振腹推拿對T2DM大鼠骨骼肌AMPK/Glut 4信號鏈的影響

王康 國生 鈕妍 沈潛 薛恬玨 孟鳳仙

·論著·

振腹推拿對T2DM大鼠骨骼肌AMPK/Glut 4信號鏈的影響

王康 國生 鈕妍 沈潛 薛恬玨 孟鳳仙

目的觀察振腹推拿對2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)大鼠腓腸肌及腹直肌組織AMPK及Glut4基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響，探討其改善T2DM糖代謝的作用機(jī)制。方法24只Wistar大鼠隨機(jī)取出6只為空白組，其余高脂高糖飲食聯(lián)合低劑量(35 mg/kg)鏈脲佐菌素腹腔注射建立T2DM模型，成模大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥對照組及西藥推拿組?？瞻讓φ战M及模型組每日灌胃蒸餾水，西藥對照組每日以250 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行二甲雙胍灌胃一次，西藥推拿組在相同給藥標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上每日加用振腹推拿治療一次。分別在干預(yù)第0、2、4、8周測定大鼠FBG水平，干預(yù)8周后，測定腓腸肌與腹直肌AMPKα2、Glut4基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)。結(jié)果與空白組比較，模型組FBG值在第0、2、6、8周時均顯著上升，干預(yù)8周后，腹直肌AMPKα2及Glut4基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均顯著下降，腓腸肌AMPKα2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均顯著下降，腓腸肌 Glut4蛋白表達(dá)顯著下降。與模型組比較，西藥組及西藥推拿組FBG值在第2、6、8周時均顯著下降，西藥組腹直肌AMPKα2基因轉(zhuǎn)錄顯著上升，Glut4基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)顯著上升，西藥推拿組腹直肌AMPKα2及Glut4基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均顯著上升，腓腸肌AMPKα2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)均顯著上升。結(jié)論在二甲雙胍常規(guī)治療基礎(chǔ)上，聯(lián)合振腹推拿可進(jìn)一步改善T2DM大鼠的FBG水平，其對糖代謝的改善機(jī)制與調(diào)控骨骼肌AMPK/Glut4信號鏈有關(guān)。

振腹推拿； 2型糖尿?。?腺苷酸活化蛋白激酶； 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，2005到2015年間中國由于糖尿病及相關(guān)心血管疾病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)5577億美元，糖尿病患者數(shù)量從1980年的1.08億增加到2014年的4.22億[1]。2016年國家衛(wèi)計委調(diào)查顯示，中國糖尿病患者已達(dá)到1億，其中約95%為2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)患者，兒童青少年T2DM發(fā)病人數(shù)近年來迅速上升[2]。不斷加深對T2DM發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，積極尋找及推廣符合中國國情與文化現(xiàn)狀的治療方式，對T2DM的早期防治有著積極的意義。

振腹推拿作為推拿學(xué)的一個重要流派，有其完整的理論體系和傳承脈絡(luò)，其臨床特點(diǎn)是以松振法為核心的一系列手法作用于腹部經(jīng)絡(luò)腧穴，在內(nèi)科病的防治中體現(xiàn)了環(huán)保與舒適的優(yōu)勢，與針灸、中藥相輔相成，為西醫(yī)控制不理想的內(nèi)科疾病提供了互補(bǔ)性的治療措施。近年來，振腹推拿廣泛應(yīng)用于T2DM的臨床防治，并發(fā)揮了較好的臨床療效，但其作用機(jī)制的相關(guān)研究較少，本研究以細(xì)胞糖代謝的關(guān)鍵信號分子腺苷酸活化蛋白激酶[adenosine 5′-mon- ophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK]與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter type 4，Glut4)為切入點(diǎn)，從分子生物學(xué)的角度，初步揭示了振腹推拿改善T2DM糖代謝紊亂的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物

健康雄性SPF級Wistar大鼠30只，4周齡，體重(100±10)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物房，溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，自由進(jìn)食和飲水。

