CART-19在血液惡性腫瘤治療中的臨床應(yīng)用

吳 利(綜述)，羅玉萍(審校)

(南昌大學(xué)a.研究生院2016級(jí)； b.生命科學(xué)學(xué)院遺傳教研室，南昌 330031)

CART-19在血液惡性腫瘤治療中的臨床應(yīng)用

吳 利a(綜述)，羅玉萍b(審校)

(南昌大學(xué)a.研究生院2016級(jí)； b.生命科學(xué)學(xué)院遺傳教研室，南昌 330031)

嵌合型抗原受體基因修飾的T細(xì)胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)免疫療法是通過基因工程方法改造宿主T細(xì)胞，使其能自主靶向結(jié)合并殺死腫瘤細(xì)胞的治療方法。該療法臨床研究最多的是CART-19，其是以B細(xì)胞表面特異性蛋白CD19為靶抗原的CART細(xì)胞，主要用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，BLL)和B細(xì)胞系腫瘤。文章就CART-19在血液惡性腫瘤中治療的臨床應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

嵌合型抗原受體基因修飾的T細(xì)胞-19； 血液惡性腫瘤； 治療； 臨床應(yīng)用

隨著腫瘤免疫療法的興起，嵌合型抗原受體基因修飾的T細(xì)胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)技術(shù)迅速發(fā)展，成為腫瘤免疫治療的新手段之一。CART技術(shù)是通過基因工程方法將人工構(gòu)建的特異性嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)導(dǎo)入T淋巴細(xì)胞，使其能在不受主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)的限制下,特異性識(shí)別并殺死表達(dá)相關(guān)抗原的腫瘤細(xì)胞。由于腫瘤表面抗原具有多樣性，尋找合適的靶抗原一直都是CART治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[1]。CD19是B細(xì)胞特異性表面蛋白，其表達(dá)幾乎貫穿B細(xì)胞發(fā)育的整個(gè)過程[2]，且由CART-19治療引起的B細(xì)胞缺乏癥臨床上可通過補(bǔ)充丙種球蛋白來緩解，因此，CD19成為CART技術(shù)治療B細(xì)胞系腫瘤的一個(gè)潛在的理想靶點(diǎn)[3-4]。筆者就CART-19在血液惡性腫瘤中治療的臨床應(yīng)用作一綜述。

1 CART技術(shù)原理

CART技術(shù)是將抗體抗原的高親和性與T淋巴細(xì)胞的殺傷機(jī)制相結(jié)合來發(fā)揮療效的，其原理是：先將能夠識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原的單鏈抗體(single chain variable fragments，scFv)與T細(xì)胞受體的亞基(T cell receptor，TCR)相結(jié)合，再通過基因工程方法導(dǎo)入宿主T細(xì)胞,使其表面產(chǎn)生特殊受體——CAR。用基因工程方法修飾后的CART細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，在與目的抗原結(jié)合后直接介導(dǎo)細(xì)胞毒性，通過釋放一些細(xì)胞因子(如穿孔素、顆粒酶、干擾素和腫瘤壞死因子等)攻擊腫瘤細(xì)胞。

2 CAR結(jié)構(gòu)發(fā)展

1989年，Gross等科學(xué)家首次用小鼠細(xì)胞成功構(gòu)建和表達(dá)了CAR。經(jīng)過二十多年的研究和探索，CAR結(jié)構(gòu)已經(jīng)從第1代發(fā)展到了第4代[1]。CAR的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)包括腫瘤相關(guān)抗原(tumor associated antigen，TAA)結(jié)合區(qū)、胞外鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。第1代CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞激活是通過CD3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成。雖能成功識(shí)別靶抗原，但缺乏協(xié)同共刺激分子，而不能被充分激活，其增殖能力和細(xì)胞因子分泌能力都很低下，難以維持有效的殺瘤效果。第2代CAR在胞內(nèi)信號(hào)區(qū)添加了1個(gè)協(xié)同刺激分子(如CD28、CD134等)，實(shí)現(xiàn)了T細(xì)胞的雙重活化，大大提高了因子釋放和T細(xì)胞增殖能力，從而增強(qiáng)了CART細(xì)胞的殺瘤活性[5]。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，在胞內(nèi)信號(hào)區(qū)域整合2個(gè)協(xié)同刺激分子，T細(xì)胞的活化和殺瘤效應(yīng)明顯優(yōu)于1個(gè)協(xié)同刺激分子的CAR，于是產(chǎn)生了第3代CAR(如同時(shí)整合CD28、OX40-f和CD28、4-1BB-f)。第4代CAR是在第3代CAR結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，增加了編碼CAR及其啟動(dòng)子的載體，使CART細(xì)胞能更有效分泌細(xì)胞因子和表達(dá)細(xì)胞表面受體，改善體內(nèi)殺瘤的微環(huán)境。目前，第3、4代CART細(xì)胞在臨床應(yīng)用中還比較少，其安全性和有效性是否優(yōu)于第2代CART細(xì)胞也尚無定論。臨床上使用的多為第2代CAR。

