基于單克隆抗體的玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法研究

劉琦，生威，李志，李詩(shī)潔，張燕，王碩

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

基于單克隆抗體的玉米赤霉烯酮檢測(cè)方法研究

劉琦，生威，李志，李詩(shī)潔，張燕，王碩*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）

建立一種檢測(cè)谷物樣品中玉米赤霉烯酮的酶聯(lián)免疫分析方法。將玉米赤霉烯酮修飾羧基制得半抗原，再與鑰孔嘁血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合與篩選，得到3株具有高親和力和特異性的雜交瘤細(xì)胞，分別為2E8、2C7、6E11，重鏈類型均為IgG1，輕鏈類型均為Kappa。細(xì)胞株2E8分泌的抗體特異性較好，制備腹水得到單克隆抗體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。建立檢測(cè)玉米赤霉烯酮的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法，方法的靈敏度（IC50）為（0.13±0.02）ng/mL，檢測(cè)限（IC15）為（0.02±0.01）ng/mL，在玉米和燕麥中的檢出限分別為2.4 μg/kg，4.0 μg/kg。加標(biāo)回收率為82.80%～109.20%，變異系數(shù)為3.27%～15.38%。經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀驗(yàn)證（R2=0.996 3）二者具有良好的相關(guān)性。

玉米赤霉烯酮；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是由禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、木賊鐮刀菌、粉紅鐮刀菌等產(chǎn)生的一種真菌毒素[1]。ZEN具有雌激素活性，造成動(dòng)物體內(nèi)生殖激素紊亂，嚴(yán)重影響動(dòng)物的繁殖機(jī)能[2-5]。我國(guó)GB 2761-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》規(guī)定[6]：谷物及其制品中，ZEN限量為60 μg/kg。

目前，檢測(cè)ZEN的方法主要有色譜法和免疫分析法[7]?；谏V檢測(cè)的方法如高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）[8-9]以及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（High performance liquid chromatography-Mass sepectrum，HPLC-MS）[10-11]等方法具有準(zhǔn)確度好，靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用于食品中有害小分子物質(zhì)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室確證方法。免疫分析法主要包括酶聯(lián)免疫吸附法[12]、膠體金免疫層析法[13-14]以及免疫生物傳感器技術(shù)[15-18]，具有高特異性、靈敏性，不需要貴重儀器，可以大大簡(jiǎn)化前處理過(guò)程，在現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)以及批量篩選中具有重要意義[19]。王元?jiǎng)P等[20]制備ZEN單克隆抗體并建立一種間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）方法。方法的靈敏度為1.90μg/kg，檢測(cè)限為0.051μg/kg。祭芳等[21]制備ZEN單克隆抗體，腹水效價(jià)大于1×10-6，抗體靈敏度為225 ng/mL。Sun等[22]經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合，得到四株特異識(shí)別玉米赤霉烯酮的單克隆抗體。選擇最為靈敏的細(xì)胞株4A3-F9（IC50=1.115 ng/mL）進(jìn)行ELISA方法的建立，方法回收率為91.30～97.07%。Pei等[23]通過(guò)高通量酶聯(lián)免疫分析對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選，制備的抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體靈敏度IC50=1.79 ng/g，檢測(cè)限為IC15=0.1 ng/g，對(duì)玉米樣品進(jìn)行了測(cè)定，方法回收率為80%～128%。

本研究使用單克隆抗體技術(shù)，得到抗玉米赤霉烯酮的單克隆抗體，并建立一種用于檢測(cè)谷物中玉米赤霉烯酮的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）標(biāo)準(zhǔn)品、鑰孔嘁血藍(lán)蛋白（Keyhole limpet hemocyanin，KLH）、弗氏完全佐劑（Freund's complete adjuvant）、弗氏不完全佐劑（Freund's incomplete adjuvant）、N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）：美國(guó) Sigma公司；羧甲基羥胺、無(wú)水吡啶：法國(guó)阿法埃莎公司；Free DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT、HT：美國(guó)GIBCO公司；MycoSep 226凈化柱：美國(guó)Romer公司；甲醇（色譜純）：德國(guó)Merck公司；其他所有試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

