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    紅樹莓果醋自然發(fā)酵和純種發(fā)酵的香氣成分分析

    2017-11-03 16:25:10張強于雪蓮陳亮辛秀蘭常莉聞怡張海婷
    食品研究與開發(fā) 2017年21期
    關(guān)鍵詞:果醋純種樹莓

    張強,于雪蓮,陳亮,辛秀蘭,常莉,聞怡,張海婷

    (北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院,北京100029)

    紅樹莓果醋自然發(fā)酵和純種發(fā)酵的香氣成分分析

    張強,于雪蓮,陳亮*,辛秀蘭,常莉,聞怡,張海婷

    (北京電子科技職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院,北京100029)

    采用單因素試驗優(yōu)化頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro extraction,HS-SPME)條件,并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)聯(lián)用技術(shù),分析紅樹莓果醋自然發(fā)酵和純種發(fā)酵的香氣成分。結(jié)果表明:經(jīng)GC-MS分析兩種不同工藝紅樹莓果醋共鑒定出84種香氣成分,32種是兩者共有的,兩種紅樹莓果醋的主要香氣成分都為苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸乙酯、α-紫羅蘭酮和β-紫羅蘭酮,自然發(fā)酵相對含量分別為26.12%、9.91%、8.51%、5.64%和4.09%,純種發(fā)酵相對含量分別為22.39%、3.43%、32.68%、3.32%和2.81%。此外,根據(jù)感官評價,純種發(fā)酵的果醋優(yōu)于自然發(fā)酵,醋香濃郁,色澤飽滿,口感綿延柔和,更具紅樹莓果醋典型性風(fēng)味。

    固相微萃??;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù);紅樹莓果醋;香氣成分

    紅樹莓(Red raspberry)為薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus),是多年生落葉灌木,適應(yīng)能力強,在-40℃~40℃能夠正常生長,抗病蟲能力強,并且抗旱、抗瘠薄[1]。紅樹莓又名木莓、托盤、覆盆子等,富含多種功能因子,研究證明,高含量的樹莓酮通過激活皮膚感覺神經(jīng)元IGF-I達到促進頭發(fā)生長,具有增加皮膚彈性的作用[2]。不僅如此,樹莓酮可以提高去甲基腎上確定釀制果醋的最佳工藝條件,為紅樹莓果醋的加工利用提供了理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    紅樹莓果:北京匯源責(zé)任有限公司;醋酸桿菌(編號:20056)、釀酒酵母(編號:1399):中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院;果膠酶(30 000 U/g):北京衛(wèi)諾恩生物技術(shù)有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    豪威斯AR5120型電子天平:北京天平醫(yī)用廠;DK-98-I電子恒溫水浴鍋:余姚市東方電子儀器廠;SW-LJ-2FD超凈工作臺:上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;7890A/5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國安捷倫公司;WF32精密色差儀:深圳市威福光電科技有限公司;UV-1800紫外可見分光光度計:北京彭曼科技有限責(zé)任公司;SG280C1榨汁機:浙江蘇泊爾股份有限公司;手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋:上海中安醫(yī)療機械廠;J0050024生化培養(yǎng)箱:上海?,攲嶒炘O(shè)備有限公司。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 純種發(fā)酵工藝流程

    腺素誘導(dǎo)脂肪細胞分解進而減少甘油三酯的含量,被美國人稱之為“生命之果”[3]。

    19世紀80年代,俄羅斯華僑將樹莓的優(yōu)良品種引入中國,經(jīng)過東北農(nóng)業(yè)大學(xué)的選育,培養(yǎng)出“美國22”號和“澳洲紅”兩個品種,之后經(jīng)過試驗研究,開發(fā)出“赫爾梯茲”,“圖拉米”和“菲爾都德”,品種優(yōu)良,果實豐滿,產(chǎn)量高,至今仍被大量種植[4]。紅樹莓產(chǎn)量自1970年的250 t到2008年的10 000 t,發(fā)展十分迅速,但由于樹莓果實成熟期長,漿果容易破碎,機械收割困難,勞動成本過高,嚴重制約紅樹莓的開發(fā)利用。目前,我國紅樹莓仍采用人工采收方式以供鮮食,但大量的采后果品在運輸,儲藏過程中會腐爛變質(zhì),帶來不必要的損失[5]。因此紅樹莓的深加工產(chǎn)品成為發(fā)展方向,目前北方部分地區(qū)通過果實表面自帶的醋酸菌進行自然發(fā)酵制得果醋,本文重點研究自然發(fā)酵與純種發(fā)酵工藝的感官性狀優(yōu)劣程度,進而開發(fā)出優(yōu)異的果醋,豐富市場產(chǎn)品種類。

