氫氯噻嗪和美托拉宗促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖及成骨分化*

李 靜，錢 歡，曾瑩瑩，凌君曼，曾 欣，呼海燕成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610050)

·論著·

氫氯噻嗪和美托拉宗促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖及成骨分化*

李 靜，錢 歡，曾瑩瑩，凌君曼，曾 欣，呼海燕△
成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610050)

目的觀察鈉氯共轉(zhuǎn)運體(NCC)阻斷劑氫氯噻嗪和美托拉宗阻斷NCC后，對UMR106成骨樣細(xì)胞增殖及成骨分化的影響。方法將細(xì)胞分為對照組、氫氯噻嗪組及美托拉宗組，分別加入不同濃度(1、10、100 M)的氫氯噻嗪及美托拉宗與UMR106細(xì)胞共培養(yǎng)，在不同時間點用MTT法檢測細(xì)胞的增殖，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒檢測ALP活性，實時熒光定量PCR法 (qRT-PCR)檢測成骨相關(guān)因子Runx2和Osterix的mRNA表達(dá)。結(jié)果加藥48 h后，1)氫氯噻嗪組在1 M與10 M濃度的吸光度(OD值)較對照組提高了(38.0±5.6)%和(30.3±3.3)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；美托拉宗組在1、10、100 M濃度的OD值較對照組提高(24.2±1.8)%、(50.8±6.6)%及(26.8±2.1)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；2)氫氯噻嗪組和美托拉宗組在1、10、100 M濃度的ALP活性較對照組分別提高了(169.6±19.8)%、(86.6±8.7)%、(118.2±12.5)% 以及(73.4±6.8)%、(145.6±14.5)%、(63.0±7.9)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3)加藥培養(yǎng)24 h后，氫氯噻嗪組和美托拉宗組在1、10、100 M濃度Runx2 mRNA的表達(dá)增多，分別是對照組的(3.52±0.31)、(2.85±0.15)、(2.50±0.41)倍及(2.05±0.45)、(4.57±0.98)、(2.93±0.34)倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論氫氯噻嗪和美托拉宗在加藥24 h可提高Runx2 mRNA的表達(dá)，48 h促進(jìn)細(xì)胞增殖及ALP活性。兩藥可能通過上調(diào)成骨相關(guān)因子Runx2 mRNA的表達(dá)促進(jìn)UMR106細(xì)胞的增殖及成骨分化。

鈉氯共轉(zhuǎn)運體；氫氯噻嗪；美托拉宗；UMR106成骨樣細(xì)胞；增殖

鈉氯共轉(zhuǎn)運體(NCC)是一種陽離子偶聯(lián)氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白[1]，存在于腎臟[2]、小腸[3]和骨組織[4]等，但主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管的管腔膜，是腎臟遠(yuǎn)曲小管主要的鈉離子重吸收通道，其特異性阻斷劑噻嗪類藥物作為高血壓治療的一線藥物，在世界范圍內(nèi)廣泛使用[5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，長期接受噻嗪類利尿劑治療的高血壓患者其骨密度高于其他藥物治療組，這一效應(yīng)通常被認(rèn)為由腎臟主導(dǎo)[7]。由于NCC在成骨細(xì)胞也有表達(dá)[4, 8]， 國外研究[4, 9]提示噻嗪類利尿劑可影響成骨細(xì)胞的成骨分化，但研究結(jié)果分歧較大， 國內(nèi)則鮮見相關(guān)研究報道。由于NCC阻斷劑對成骨代謝的正性調(diào)節(jié)作用，使之成為骨質(zhì)疏松癥的潛在治療靶點，對相關(guān)藥物的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究具有重要的臨床意義。本研究使用臨床常用的兩類NCC阻斷劑氫氯噻嗪及美托拉宗干預(yù)UMR106細(xì)胞的培養(yǎng)，觀察其對細(xì)胞增殖的影響，并探索藥物的最佳作用時間及濃度，旨在為臨床骨質(zhì)疏松癥提供新的治療策略與藥物選擇。