玉米、燕麥樣品購(gòu)自天津某超市，經(jīng)高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析為陰性樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

Mycosep226凈化柱：美國(guó)Romer公司；酶標(biāo)儀、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡：日本NIKON公司；液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）和Agilent MassHunter工作站）：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雌性BALB/c小鼠：北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院；骨髓瘤細(xì)胞為Sp2/0細(xì)胞：天津科技大學(xué)教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 方法

1.4.1 人工抗原的合成

玉米赤霉烯酮半抗原的制備方法參照文獻(xiàn)[24]并改進(jìn)，步驟如下：稱取10 mg玉米赤霉烯酮于圓底燒瓶中，加入200 μL甲醇使其溶解。加入20 mg羧甲基羥胺（Carboxymethoxylamine，CMO），1 mL無(wú)水吡啶，氬氣保護(hù)下室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后50℃真空干燥除去吡啶，4℃保存待用。

免疫抗原的制備參照方法[12]并改進(jìn)，步驟如下：稱取上述所得半抗原9.78 mg和EDC 14 mg，加入1 mL DMF溶液，攪拌并4℃活化過(guò)夜。將10 mg KLH溶于2 mL碳酸氫鈉緩沖液（130 mmol/L，pH=8.1），在冰浴中逐滴加入活化產(chǎn)物，室溫下反應(yīng)2 h后在4℃下反應(yīng)過(guò)夜。將產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffercd saline，PBS）溶液透析72 h，測(cè)定其濃度并分裝，凍存于-20℃。包被抗原（Zearalenone-ovalbumin，ZEN-OVA）的制備方法同免疫原。

1.4.2 單克隆抗體的制備

將免疫原100 μg與等體積的弗式完全佐劑混合均勻（加強(qiáng)免疫使用弗氏不完全佐劑）免疫動(dòng)物。分別于第2、3、4次免疫后8 d～10 d在小鼠尾動(dòng)脈處取血，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。沖刺免疫后取脾細(xì)胞與Sp2/0融合，采用有限稀釋法3次克隆化，得到能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株。采用辛酸-硫酸銨法純化單克隆抗體腹水，并使用亞型鑒定試劑盒對(duì)所產(chǎn)抗體的亞型進(jìn)行鑒定。

1.4.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法

在 37℃下，將 100 μL 的包被抗原（1 μg/孔）加入到聚苯乙烯酶標(biāo)板上，孵育3 h。棄去孔中液體，用0.05%吐溫20-磷酸鹽緩沖液（phosphate bufferad sahne mith 0.05%tween 20，PBST） 洗液洗板 3 次 （250 μL/孔），拍干；使用 0.5%脫脂乳粉溶液（200 μL/孔）對(duì)微孔進(jìn)行封閉1 h，PBST洗液洗板3次；實(shí)驗(yàn)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品（50 μL/孔），對(duì)照孔加入等量的 PBS，同時(shí)加入用PBS緩沖液梯度稀釋的抗血清（50 μL/孔），孵育1 h，PBST洗液洗板4次；加入用PBS緩沖液稀釋10 000倍的羊抗鼠酶標(biāo)二抗（100 μL/孔），孵育30 min，PBST 洗液洗板 5次；加入底物液（100 μL/孔），反應(yīng) 15 min～20 min；加入終止液（50 μL/孔）終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)（450、650nm）下，讀取吸光值。

1.4.4 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

設(shè)定 ZEN標(biāo)準(zhǔn)品濃度值分別為10、3.33、1.11、0.37、0.123、0.041、0.013 7、0.004 6、0 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0時(shí)的吸光值設(shè)為B0，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值設(shè)為B，空白對(duì)照的吸光值設(shè)為B空白，抑制率計(jì)算公式為：1-[（B-B空白）/（B0-B空白）]×100%。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。