    紅樹莓果醋兼有紅樹莓和果醋的雙重價值,具有減輕疲勞,防止動脈硬化,降低血壓,腸胃保健等作用[6]。本試驗運用自然發(fā)酵和純種發(fā)酵2種工藝釀制紅樹莓果醋產(chǎn)品,在此條件下研究紅樹莓果醋在香氣成分方面的不同,以及營養(yǎng)價值和感官性狀的異同,

    1.3.2 工藝要點

    1.3.2.1 原料處理

    挑選成熟、飽滿、色澤鮮艷、無蟲害,無霉爛變質(zhì)的紅樹莓。

    1.3.2.2 破碎,酶解

    將清洗好的紅樹莓果實打漿,為提高出汁率,按50 mg/L添加果膠酶,45℃保溫酶解3.0 h。

    1.3.2.3 成分調(diào)整

    添加白砂糖調(diào)整糖度為18%,使其滿足酵母發(fā)酵的需求。

    1.3.2.4 滅酶,滅菌

    酶解后的紅樹莓果汁在80℃保溫20 min,達到滅酶、滅菌的目的。

    1.3.2.5 酒精發(fā)酵

    將在紅樹莓果汁中馴化后的果酒酵母1969按照果汁量3%接種,30℃,發(fā)酵10 d。

    1.3.2.6 醋酸發(fā)酵

    將在紅樹莓果汁中馴化后的醋酸桿菌20056按照果汁量9%接種,28℃,發(fā)酵10 d。

    1.3.2.7 陳釀

    將醋酸發(fā)酵好的紅樹莓果醋置于14℃,陳釀60 d。

    1.3.2.8 澄清過濾

    用皂土和殼聚糖進行澄清后,通過醋酸纖維膜過濾,提高紅樹莓果醋的穩(wěn)定性和透明度。

    1.3.2.9 灌裝滅菌

    將過濾后的紅樹莓果醋裝入瓶中滅菌。

    1.3.3 自然發(fā)酵

    與1.3.1純種發(fā)酵的區(qū)別在于無1.3.2.5酒精發(fā)酵,醋酸發(fā)酵為20 d,其余工藝要點與1.3.2相同。

    1.4 方法

    1.4.1 多酚的測定

    參考趙金梅的方法[7]略有改動,采用福林酚比色法測定總多酚的含量。以沒食子酸的濃度x為橫坐標,以吸光度值y為縱坐標繪制標準曲線,擬合的回歸方程曲線為y=8.112 0x-0.055 8,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4??偠喾雍浚╩g/100 mL)=回歸濃度×稀釋倍數(shù)×100

    1.4.2 黃酮的測定

    參考白立敏的方法[8]略有改動,采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定總黃酮的含量。以蘆丁的濃度x為橫坐標,以吸光度值y為縱坐標繪制標準曲線,擬合的回歸方程曲線為y=1.818 5x+0.030 1,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4。總黃酮含量(mg/100 mL)=回歸濃度×100

    1.4.3 花色苷的測定

    參考張強的方法[9],采用pH示差法測定花色苷的含量。

    花色苷含量/(mg/100 mL)=A×MW×DF×V×1 000×0.1/εLWt

    式中A為吸光度;ε為矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù),26 900;L為比色皿光程,1 cm;MW為矢車菊-3-葡萄糖苷分子量,449.2;DF為稀釋因子;V為最終體積,mL;Wt為產(chǎn)品重量,g。