1 材料與方法

1.1UMR106細(xì)胞的培養(yǎng)及分組

將UMR106細(xì)胞(大鼠骨肉瘤細(xì)胞，由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院陳雨雪教授惠贈)接種于含10%新生牛血清(杭州四季青公司)和2%雙抗(美國Billab公司)的DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中，置于37 ℃、5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱(上海一恒科技公司)內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每1～2 d換液1次，待細(xì)胞匯合至80%～90%時使用0.25%胰蛋白酶(美國Sigma公司)消化，按1∶2傳代。實驗分組：1)空白對照組：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，加入不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；2)氫氯噻嗪組：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，分別加入含不同濃度(1、10、100 M )氫氯噻嗪(美國TargetMol公司)的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基；3)美托拉宗組：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，分別加入含不同濃度(1、10、100 M )美托拉宗(美國TargetMol公司)的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基。

1.2MTT法檢測細(xì)胞增殖

將處于對數(shù)生長期的UMR106細(xì)胞消化并計數(shù)后，按5 103/孔的濃度接種于96孔板，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后吸去培養(yǎng)基，按1.1 所述方法分組加藥，每組6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，棄培養(yǎng)基，毎孔加入20 μL MTT(美國Sigma公司)和180 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基，孵育4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min后，使用酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)在490 nm處測吸光度(OD)值。

1.3ALP活性檢測

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按2 104/孔的濃度接種于24孔板中，培養(yǎng)及分組加藥同前，每組6個復(fù)孔。加藥培養(yǎng)24、48 h后，棄培養(yǎng)基，按ALP試劑盒(上海碧云天科技公司)操作步驟檢測ALP活性：加入0.2%的Triton x-100 裂解，離心取上清， 取50 μL上清液加入50 μL顯色底物，37 ℃孵育5～10 min，加入100 μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，在405 nm處測OD值。使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算堿性磷酸酶活性。

1.4qRT-PCR檢測Runx2及Osterix的mRNA表達(dá)

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按5 104/孔的濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)及分組加藥同前，每組4個復(fù)孔。加藥培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，加入RNAISO plus(日本Takara公司)裂解細(xì)胞，經(jīng)氯仿分離、異丙醇沉淀、75%乙醇漂洗提取總RNA，使用分光光度計(美國Thermo-Scientific公司)測RNA濃度及A260/A280的比值判斷提取質(zhì)量。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)操作步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用 SYBR green 染料法(日本Takara公司)，實時熒光定量PCR (qRT-PCR，美國Bio-Rad公司)檢測各組細(xì)胞Runx2及Osterix的mRNA表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃， 3 min 反應(yīng)1個循環(huán)，95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，共反應(yīng)40個循環(huán), 65 ℃ 5 s。引物序列如下：Runx2的正向引物序列為：5'-CCGTGTCAGCAAAACTTCTT-3'，反向引物序列為：5'-CTCACGTCGCTCATCTTGC-3'；Osterix的正向引物序列為：5'-GGACAGCCAACCCTAGCC-3'，反向引物序列為：5'-TGGAGCCACCAAA CTTGC-3'；β-actin的正向引物序列為：5'-CCCGCGAGTACAACCTTCT-3'，反向引物序列為：5'-CGTCATCCATGGCGAACT-3'，引物由成都擎科生物公司合成。反應(yīng)結(jié)束后，使用溶解曲線判斷特異性，將各樣本的Ct值與β-actin內(nèi)參基因做對照，定量采用2-△△Ct法。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1氫氯噻嗪和美托拉宗促進(jìn)UMR106細(xì)胞增殖

加入藥物培養(yǎng)24 h后，與對照組相比，兩種藥物在1 M及10 M 濃度對細(xì)胞增殖均無影響；但在100 M濃度，氫氯噻嗪和美托拉宗對細(xì)胞增殖均產(chǎn)生了抑制作用，OD值較對照組分別下降了21.4%和20.1%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。培養(yǎng)48 h后，加藥組及對照組細(xì)胞增殖均較24 h明顯提高，且加藥組高于對照組。氫氯噻嗪組在1 M與10 M濃度的OD值較對照組分別提高了(38.0±5.6)%和(30.3±3.3)%， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；雖然氫氯噻嗪組在100 M濃度也高于對照組(23.5±4.2)%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 美托拉宗組在1、10、100 M濃度的OD值較對照組分別提高了(24.2±1.8)%、(50.8±6.6)%及(26.8±2.1)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。加藥培養(yǎng)72 h后，各組細(xì)胞增殖均較48 h降低。與對照組相比，氫氯噻嗪組在1 M濃度及美托拉宗組在1、10 M濃度的OD值分別提高了(18.6±1.1)%、(17.2±1.9)%及(27.0±2.2)%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但其他組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖1)。