1.4.5 抗體特異性的測(cè)定

選擇幾種常見的真菌毒素以及玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)類似物測(cè)定交叉反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)抗體特異性。交叉反應(yīng)率（cross-reactivity，CR%）計(jì)算公式如下：

1.4.6 甲醇含量對(duì)ELISA反應(yīng)體系的影響

谷物樣品的提取需要使用甲醇作為提取液。配制濃度為0%、1%、5%、10%、20%、40%的甲醇/PBS溶液作為樣品稀釋液進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA，考察有機(jī)試劑含量對(duì)ELISA體系的影響。

1.4.7 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的驗(yàn)證

1.4.7.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18液相色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：甲醇 ∶0.05%氨水=50∶50（體積比）；載氣流速 0.2 mL/min，進(jìn)樣量 1 μL；柱溫箱溫度：25℃。

1.4.7.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI-）；碰撞能量25 V；毛細(xì)管電壓140 V；母離子m/z 317.36；子離子m/z 131.1；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流速：10 L/min。

1.4.8 實(shí)際樣品測(cè)定

間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法谷物樣品處理方法：

樣品處理方法參照文獻(xiàn)[25]并改進(jìn)，方法如下：準(zhǔn)確稱取5 g谷物樣品，粉碎后加入20 mL70%甲醇-水溶液，劇烈震蕩2 min，10 000 r/min離心15 min，取上清用PBS稀釋后測(cè)定。向玉米樣品中分別添加玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品5、10、20 μg/kg，向燕麥樣品中分別添加15、25、50 μg/kg，計(jì)算回收率以及變異系數(shù)。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法谷物樣品處理方法：

樣品處理方法參照文獻(xiàn)[26]并改進(jìn)，方法如下：準(zhǔn)確稱取2 g谷物樣品，粉碎后加入10 mL70%甲醇-水溶液，劇烈震蕩2 min，10 000 r/min離心15 min，使用MycoSep 226多功能凈化柱進(jìn)行凈化。氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑，取1 mL甲醇復(fù)溶試管底部殘?jiān)芤航?jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后進(jìn)行分析。加標(biāo)回收方法同間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法谷物樣品處理方法，并比較兩種方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞篩選及亞型鑒定

對(duì)4只小鼠進(jìn)行免疫，經(jīng)測(cè)定均有免疫應(yīng)答。小鼠4經(jīng)免疫后效價(jià)達(dá)到1∶128 000，對(duì)100 ng/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品抑制率達(dá)到83.2%，因此選擇小鼠4進(jìn)行細(xì)胞融合。本次細(xì)胞融合獲得3株雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)測(cè)定重鏈類型均為IgG1；輕鏈類型均為Kappa。純化腹水并進(jìn)行特異性測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 單克隆抗體特異性及亞型測(cè)定Table 1 The sensitivity and isotype of monoclonal antibody

2.2 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

選擇細(xì)胞株2E8分泌的單克隆抗體建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。ELISA方法工作條件為：包被抗原包被量為0.01 μg/孔，抗體稀釋4萬(wàn)倍，采用0.01 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液來(lái)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，得到玉米赤霉烯酮的間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。方法靈敏度IC50=（0.13±0.02）ng/mL，檢測(cè)限 IC15=（0.02±0.01）ng/mL。

圖1 ZEN間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ZEN by ic-ELISA

2.3 抗體特異性測(cè)定

交叉反應(yīng)測(cè)定結(jié)果見表2。制備的玉米赤霉烯酮單克隆抗體與其他真菌毒素幾乎無(wú)交叉，說(shuō)明抗體的特異性較好。與4種結(jié)構(gòu)類似物均有交叉，與玉米赤霉酮交叉較小。由于此結(jié)構(gòu)類似物是由玉米赤霉烯酮代謝產(chǎn)生，且均有毒性，因此，本次制備的抗體可實(shí)現(xiàn)對(duì)這4種結(jié)構(gòu)類似物的檢出。

表2 抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)Table 2 Cross-reactivity of anti-ZEN monoclonal antibody with mycotoxin