    1.4.4 色度的測定

    吸取10 mL發(fā)酵液置于色差儀樣品杯中,每隔10 s測定其色度值,直至穩(wěn)定,記錄其數(shù)值(L*、a*、b*)。精密色差儀使用前用白板調(diào)白平衡,用黑板調(diào)黑平衡。

    1.4.5 氣質(zhì)分析

    1.4.5.1 紅樹莓果醋香氣成分萃取

    取10 mL紅樹莓果醋樣品置于50 mL的錐形瓶中,加入0.35 g/mL NaCl,置于45℃水浴中平衡30 min,插入萃取針,頂空萃取50 min后,將萃取針插入GC進樣口,將萃取針頭解析5 min[10]。

    1.4.5.2 氣相色譜條件

    色譜柱 DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進樣口溫度:250℃;升溫程序以50℃保持5 min,以5℃/min升到80℃,然后以8℃/min升到120℃,然后以10℃/min升到230℃,保持2 min;載氣:高純He;柱溫50℃;氣體流量1.0 mL/min。

    1.4.5.3 質(zhì)譜條件

    MS四級桿溫度150℃;離子源溫度230℃;離子源:EI;電子能量:70 eV;掃描范圍:35 amu~625 amu;對采集到的質(zhì)譜圖利用NIST08.L譜庫進行檢索,并用氣相色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分在2個樣品中的相對含量。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 萃取條件優(yōu)化試驗

    2.1.1 萃取溫度對萃取效果的影響

    固相微萃取是處理樣品比較敏感的方法,萃取溫度對香氣成分的吸附有較大的影響[11]。本試驗采用萃取溫度單因素試驗,在NaCl添加量為0.35 g/mL,萃取時間為 50 min,分別在 25、35、45、55、65 ℃進行萃取結(jié)果見圖1。

    圖1 不同萃取溫度對萃取效果的影響Fig.1 The effect of different extraction temperatures

    由圖1可知,色譜峰總面積與香氣成分種類變化趨勢相同,在45℃之前,隨著萃取溫度升高,色譜總峰面積也隨之增大,當萃取溫度升高至55℃時的總峰面積開始減小,當溫度升到65℃時的總峰面積開始增大,與45℃相比較峰面積較大,但檢出的柱流失成分較多,色譜圖拖尾較多,此結(jié)果可以看出萃取溫度對香氣成分吸附的影響有一定波動,確定45℃為最佳萃取溫度。

    2.1.2 萃取時間對萃取效果的影響

    在NaCl添加量為0.35 g/mL,萃取溫度為45℃,吸附時間分別為 5、20、35、50、65 min 進行萃取見圖 2。

    圖2 不同萃取時間對萃取效果的影響Fig.2 The effect of different extraction times

    由圖2可知,色譜峰總面積與香氣成分種類變化趨勢相同,隨著萃取時間的增加,總的香氣成分種類與色譜峰總面積也隨之增大,萃取時間為5 min時,檢測出的化合物最少,當萃取時間超過50 min時,香氣成分種類與色譜峰總面積上升幅度變小,萃取時間過長,會減少固相微萃取頭的使用效率,增加水蒸汽的吸附,進而增大柱流失,故確定最佳萃取時間為50 min。

    2.1.3 氯化鈉添加量對萃取效果的影響

    在樣品中添加氯化鈉的量分別是0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 g/mL,萃取時間為50 min,萃取溫度為45℃條件下進行萃取結(jié)果見圖3。

    圖3 不同氯化鈉添加量對萃取效果的影響Fig.3 The effect of the contents of NaCl

    由圖3可以看出,隨著添加量的增加,香氣成分種類隨之增大,并趨于平衡;色譜峰總面積變化趨勢較穩(wěn)定,這與NaCl的溶解度有關(guān),為促進液體樣品揮發(fā)性成分的析出,往往通過添加NaCl來增加鹽析效應(yīng),促進香氣成分揮發(fā),NaCl在水中的溶解度為0.36 g/mL~0.37 g/mL(環(huán)境溫度為20℃~50℃),可以確定溶液是否為飽和狀態(tài)對香氣成分的揮發(fā)有很重要的作用,由此可見溶液的過飽和狀態(tài)對香氣成分的吸附影響不大,故確定最佳NaCl添加量為0.35 g/mL。