2.2氫氯噻嗪和美托拉宗提高UMR106細(xì)胞ALP活性

與細(xì)胞增殖的作用相似，加藥培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞ALP活性與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48 h后，各組ALP活性均較24 h明顯提高，氫氯噻嗪組在1、10、100 M濃度的ALP活性較對照組分別提高了(169.6±19.8)%、(86.6±8.7)%及(118.2±12.5)%，美托拉宗組在1、10、100 M濃度的ALP活性較對照組分別提高了(73.4±6.8)%、(145.6±14.5)%、(63.0±7.9)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。由于細(xì)胞增殖結(jié)果提示在72 h細(xì)胞的增殖較48 h下降，故未檢測72 h的ALP活性 。

2.3氫氯噻嗪和美托拉宗對細(xì)胞Runx2和OsterixmRNA表達(dá)的影響

加藥培養(yǎng)24 h后，與對照組相比，氫氯噻嗪和美托拉宗組在各濃度對成骨相關(guān)因子Runx2 mRNA的表達(dá)均顯著提高，在1 M、10 M及100 M組，Runx2 mRNA表達(dá)分別是對照組的(3.52±0.31)、(2.85±0.15)、(2.50±0.41)倍及(2.05±0.45)、(4.57±0.98)、(2.93±0.34)倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；氫氯噻嗪和美托拉宗組對成骨相關(guān)因子Osterix mRNA表達(dá)略有上調(diào)，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

圖1 氫氯噻嗪和美托拉宗對UMR106細(xì)胞增殖的影響

注：A：氫氯噻嗪在各時間點對共培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞增殖的影響；B：美托拉宗在各時間點對共培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞增殖的影響；與對照組相比，*P<0.05 ，**P<0.01(n=6)

注：A：氫氯噻嗪在各時間點對共培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞ALP活性的影響；B：美托拉宗在各時間點對共培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞ALP活性的影響；與對照組相比，*P<0.05 ，**P<0.01 (n=6)

圖3 氫氯噻嗪和美托拉宗對UMR106細(xì)胞Runx2和Osterix mRNA表達(dá)的影響

注：A：氫氯噻嗪在24 h對共培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞成骨相關(guān)因子Runx2和Osterix mRNA表達(dá)的影響；B：美托拉宗 在24 h對共培養(yǎng)的UMR106細(xì)胞成骨相關(guān)因子Runx2和Osterix mRNA表達(dá)的影響；與對照組相比，*P<0.05 ，**P<0.01 (n=4)

3 討論

NCC 是腎臟遠(yuǎn)曲小管主要的鈉離子重吸收通道，其特異性阻斷劑噻嗪類藥物是高血壓治療的一線藥物[5]。 研究[6]發(fā)現(xiàn)阻斷NCC功能可增加骨密度，表現(xiàn)為：在高血壓的治療中，使用噻嗪類利尿劑治療組患者的骨密度較其他藥物治療組提高，骨折風(fēng)險降低；因基因突變致NCC功能失活而導(dǎo)致的Gitelman綜合征患者的骨密度較正常同齡人增加[8]；NCC基因敲除鼠的骨密度高于野生型小鼠[10]。NCC功能阻斷后骨密度增加的效應(yīng)通常認(rèn)為由腎臟主導(dǎo)，因為使用噻嗪類利尿劑可下調(diào)腎臟遠(yuǎn)曲小管鈉鈣交換，減少尿鈣排泄[7]，從而增加骨密度。但這一解釋也受到一些質(zhì)疑，因為即使長期使用(2年以上)氫氯噻嗪的患者其血鈣含量并無明顯變化，而在NCC失活導(dǎo)致的Gitelman綜合癥患者中甚至?xí)霈F(xiàn)低鈣血癥[4]。由于NCC在成骨細(xì)胞也有表達(dá)[4, 8]，噻嗪類藥物能否直接通過促進(jìn)成骨而提高骨密度成為新的研究點，近年來國外對此作了相關(guān)的研究，如Lajeunesse 等[9]報道氫氯噻嗪可上調(diào)人成骨細(xì)胞系MG-63骨鈣素的表達(dá)，Dvorak 等[4]報道美托拉宗可促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化及鈣結(jié)節(jié)形成，但對成骨細(xì)胞的增殖及堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)作用分歧較大[4, 9]。