1.2試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)(美國SIGMA公司)，超純RNA提取試劑盒(康為世紀(jì)生物)，HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀(jì)生物)，SYBR Green PCR Mixture (康為世紀(jì)生物)，大鼠AMPKα2Elisa試劑盒(華美生物工程有限公司)，大鼠GLUT-4 Elisa試劑盒(華美生物工程有限公司)。全自動多功能酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3，Thermo，USA)，熒光定量PCR儀(ABI7500)，凝膠成像儀(Tanon-6600天能公司)，高速冷凍離心機(jī)(Hettich德國)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DH4000A天津泰斯特)，分光光度計(UV-2000上海尤尼柯公司)。

1.3模型建立與分組

將30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)取出6只作為空白組，其余24只給予高脂飼料喂養(yǎng)4周后禁食，按30 mg/kg一次性腹腔注射1%濃度STZ，STZ配制過程避光并在冰浴中進(jìn)行，15分鐘內(nèi)使用?？瞻讓φ战M腹腔注射相同劑量檸檬酸緩沖液。3天后，以空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥11.1 mmol/L，視為造模成功。將造模成功的18只大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、西藥推拿組，每組6只。

1.4干預(yù)方案

于造模后進(jìn)行干預(yù)，西藥組給予二甲雙胍灌胃，250 mg/kg，每日一次，共干預(yù)8周。西藥推拿組在同樣劑量藥物基礎(chǔ)上給予推拿手法干預(yù)，行拿揉法于大鼠雙側(cè)梁丘、血海二穴5分鐘，頻率(100±10)次/分鐘；拇食二指拿揉雙側(cè)天樞穴5分鐘；三指振腹法于小鼠神闕穴區(qū)域，施術(shù)5分鐘，頻率(200±20)次/分鐘；手法合計15分鐘，每日一次，共干預(yù)8周?？瞻捉M及模型組每日僅用鼠袋固定15分鐘，不進(jìn)行任何干預(yù)。

1.5組織標(biāo)本采集及處理

大鼠在末次干預(yù)結(jié)束后，禁食12小時，第二天依次按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥腹腔麻醉，腹主動脈取血后處死，冰浴下(4℃冰盤)取右側(cè)腓腸肌及腹直肌?？焖偃コ嘤嘀竞徒Y(jié)締組織后，放入液氮保持，之后置于-80℃超低溫冰箱保存，待測。

1.6指標(biāo)檢測

1.6.1 RT-PCR方法檢測AMPKα2及GLUT4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平 經(jīng)典 Trizol法提取大鼠腓腸肌與腹直肌總RNA，按3 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列及產(chǎn)物長度見表1。以cDNA作模板，應(yīng)用real-time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，并計算相對2-ΔΔCt。

表1 各引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.6.2 ELISA方法測定腓腸肌AMPKα2及GLUT4含量 選取大鼠腹直肌與腓腸肌組織進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測GLUT4及AMPKα2的蛋白表達(dá)。

1.6.3 空腹血糖 強(qiáng)生穩(wěn)豪快速血糖儀于造模成功后的第0、2、4、8周后分別測定各組大鼠FBG。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1對T2DM大鼠FBG水平的影響

干預(yù)前，模型組、西藥組、西藥推拿組與空白組比較，F(xiàn)BG值顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥組、西藥推拿組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明模型均一。

干預(yù)開始后的第2、4、8周，模型組FBG值高于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥組、西藥推拿組與模型組比較，F(xiàn)BG值下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與干預(yù)前相比，西藥組與西藥推拿組在干預(yù)開始后的第2、4、8周，F(xiàn)BG值均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)前后FBG值比較

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與0周比較，cP<0.05。

2.2對T2DM大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

與空白組相比，模型組腹直肌AMPKα2及Glut4 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥組及西藥推拿組AMPKα2及Glut4 mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥推拿組較西藥組對腹直肌AMPKα2mRNA表達(dá)的影響更為顯著，與空白組水平更為接近，見表3。

表3 各組大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

注： 與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3對T2DM大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組腹直肌AMPKα2及Glut4蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，西藥組Glut4蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，西藥推拿組AMPKα2及Glut4蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥推拿組較西藥組對腹直肌AMPKα2的蛋白表達(dá)的影響更為顯著，見表4。

表4 各組大鼠腹直肌AMPKα2及Glut4蛋白表達(dá)水平的比較

注： 與空白組比較，aP<0.05； 與模型組比較，bP<0.05。

2.4對T2DM大鼠腓腸肌AMPKα2及Glut4 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

與空白組相比，模型組腓腸肌AMPKα2mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，西藥推拿組腓腸肌AMPKα2mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；西藥推拿組較西藥組對腓腸肌AMPKα2mRNA表達(dá)的影響更為顯著，接近空白組水平，見表5。