3 CART-19在血液惡性腫瘤治療中的臨床應(yīng)用

CART-19的靶抗原為B細(xì)胞表面特異性表達(dá)的CD19蛋白，主要應(yīng)用于B細(xì)胞系腫瘤的靶向治療，包括急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，BLL)和B細(xì)胞淋巴瘤。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，CART-19治療血液腫瘤的總反應(yīng)率為73%，其中ALL的平均反應(yīng)率(93%)明顯高于CLL(62%)和B細(xì)胞淋巴瘤(36%)。Kochenderfer等[8]首次報(bào)道了CART-19免疫療法成功用于治療復(fù)發(fā)難治濾泡性淋巴瘤(follicular Lymphoma，F(xiàn)L)，患者獲得完全緩解(CR)至少6個(gè)月。Brentjens等[9]報(bào)道，對(duì)2例復(fù)發(fā)性難治性B-ALL和8例復(fù)發(fā)性難治性B-CLL采用CART-19治療，不僅證明了CART-19的有效性，且提出在治療前進(jìn)行環(huán)磷酰胺預(yù)處理和輸注適當(dāng)?shù)腃ART細(xì)胞數(shù)，對(duì)療效有重要的作用，同時(shí)5例復(fù)發(fā)性難治性B-ALL患者經(jīng)2年隨訪，發(fā)現(xiàn)治療前采用環(huán)磷酰胺化療預(yù)清除體內(nèi)腫瘤細(xì)胞能夠減少治療后的不良反應(yīng)。有研究[10]指出，在控制因子風(fēng)暴時(shí)所使用的類固醇藥物會(huì)降低CART-19的殺傷效率，導(dǎo)致復(fù)發(fā)。Grupp等[11]采用CART-19治療2例復(fù)發(fā)性難治性B-ALL患兒均獲得CR，其中1例2個(gè)月后出現(xiàn)CD19陰性復(fù)發(fā)，提示B細(xì)胞腫瘤在CART-19持續(xù)、有效的過程中仍有可能通過逃逸機(jī)制復(fù)發(fā)。Maude等[12]報(bào)道，采用CART-19治療30例復(fù)發(fā)性難治性B-ALL患者，結(jié)果顯示，CR率高達(dá)90%，其中無進(jìn)展生存期超過6個(gè)月的患者率達(dá)67%，說明CART-19在臨床應(yīng)用中有無限潛力。Kochenderfer等[13]報(bào)道，采用CART-19治療9例彌漫性大B細(xì)胞性淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)患者，其中有4例達(dá)CR，且最長CR持續(xù)時(shí)間為22個(gè)月。韓為東等[14]報(bào)道，采用CART-19治療9例B-ALL患者，總反應(yīng)率為67%。李萍等[15]報(bào)道，采用CART-19治療18例復(fù)發(fā)難治性白血病/淋巴瘤患者，結(jié)果顯示，總有效率達(dá)61.1%，其中6例達(dá)到CR。Garfall等[16]報(bào)道，采用CART-19免疫療法、化療聯(lián)合自體干細(xì)胞移植治療1例晚期多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者，其療效為CR，且CR持續(xù)時(shí)間長達(dá)12個(gè)月以上，說明CART-19(因?yàn)槟[瘤漿細(xì)胞中CD19的表達(dá)量非常低，僅有0.05%)在整個(gè)治療中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，這一成果給科學(xué)家們提供了更多的思考空間。

4 CART-19在血液惡性腫瘤治療中出現(xiàn)的問題

CART-19在血液惡性腫瘤的臨床研究中已取得令人矚目的進(jìn)展，但在其真正的廣泛應(yīng)用于臨床治療之前，還有很多與安全性、有效性相關(guān)的問題有待于解決[17-18]。

4.1脫靶效應(yīng)

免疫反應(yīng)介導(dǎo)的表達(dá)靶抗原的正常組織排斥反應(yīng)被稱為脫靶效應(yīng)，脫靶效應(yīng)表現(xiàn)最明顯的是靶向CD19[15,19]。CART-19細(xì)胞不僅會(huì)結(jié)合和殺傷靶向的CD19陽性的腫瘤B細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)清除體內(nèi)健康成熟的B細(xì)胞，從而引起機(jī)體損傷。針對(duì)這種情況，有學(xué)者[3]提出可通過增加靶抗原數(shù)目來提高CART細(xì)胞的特異性，如CD22在B-ALL細(xì)胞上有高表達(dá)，可考慮同時(shí)靶向CD19和CD22來提高CART細(xì)胞的特異性，減少脫靶效應(yīng)。

4.2不良反應(yīng)