骨代謝是由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成及由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收的動態(tài)平衡[11]，隨著年齡的增長，成骨細(xì)胞的功能下降并伴隨破骨細(xì)胞功能的增強(qiáng)，將導(dǎo)致以骨密度降低為特征的骨質(zhì)疏松癥[12]。隨著我國進(jìn)入老齡化社會，骨質(zhì)疏松癥日益成為嚴(yán)重的公共健康問題。骨質(zhì)疏松癥的治療手段現(xiàn)大多局限于抑制破骨細(xì)胞的功能，而缺乏促進(jìn)成骨細(xì)胞功能的藥物[11]，因此，研究NCC特異性阻斷劑對UMR106成骨樣細(xì)胞的作用機(jī)制具有重要的臨床意義。本次研究使用了臨床常用的NCC阻斷劑氫氯噻嗪和美托拉宗，二者化學(xué)結(jié)構(gòu)不同但均作用于NCC，通過與UMR106細(xì)胞的共培養(yǎng)來研究藥物對成骨樣細(xì)胞增殖及成骨分化的影響， 旨在為進(jìn)一步的實驗及治療提供研究基礎(chǔ)。

結(jié)果表明，氫氯噻嗪和美托拉宗均可促進(jìn)UMR106細(xì)胞的增殖，加藥培養(yǎng)48 h效果最為顯著，氫氯噻嗪在1 M和10 M組促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，美托拉宗各組均促進(jìn)細(xì)胞的增殖。其他研究[4, 9]關(guān)于噻嗪類藥物對成骨細(xì)胞的增殖作用分歧較大，或與其檢測時間點及方法不同有關(guān)，如在Dvorak等[4]研究中并未發(fā)現(xiàn)美托拉宗對成骨細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，其使用的方法為細(xì)胞計數(shù)板直接計數(shù)細(xì)胞，且檢測時間長達(dá)7 d。本研究為排除血清因素的干擾，加藥組與對照組均使用無血清培養(yǎng)，結(jié)果顯示，氫氯噻嗪和美托拉宗均促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，最佳效應(yīng)為48 h，在72 h后作用均有所下降，推測原因可能與無血清培養(yǎng)有關(guān)。故在ALP及成骨分化相關(guān)基因Runx2和Osterix mRNA表達(dá)實驗中均未做72 h的表達(dá)。在后續(xù)實驗中將比較加入血清培養(yǎng)后藥物的作用是否與無血清培養(yǎng)作用一致。另外，高濃度(100 M)的氫氯噻嗪和美托拉宗對細(xì)胞增殖作用在各時間點的差異較大，加藥培養(yǎng)24 h，兩藥對細(xì)胞增殖均產(chǎn)生了抑制作用，繼續(xù)培養(yǎng)48 h和72 h，氫氯噻嗪組細(xì)胞增殖與對照相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；美托拉宗組培養(yǎng)48 h后OD值明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，72 h后OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。推測原因可能為兩種藥物在高濃度時對細(xì)胞的初期作用為抑制，隨著細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)逐漸適應(yīng)，這種抑制作用也逐漸減弱甚至表現(xiàn)為微弱的促進(jìn)作用。有關(guān)這一現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制，仍需進(jìn)一步探討。

ALP是成骨細(xì)胞分化的特征性酶，其活性可反映成骨細(xì)胞的成骨分化和增殖程度[13]，結(jié)果顯示，氫氯噻嗪和美托拉宗均可提高UMR106細(xì)胞的ALP活性，該效應(yīng)的作用時間及濃度與細(xì)胞增殖效應(yīng)一致，也是在48 h作用最為顯著，提示氫氯噻嗪和美托拉宗可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖進(jìn)而提高ALP的活性。