表5 各組大鼠腓腸肌AMPKα2及Glut4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

注：與空白組比較，aP<0.05； 與模型組比較，bP<0.05。

2.5對T2DM大鼠腓腸肌AMPKα2及Glut4 蛋白表達(dá)的影響

與空白組相比，模型組腓腸肌AMPKα2及Glut4蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，西藥推拿組AMPKα2蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 各組大鼠腓腸肌AMPKα2及Glut4 蛋白表達(dá)水平的比較

注： 與空白組比較，aP<0.05； 與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

AMPK在進(jìn)化上高度保守，是生物能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，廣泛表達(dá)于各種代謝相關(guān)的器官中，不同的組織和細(xì)胞中存在不同的同型異構(gòu)體，分布在骨骼肌、心臟和肝臟的主要為α2亞型。它不僅作為調(diào)控糖脂代謝的重要激酶，同時也是參與炎癥及自噬信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵蛋白[3]。

在T2DM患者、肥胖患者及相應(yīng)的動物模型中發(fā)現(xiàn)肝臟、脂肪和肌肉等外周組織中的AMPK活性均下降，這一現(xiàn)象，被稱為AMPK失調(diào)[4-5]，研究發(fā)現(xiàn)恢復(fù)AMPK信號網(wǎng)絡(luò)的生理功能可從糖脂代謝、炎癥反應(yīng)及自噬等多途徑改善T2DM的臨床癥狀。其中，AMPKα2/Glut4信號鏈?zhǔn)窃摼W(wǎng)絡(luò)調(diào)控骨骼肌糖代謝關(guān)鍵通路，由于機(jī)體90%以上的葡萄糖代謝發(fā)生在骨骼肌內(nèi)，因而恢復(fù)骨骼肌內(nèi)AMPKα2/Glut4信號鏈的功能，對T2DM的血糖控制有著十分重要的意義。

近年來，隨著國人疾病譜的改變，推拿運(yùn)用到內(nèi)、婦、兒科疾病的比率逐年上升。多項圍繞T2DM的臨床研究[6-9]指出，推拿聯(lián)合常規(guī)降糖藥物干預(yù)2型糖尿病患者，可減輕患者體重，并對血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸及胰島素抵抗指數(shù)等水平具有較好的調(diào)節(jié)作用，同時改善胰島素抵抗及血小板活化狀態(tài)，且療效優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用西藥，但對手法的效應(yīng)機(jī)制尚缺乏深入的研究。

團(tuán)隊在前期工作中發(fā)現(xiàn)推拿手法對骨骼肌細(xì)胞AMPKα2含量有特異性調(diào)節(jié)作用，結(jié)合本次研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了在對T2DM大鼠模型進(jìn)行干預(yù)時，在二甲雙胍常規(guī)干預(yù)基礎(chǔ)上加上振腹推拿，可提升大鼠血糖控制的穩(wěn)定性及持續(xù)性；同時，使二甲雙胍對AMPKα2/Glut4信號鏈的激活能力得到了一定程度的提升，表明振腹推拿可直接或間接上調(diào)骨骼肌AMPKα2的基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)，在腹直肌內(nèi)可進(jìn)一步表現(xiàn)出對AMPKα2/Glut4信號鏈的激活效應(yīng)，從而達(dá)到穩(wěn)定血糖與調(diào)節(jié)糖代謝的作用。

而振腹推拿在腓腸肌未能表現(xiàn)出對Glut4基因及蛋白的調(diào)控，其原因有以下幾點(diǎn)：(1)手法操作范圍：腹部操作范圍較大，以面為主，腿部操作范圍較小，以點(diǎn)為主；(2)肌肉被動運(yùn)動方式：腹部操作以振法為主，肌纖維的運(yùn)動是以整體的上下移動為主，力量柔和，腿部操作以撥法為主，肌纖維的運(yùn)動則是以局部的左右擺動為主，力量偏強(qiáng)；(3)手法操作的時間：手法在腹部的操作時間是在腿部的兩倍，導(dǎo)致一些時效性差異的出現(xiàn)；(4)與病變器官的相對距離：腹部操作的時候作用部位除骨骼肌外，還有胰臟、肝臟、腹部脂肪等組織器官，之間可能存在交互作用。由此可見，這一結(jié)果也從實驗的角度說明了腹部手法的應(yīng)用在T2DM的臨床治療中的重要性。

從胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激到線粒體功能障礙、自噬等，可以看出T2DM的發(fā)病機(jī)制是多方面的，因此推拿手法對其發(fā)揮的作用機(jī)制也將不是單一通路的，骨骼肌僅是手法作用的靶點(diǎn)之一，脂肪、腸系膜、腹腔臟器等組織器官也是手法的作用部位。本次研究結(jié)果初步揭示了振腹推拿干預(yù)T2DM的部分作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)手法可通過激活腹直肌AMPKα2/Glut4信號鏈發(fā)揮調(diào)控機(jī)體糖代謝的作用，四肢部的手法效應(yīng)或通過其他途徑發(fā)揮。今后的研究應(yīng)在神經(jīng)—體液—內(nèi)分泌的大網(wǎng)絡(luò)下，進(jìn)一步研究推拿在靶組織、靶器官中產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)，并探索其間的聯(lián)系，方能更全面地揭示推拿手法的作用機(jī)制。

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EffectsofZhenfuTuinaonAMPK/Glut4signalchainofskeletalmusclesinratswithT2DM

WANGKang，GUOSheng，NIUYan，etal.DepartmentofTuina，DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China

Correspondingauthor：MENGFengxian，E-mail：mengfx_1955@163.com

ObjectiveTo observe the influence ofZhenfuTuinatreatment on AMPK and Glut4 gene transcription and protein expression in gastrocnemius and rectus abdominis tissues in rats with type 2 diabetes mellitus(T2DM), so as to investigate the mechanism of improving glycometabolism in T2DM.Methods6 Wistar rats were used as control group(C), 6 Wistar rats were given high-fat and high-sugar diets combined with intra-peritoneal injection with low dose (35 mg/kg) of streptozotocin to establish T2DM rat models. After successful established rat models, the rats were randomly divided into model group(M), western medication group(WM) and western medication combined withTuinagroup(WT). Rats in C and M were given daily intragastric administration of distilled water while rats in WT were given metformin (250 mg/kg), once per day. On the basis of WM group,ZhenfuTuinawas added in the WT group. All rats were sacrificed after 8 weeks of intervention, and the level of FBG and gene transcription and protein expression of AMPK and Glut4 in gastrocnemius and rectus abdominis muscles was detected.ResultsCompared with C group, level of FBG in M group was significant increase at 2, 6 and 8 week, gene transcription and protein expression of AMPKα2and Glut4 in rectus abdominis were significant decrease, gene transcription and protein expression of AMPKα2in gastrocnemius was significant decrease and the protein expression of Glut4 in gastrocnemius was decrease. Compared with M group, level of FBG was significant decrease of WM group and WT group at 2, 6 and 8 week. Compard wiht M group, AMPKα2gene transcription and protein expression of Glut4 in the rectus abdominis of WM was significant increase. Compared with M group, gene transcription and protein expression of AMPKα2and Glut4 in rectus abdominus of WT was significant increase.ConclusionOn the basis of conventional treatment of metformin, combined withZhenfuTuinacan further improve the FBG level in T2DM rats, and the mechanism is related to the improvement of glucose metabolism and the regulation of AMPK/Glut4 signaling chain in skeletal muscle.

ZhenfuTuina； Type 2 diabetes mellitus； Adenosine 5′-mon- ophosphate(AMP)-activated protein kinase； Glucose transporter type 4

R244.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.11.008

2017-02-25)

(本文編輯： 董歷華)

北京中醫(yī)藥大學(xué)中青年教師項目(2016-JYB-JSPY-041)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院推拿理療科(王康、國生、沈潛)；北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒科(薛恬玨、鈕妍)；北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院風(fēng)濕免疫科(孟鳳仙)

王康(1985- )，碩士，主治醫(yī)師。研究方向：推拿改善代謝性疾病的分子機(jī)制。E-mail：wangkang_dfyy@163.com

孟鳳仙(1955- )，女，博士，教授。研究方向：風(fēng)濕免疫病、代謝病的中醫(yī)臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：mengfx_1955@163.com