滅基團(tuán)。引物探針由大連寶生物公司合成。

表2 實時熒光PCR引物及探針序列Table 2 Nucleotide sequences of primers and probes for fluorescence real-time PCR

1.2.2 模板DNA的提取

將銅綠假單胞菌和其它菌株接種營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，36℃培養(yǎng)24 h。細(xì)菌增菌后，用DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA作為實時PCR的模板，-20℃保存。

1.2.3 實時PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件

實時熒光PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)用各種試劑采用寶生物工程（大連）有限公司的Premix Ex TaqTM（RR390Q）試劑盒，具體各種試劑濃度、體積見表3。

表3 實時熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 3 Amplification reaction system of fluorescence real-time PCR

實時熒光PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)：95℃變性5 s、60℃退火和延伸34 s，共40個循環(huán)。

1.2.4 實時PCR特異性檢測

以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照，以ddH2O為無模板對照驗證實時熒光PCR法檢測銅綠假單胞菌的特異性。

1.2.5 實時PCR靈敏度檢測

采用0.85%生理鹽水將銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株做成菌懸液，對菌懸液進(jìn)行10倍比梯度稀釋，形成梯度含菌量為 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL的菌懸液。對每個稀釋度取1 mL菌懸液進(jìn)行DNA提取，并進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.2.6 實際樣品應(yīng)用

選取市售涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、涼拌蔬菜、醬牛肉、6種礦泉水共10個樣品。拌豬耳朵、涼拌豬肚、涼拌蔬菜、醬牛肉無菌取樣25 g；礦泉水無菌取樣25 mL分別加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)24 h。取增菌液1 mL提取DNA，利用本研究的實時熒光PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 實時熒光PCR特異性檢測結(jié)果

圖1 實時熒光PCR檢測銅綠假單胞菌特異性試驗Fig.1 Specificity detection of fluorescence real-time PCR assay for Pseudomonas aeruginos

以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，以金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌等20株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陰性對照，并用ddH2O為無模板對照證實時熒光PCR法檢測銅綠假單胞菌的特異性。實時熒光PCR檢測銅綠假單胞菌特異性試驗見圖1。

結(jié)果表明，只有銅綠假單胞菌具有擴(kuò)增曲線，其他20株標(biāo)準(zhǔn)菌株無擴(kuò)增曲線。

2.2 實時熒光PCR靈敏性檢測結(jié)果

分別取 1 mL 銅綠假單胞菌 1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL 的菌懸液進(jìn)行 DNA 提取，提取的DNA進(jìn)行熒光定量PCR試驗。銅綠假單胞菌靈敏性試驗見圖2。

圖2 實時熒光PCR檢測銅綠假單胞菌靈敏性試驗Fig.2 Sensitivity detection of qRT-PCR assay for Pseudomonas aeruginos

結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌濃度為1×106、1×105、1×104、1×103CFU/mL 時均有擴(kuò)增曲線，濃度低于 1×103CFU/mL時無擴(kuò)增曲線，該方法檢測的低限為1×103CFU/mL。

2.3 實時PCR實際樣品檢測結(jié)果

對涼拌豬耳朵、涼拌豬肚、涼拌蔬菜、醬牛肉、6種礦泉水共10個樣品的營養(yǎng)肉湯增菌液進(jìn)行DNA提取，以銅綠假單胞菌為陽性對照，進(jìn)行實時熒光PCR試驗，結(jié)果見圖3。

結(jié)果顯示，涼拌豬肚和一種礦泉水中檢測出含有銅綠假單胞菌。

3 結(jié)論與討論

日常食品檢測過程中，銅綠假單胞菌未被列為微生物的常規(guī)檢驗項目。銅綠假單胞菌是一種常見的革蘭氏陰性桿菌，該菌為專性需氧菌，生長溫度范圍25℃～42℃，最適生長溫度為25℃～30℃，極易在水中及含水量較高的食品中存活并繁殖，存活時間長。蔡雙福等[8]對食品中銅綠假單胞菌進(jìn)行監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)熟肉制品、涼拌即食食品、飲用水具有較高的檢出率。食品感染銅綠假單胞菌后，對免疫系統(tǒng)并不健全或是出現(xiàn)免疫缺陷、抵抗力較弱的人群容易引起急性腸道炎、腦膜炎、敗血癥和皮膚炎癥等疾病。因此，非常有必要對食品中銅綠假單胞菌進(jìn)行監(jiān)測及風(fēng)險評估，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低該菌引起食品污染的風(fēng)險。

圖3 實時熒光PCR檢測樣品中銅綠假單胞菌試驗Fig.3 Detection of Pseudomonas aeruginosa in samples by qRT-PCR

薛利軍等[9]曾利用SYBR Green I染料以16S rDNA為目標(biāo)基因構(gòu)建實時熒光PCR檢測銅綠假單胞菌的方法。外毒素A基因在銅綠假單胞菌中高度保守[10]，本研究根據(jù)GenBank中銅綠假單胞菌外毒素A基因片段序列，設(shè)計特異性引物及TaqMan探針，并利用實時熒光PCR技術(shù)，對目標(biāo)靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增。試驗選取銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及其它20種標(biāo)準(zhǔn)菌株，進(jìn)行實時熒光PCR擴(kuò)增，驗證了銅綠假單胞菌引物及探針的特異性。本研究設(shè)計含有不同濃度的銅綠假單胞菌（1×106、1×105、1×104、1×103、1×102CFU/mL） 菌液樣品，試驗得到該檢測方法的低限為1×103CFU/ml。本研究通過反復(fù)摸索，建立了一套檢測食品中銅綠假單胞菌的方法，特異性試驗和靈敏性試驗良好，該檢測方法具有特異、快速的特點，能夠滿足檢測要求，為食品中銅綠假單胞菌的快速檢測奠定了基礎(chǔ)。

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Detection of Pseudomonas aernginosa by Fluorescence Real-time PCR Method

YANG Di，LIU Yan-hong，LIU Cen-jie，XIA Yuan-feng
（DaLian Institute of Food Decetion，Dalian 116600，Liaoning，China）

A fluorescence real-time PCR method was developed to detect the Pseudomonas aernginosa，Species-specific primers and TaqManfluorescent probe were designed by Primer express 3.0 software according to the conserved sequence of Exotoxin Agene of Pseudomonas aernginosa.Different gradient concentrations of Pseudomonas aernginosa DNA and various pathogen DNA were amplified by fluorescent real-time PCR to confirm the specificity and sensitivity of the developed method.Results showed that the amplification curves were expressed from Pseudomonas aernginosa by fluorescence real-time PCR.The sensitivity of fluorescence realtime PCR for Pseudomonas aernginosa was 1×103CFU/mL.This method is valuable for research and application prospects.

Pseudomonas aernginosa；fluorescence real-time PCR；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.030

楊滴（1983—），男（漢），高級工程師，碩士，主要從事食品安全檢測工作。

2017-02-23