為探索氫氯噻嗪和美托拉宗促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的基因調(diào)控機(jī)制，本研究檢測了成骨相關(guān)因子Runx2 (核心結(jié)合因子α1)和Osterix (鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子)mRNA的表達(dá)。Runx2 和Osterix 為骨發(fā)育和骨形成的關(guān)鍵因子，可調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖與分化[14]， 促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟和胞外基質(zhì)的分泌，是骨形成過程中所必需的關(guān)鍵物質(zhì)[15-16]。結(jié)果顯示，加藥培養(yǎng)24 h后，氫氯噻嗪和美托拉宗顯著提高了Runx2 mRNA表達(dá)；但對Osterix mRNA表達(dá)無影響，推測原因可能為Osterix在發(fā)育的骨組織中特異性表達(dá)，在骨發(fā)育形成的后期起到重要的調(diào)節(jié)作用[16]，故在24 h并未檢測到該基因表達(dá)的差異。

綜上所述，NCC功能阻斷劑氫氯噻嗪和美托拉宗可能通過上調(diào)成骨相關(guān)因子Runx2 mRNA的表達(dá)促進(jìn)UMR106細(xì)胞的增殖與成骨分化，促進(jìn)成骨代謝。該結(jié)果或可部分解釋使用噻嗪類利尿劑治療高血壓患者骨密度高于其他藥物治療組，對于臨床高血壓病合并骨質(zhì)疏松癥患者制定治療方案，以及對促進(jìn)成骨代謝的藥物開發(fā)具有一定的指導(dǎo)意義。

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AStudyontheProliferationandDifferentiationofOsteoblast-likeCellsPromotedbyHydrochloridethiazideandMetolazone

LiJing,QianHuan,ZengYinyin,LinJunman,ZengXin,HuHaiyan△.
SchoolofBasicMedicalSciences,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China

ObjectiveTo investigate the effect of the sodium and chloride co-transporter (NCC) blockers Hydrochlorothiazide (HCTZ) and Metolazone on the proliferation and osteoblast differentiation of UMR106 cells.MethodsThe Cells were divided into the control group, HCTZ group and metolazone group. HCTZ and Metolazone of different concentration (1M, 10M and 100M) were co-cultured with UMR106 cells respectively. The cell proliferation, ALP activity, and expression of Runx2 and Osterix mRNA were detected by the MTT method, ALP kit, and qRT-PCR repectively at different time points.ResultsCompared with the control group after 48 hours of being co-cultured, the OD values in the HCTZ groups with the concentration of 1M and 10M increased by (38.0±5.6)% and (30.3±3.3)% respectively and those in the Metolazone groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased by (24.2±1.8)%, (50.8±6.6)% and (26.8±2.1)% respectively, and the differences were statistically significant (P<0.05). The ALP activities in the HCTZ groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased by (169.6±19.8)%, (86.6±8.7)% and (118.2±12.5)%, and those in the Metolazone groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased by (73.4±6.8)%, (145.6±14.5)% and (63.0±7.9)% respectively, and the differences were statistically significant (P<0.05). Compared with the control group after 48 hours of being co-cultured, the expression levels of Runx2 and Osterix mRNA in the HCTZ groups with the concentration of 1M, 10 M and 100 M increased to (3.52±0.31)times, (2.85±0.15)times and (2.50±0.41)times, and the those in the Metolazone groups with the concentration of 1M, 10M and 100M increased to (2.05±0.45)times, (4.57±0.98)times and (2.93±0.34)times, and the differences were statistically significant (P<0.05).ConclusionHCTZ and metolazone significantly increase the expression of Runx2 mRNA after 24 hours of being co-cultured and promote the cell proliferation and ALP activity after 48 hours of being cocultured. Both drugs may promote the proliferation and osteoblast differentiation of UMR106 cells by up-regulating the expression of osteogenesis-related factor Runx2 mRNA.

Sodium and Chloride co-transporter; Hydrochlorothiazide; Metolazone; UMR106 osteoblast-like cells; Proliferation

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20171009.1545.002.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2017.05.007

R681

A

四川省教育廳自然科學(xué)基金資助項目(No:17ZA0115)；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No:201513705020；No:201613705007)

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呼海燕，E-mail:hyhoo@163.com