2.4 甲醇含量對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的影響

甲醇含量對(duì)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的影響結(jié)果見圖2。

圖2 甲醇含量對(duì)間接ELISA的影響Fig.2 The influence of methanol on ic-ELISA

當(dāng)甲醇含量低于5%時(shí)，對(duì)ELISA反應(yīng)影響較小。甲醇含量大于5%時(shí)影響抗原抗體反應(yīng)，降低ELISA反應(yīng)的靈敏度。尤其是當(dāng)甲醇超過(guò)20%時(shí)，靈敏性顯著降低。因此，當(dāng)甲醇含量低于5%時(shí)，可認(rèn)為對(duì)ELISA體系影響較小。

2.5 樣品基質(zhì)影響及消除

對(duì)樣品提取液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定能夠消除基質(zhì)影響的最適稀釋倍數(shù)，結(jié)果見圖3。

圖3 樣品提取液稀釋倍數(shù)對(duì)ELISA反應(yīng)的影響Fig.3 The influence of dilution multiple of sample extraction buffer on ic-ELISA

由圖3可知，玉米樣品提取液稀釋30倍，燕麥樣品提取液稀釋50倍后進(jìn)行測(cè)定可以基本消除基質(zhì)影響，且此時(shí)甲醇含量不超過(guò)5%。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

樣品測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 樣品添加回收試驗(yàn)（n=3）Table 3 Recovery test in samples（n=3）

可知間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的加標(biāo)回收率在82.80%～109.20%之間，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的加標(biāo)回收率在76.20%～103.00%。經(jīng)過(guò)比較二者線性相關(guān)系數(shù)值R2為0.996 3，兩種方法檢測(cè)的結(jié)果較為一致，說(shuō)明ELISA方法較為準(zhǔn)確。根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)可以得出間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法在玉米和燕麥中的檢出限分別為 2.4 μg/kg，4.0 μg/kg。

3 結(jié)論

本研究經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合與篩選得到3株能夠特異性分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，對(duì)玉米赤霉烯酮均具有高度特異性。選擇最優(yōu)細(xì)胞株建立檢測(cè)玉米赤霉烯酮的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）方法。方法的靈敏度（IC50）為（0.13±0.02）ng/mL，檢測(cè)限（IC15）為（0.02±0.01）ng/mL，在玉米和燕麥中的檢出限分別為 2.4 μg/kg，4.0 μg/kg。經(jīng)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法驗(yàn)證二者相關(guān)性良好，方法操作簡(jiǎn)單且靈敏，可用于檢測(cè)多種谷物中的玉米赤霉烯酮含量。

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Study on Immunoassay for the Detection of Zearaleone Based on Monoclonal Antibody

LIU Qi，SHENG Wei，LI Zhi，LI Shi-jie，ZHANG Yan，WANG Shuo*
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

The aim of this research was to develop an enzyme linked immunosorbent assay to detect zearalenone in grain samples.Three hybridoma cells named 2E8，2C7，6E11 were obtained after cell fusion and filtering by immunizing Balb/c mouses with conjugate of ZEN and keyhole limpet hemocyanin.The subtypes of three monoclonal antibody were identified with IgG1 for heavy chain and Kappa for light chain.The cell 2E8 was chosen for subsequent experiments.An indirect-competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）was developed for the detection of zearalenone with high specificity and affinity after optimizing.The half maximal inhibitory concentration（IC50）was（0.13±0.02）ng/mL，the limit of detection（IC15）was（0.02±0.01）ng/mL while the the limits of detection are 2.4 μg/kg，4.0 μg/kg for corn and oat with the recoveries from 82.80%to 109.20%and the coefficients of variation was between 3.27%and 15.38%.The method was confirmed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry with a good correlation.

zearalenone；monoclonal antibody；indirect-competitive enzyme linked immunosorbent assay （ic-ELISA）；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.022

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2013BAD18B11）；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目（2014DFR30350）

劉琦（1992—），女（漢），碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)。

*通信作者：王碩（1969—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：食品安全和免疫學(xué)檢測(cè)。

2017-02-20