    2.2 GC-MS分析

    兩種不同發(fā)酵工藝條件的紅樹莓果醋香氣成分見表1。

    表1 兩種不同發(fā)酵工藝條件的紅樹莓果醋香氣成分Table 1 The aromatic compositions of red raspberry vinegar fermented with different fermentation processes

    續(xù)表1 兩種不同發(fā)酵工藝條件的紅樹莓果醋香氣成分Continue table 1 The aromatic compositions of red raspberry vinegar fermented with different fermentation processes

    續(xù)表1 兩種不同發(fā)酵工藝條件的紅樹莓果醋香氣成分Continue table 1 The aromatic compositions of red raspberry vinegar fermented with different fermentation processes

    采用HP-SPME和GC-MS技術(shù)在2種醋樣中共鑒定出84種香氣成分,這些成分主要是酯類19種、醇類15種、烷類8種、酮類9種、醛類3種、烯類7種、其他類23種。在自然發(fā)酵的紅樹莓果醋中,共檢測出58種香氣成分,其中酯類22.44%、醇類42.07%、烷類0.46%、酮類11.7%、醛類1.41%、烯類2.11%、其他類6.17%。在純種發(fā)酵的紅樹莓果醋中,共檢測出58種香氣成分,其中酯類44.03%、醇類31.28%、烷類7.89%、酮類7.49%、醛類1.40%、烯類0.81%、其他類1.88%。

    2.3 自然發(fā)酵和純種發(fā)酵的紅樹莓果醋主要香氣成分比較

    2.3.1 酯類組分的比較

    2種紅樹莓果醋中共檢測出酯類物質(zhì)19種,2種醋共有的9種。自然發(fā)酵的酯類物質(zhì)的相對含量達到22.44%,主要是乙酸乙酯、苯甲酸乙酯;純種發(fā)酵中酯類物質(zhì)的相對含量達到44.03%,主要是乙酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸戊酯、苯甲酸乙酯。其中乙酸乙酯在2種醋中的含量很高,相對含量分別為8.52%、32.68%,乙酸乙酯是白酒和醋中的主要香氣成分[12],因此經(jīng)過酒精發(fā)酵的純種發(fā)酵法含量相對高一些。其次是苯甲酸乙酯,具有濃烈的花香,并帶有水果的清香氣味[13]。純種發(fā)酵法酯類物質(zhì)的含量高于自然發(fā)酵,酯類物質(zhì)也是果醋重要的風(fēng)味化合物。

    2.3.2 醇類組分的比較

    2種紅樹莓果醋中共檢測出醇類物質(zhì)15種,2種醋共有的8種,主要為苯乙醇、異戊醇、α-松油醇、芳樟醇、苯甲醇,兩種醋中含量最高的都是苯乙醇,其中自然發(fā)酵的含量最多為26.12%,純種發(fā)酵的為22.39%,一般醇類香氣成分都會有刺鼻的氣味,會給產(chǎn)品帶來一定的負作用,苯乙醇有宜人的茉莉花香,玫瑰香,給人以愉悅的感覺,是果味食品香精中重要的協(xié)調(diào)劑,說明苯乙醇是紅樹莓果醋中主要的物質(zhì)之一[14]。

    2.3.3 酮類組分的比較

    2種紅樹莓果醋中共檢測出酮類物質(zhì)9種,其中自然發(fā)酵的酮類物質(zhì)的相對含量達到11.698 1%,純種發(fā)酵為7.491%,2種醋共有的6種,分別是大馬酮、α-紫羅酮、4-叔丁基苯丙酮、二氫-β-紫羅蘭酮、3,5-二甲氧基苯乙酮、β-紫羅蘭酮。其中α-紫羅酮的相對含量分別為5.64%,3.32%,β-紫羅蘭酮相對含量次之分別為4.09%,2.81%,自然發(fā)酵法中的含量均高于純種發(fā)酵法,說明自然發(fā)酵法能夠更好地保留紅樹莓特征性氣味,二者都具有木香、花香、果香的特點,是樹莓漿果中呈典型性的香氣成分[15]。