有文獻(xiàn)[15,18,20]報(bào)道，CART-19治療的不良反應(yīng)主要包括腫瘤溶解綜合征、細(xì)胞因子風(fēng)暴、巨噬細(xì)胞綜合征、神經(jīng)毒性、B細(xì)胞缺失等。臨床癥狀輕者僅類似感冒，重者則可發(fā)生多臟器功能衰竭，甚至死亡。目前，有研究[21-22]認(rèn)為CART-19引起的不良反應(yīng)主要是由于治療后大量釋放細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(INF-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-2受體(IL-2R)等引起的。臨床上一般采用類固醇激素和IL-6受體抗體阻斷劑(如托珠單抗注射液)藥物來緩解細(xì)胞因子風(fēng)暴，以及輸注丙種球蛋白等方法來控制上述不良反應(yīng)。同時(shí)，治療前采用注射用磷酸氟達(dá)拉濱聯(lián)合注射用環(huán)磷酰胺預(yù)處理來降低體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，以及根據(jù)患者的體質(zhì)量來優(yōu)化每次輸入CART-19細(xì)胞數(shù)量，從而有效減少不良反應(yīng)的發(fā)生[9,15]。但是，由于患者治療后的個(gè)體差異性，上述方法有時(shí)也無法及時(shí)、有效地控制不良反應(yīng)，導(dǎo)致病情惡化。

4.3復(fù)發(fā)問題

CART-19免疫療法的復(fù)發(fā)主要有CD19陽性腫瘤復(fù)發(fā)和CAR靶點(diǎn)丟失型腫瘤復(fù)發(fā)。前者主要是由于CART-19細(xì)胞無法在患者體內(nèi)持續(xù)存活和持續(xù)、有效殺瘤而引起的[4]。針對(duì)這一情況，有學(xué)者[4,23]發(fā)現(xiàn)可通過整合4-1BB共刺激分子和提高CART細(xì)胞中心記憶T細(xì)胞的比例來提高其在體內(nèi)的療效。另外，所有臨床研究應(yīng)用的CART-19細(xì)胞均是采用鼠源的單鏈可變區(qū)(scFv)，這可能是患者體內(nèi)CART細(xì)胞丟失的原因之一。但將鼠源的scFv換成人源scFv來減少CART的免疫原性，也有可能增加CAR在體內(nèi)的持續(xù)性。

CAR靶點(diǎn)丟失型腫瘤復(fù)發(fā)主要是因腫瘤細(xì)胞長期處于生存壓力下而產(chǎn)生免疫逃逸引起的。其復(fù)發(fā)主要有兩種情況：1)靶分子在保留必要功能區(qū)段的情況下丟失CART-19靶向區(qū)段。2)靶分子表達(dá)CD19陰性克隆。對(duì)此，科學(xué)家們正在研究設(shè)計(jì)靶向更保守區(qū)段的CAR分子或增加靶點(diǎn)，如同時(shí)靶向CD19和CD22、CD20等來防止此類逃逸性復(fù)發(fā)[4]。

4.4插入性突變

CART-19細(xì)胞制備大多是以慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將CAR導(dǎo)入宿主T細(xì)胞，從而將外源基因片段引入患者體內(nèi)。除了起到積極的治療作用外，也可能會(huì)引起有害的插入性突變。目前，針對(duì)該問題研究較多的是利用mRNA電轉(zhuǎn)制備短期效應(yīng)的CART-19細(xì)胞或引入自殺基因系統(tǒng)共同修飾T細(xì)胞，如單純皰疹病毒胸苷激酶/丙氧鳥苷(HSV-TK/GCV)、化學(xué)誘導(dǎo)二聚化/半胱天冬酶9(CID/casp9)等[20]。當(dāng)腫瘤細(xì)胞被完全清除時(shí)，可誘導(dǎo)啟動(dòng)自殺基因，從而避免CART-19細(xì)胞在患者體內(nèi)永生化，甚至產(chǎn)生新的腫瘤。

5 展望

CART-19細(xì)胞療法的出現(xiàn)給血液惡性腫瘤患者帶來了更多的生存希望，該療法在ALL等早期臨床試驗(yàn)中成效顯著。但CART-19的臨床研究還處于起始階段，如何提高療效和有效控制治療后的不良反應(yīng)、提高生存率仍是研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。同時(shí)，由于目前的CART-19細(xì)胞是用患者自身T細(xì)胞制備的，且治療方案也需要根據(jù)患者的具體病情來決定，從而大大增加了治療的不確定性。同時(shí)，這也是目前CART治療成本高、規(guī)模有限的主要原因。因此，如果能降低成本、擴(kuò)大制備規(guī)模和制備通用型CART細(xì)胞，這必將為更多的患者帶來福音。

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(責(zé)任編輯：胡煒華)

R733； R730.5

A

1009-8194(2017)08-0105-03

2017-01-05

羅玉萍，教授，E-mail：luoyuping@163.com。

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.08.042