    2.3.4 烷類組分的比較

    2種紅樹莓果醋中共檢測出烷類物質(zhì)8種,2種醋共有的1種,為十四烷,相對含量分別為0.255%、0.1328%。大多數(shù)烷烴類揮發(fā)性化合物沒有氣味,故忽略其香氣作用。

    2.3.5 其他組分的比較

    2種紅樹莓果醋中共檢測出其他物質(zhì)23種,2種醋共有的 4 種,分別為樟腦、1,2-二氫-1,1,6-三甲基萘、2,4-二叔丁基苯酚、2,2',5,5'-四甲基聯(lián)苯基。其他物質(zhì)的相對含量自然發(fā)酵達到6.17%,純種發(fā)酵為1.88%。

    2.4 紅樹莓果醋評價分析

    2.4.1 紅樹莓果醋營養(yǎng)及感官指標分析

    紅樹莓果醋樣品分析見表2。

    表2 紅樹莓果醋樣品分析Table 2 The analysis of red raspberry vinegar

    多酚、黃酮、花色苷是紅樹莓中重要的營養(yǎng)物質(zhì)和功能因子,具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗心血管疾病等功能,三者成分在釀醋過程中的保留程度是評價果醋營養(yǎng)性的重要指標[16-17]。由表2可知,多酚、黃酮、花色苷3種物質(zhì)在經(jīng)過純種發(fā)酵后保留的程度更高,均高于自然發(fā)酵的樣品。純種發(fā)酵后制得的果醋樣品亮度值、紅度值、黃度值均比自然發(fā)酵的高,更好的保留了紅樹莓原有的色澤。受醋酸菌對乙醇轉(zhuǎn)化效率的影響[18],純種發(fā)酵后醋酸含量略低于自然發(fā)酵的樣品。

    2.4.2 紅樹莓果醋的感官評價結(jié)果

    色香味形質(zhì)是食品感官性狀的基本元素,也是消費需求的重要指標,對于果醋來說,香氣是最重要的影響因素,所以對紅樹莓果醋的各種香氣成分特征組分的鑒定還需有人體嗅覺感官分析的參與才能夠完成[19]。試驗中選出10個嗅覺感官評定員,在身體狀態(tài)良好,其他條件都相同的情況下,評審員的培訓(xùn)和要求參照GB/T10220《感官分析方法學(xué)總論》[20]標準。感官評價標準見表3、表4。

    表3 紅樹莓果醋感官評分標準Table 3 The sensory evaluation standards of red raspberry vinegar

    表4 果汁發(fā)酵和帶渣發(fā)酵的果酒感官評價表Table 4 The sensory evaluation of red raspberry vinegars

    根據(jù)感官評分分數(shù)純種發(fā)酵的果醋感官評分為87.92分,自然發(fā)酵的果醋82.14分,結(jié)合表1頂空-固相微萃取法(HS-SPME)和質(zhì)譜-氣相色譜聯(lián)用儀(GC-MS)香氣成分分析結(jié)果,表2紅樹莓果醋樣品營養(yǎng)指標分析結(jié)果綜合評價。純種發(fā)酵法制得的紅樹莓果醋酸味適宜,醋香濃郁,色澤飽滿,口感綿延,除產(chǎn)酸量略低外,其余感官性狀均優(yōu)于自然發(fā)酵法,較好的保持了紅樹莓果醋的典型性風(fēng)格。

    3 討論

    本文采用頂空固相微萃取法,通過試驗研究表明最佳萃取條件為:萃取溫度45℃,萃取時間50 min,NaCl添加量0.35 g/mL。通過GC-MS分析自然發(fā)酵和純種發(fā)酵的紅樹莓果醋的香氣成分,并用氣相色譜峰面積歸一化定量計算出各香氣成分在兩種醋樣中的相對含量,兩種醋之間的香氣含量差別較大,主要體現(xiàn)在二者共有的香氣成分,主要是苯乙醇、苯甲酸乙酯、乙酸乙酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮,自然發(fā)酵相對含量分別為 26.12%、9.91%、8.51%、5.64%、4.09%;純種發(fā)酵的相對含量分別為22.39%、3.43%、32.68%、3.31%、2.81%,苯乙醇是香精香料中重要的協(xié)調(diào)劑,二者相差不大,α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮能夠賦予紅樹莓典型性氣味,純種發(fā)酵法略低,苯甲酸乙酯、乙酸乙酯是果醋中主要的呈香物質(zhì),決定著果醋醋香的重要指標。在營養(yǎng)指標方面,純種發(fā)酵法保留的多酚、黃酮、花色苷營養(yǎng)物質(zhì)更多,色澤更加飽滿。此外,由于香氣成分種類多,成分復(fù)雜,各成分間相互作用激烈,使香氣成分的變化都會影響果醋的風(fēng)味,所以評價一種醋的香氣特征,不僅要通過儀器測定還應(yīng)該結(jié)合人的感官分析。在感官評價方面,自然發(fā)酵法果香高于純種發(fā)酵法,但醋香遠不及純種發(fā)酵濃郁的特點。純種發(fā)酵經(jīng)過酒精發(fā)酵乙醇的產(chǎn)出,大大增加了醋體中的酯類香氣成分,口感更加飽滿醇厚,醋香濃郁,回味綿長,總體上純種發(fā)酵的果醋感官評分87.92分,自然發(fā)酵果醋感官評分82.14分。由此,通過儀器測定和感官評價綜合分析得出,純種發(fā)酵的果醋優(yōu)于自然發(fā)酵后的果醋,純種發(fā)酵的果醋酸味適宜,醋香濃郁,色澤飽滿,口感綿延柔和,香氣持久,更具紅樹莓典型性風(fēng)味。

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    Analysis on Aromatic Compositions of Red Raspberry Vinegar Fermented with Nature and Pure Breed

    ZHANG Qiang,YU Xue-lian,CHEN Liang*,XIN Xiu-lan,CHANG Li,WEN Yi,ZHANG Hai-ting
    (College of Bioengineering,Beijing Polytechnic,Beijing 100029,China)

    The aromatic compositions of red raspberry vinegar fermented with one step and two steps under two different fermentation processes were analyzed by headspace solid-phase micro-extraction(HS-SPME)coupled to gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS).The results showed that a total of 84 kinds of aroma components were identified under the two different vinegar-making processes.32 kinds of aroma components were detected in vinegars fermented nature and pure breed.The main aroma components in two red raspberry vinegars were benzene ethanol,benzoic acid ethyl ester,ethyl acetate,α-ionone and β-ionone of which,the relative contents of nature fermented vinegar were 26.12%,9.91%,8.51%,5.64%and 4.09%respectively,and the relative contents of pure breed fermented vinegar were 22.39%,3.43%32.68%,3.32%and 2.81%respectively.According to the sensory evaluation,the vinegar fermented with pure breed fermentation was superior to that the vinegar fermented with nature fermentation.Nature fermented red raspberry vinegar was clear and transparent,the color was full,the taste was mellow and soft,the fragrance was lovely and lasting,and of more red raspberry vinegar typical flavor.

    solid-phase micro-extraction(SPME);gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);red raspberry vinegar;aromatic compositions

    10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.023

    北京電子科技職業(yè)學(xué)院科研團隊項目(TD201602);北京市教委科技計劃面上項目(KM201510858001);促進高校內(nèi)涵建設(shè)-教育教學(xué)類-大學(xué)生科研訓(xùn)練(CJGX2016-JX-07)

    張強(1988—),男(漢),講師,碩士,主要從事小漿果深加工研究。

    *通信作者:陳亮(1986—),男,副教授,博士,研究方向:小漿果資源研究及產(chǎn)品推廣。

    2017-02-26

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