IL-23和MMP-9在非急性硬膜下血腫形成時間推斷中的法醫(yī)學(xué)研究

杜 宇 單 迪 賈儒林 鄭吉龍

（中國刑事警察學(xué)院法醫(yī)學(xué)系 遼寧 沈陽 110035）

IL-23和MMP-9在非急性硬膜下血腫形成時間推斷中的法醫(yī)學(xué)研究

杜 宇 單 迪 賈儒林 鄭吉龍

（中國刑事警察學(xué)院法醫(yī)學(xué)系 遼寧 沈陽 110035）

檢測白介素-23（IL-23）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在非急性硬膜下血腫中的表達(dá)及其在推斷非急性硬膜下血腫形成時間中的法醫(yī)學(xué)意義。選擇符合條件的非急性硬膜下血腫臨床病例30例，根據(jù)影像學(xué)首次檢出血腫至鉆孔引流術(shù)的時間間隔分為7～14d（A）、15～21d（B）、22d以上（C）三組。10例健康體檢者被作為對照組。采集硬膜下血腫患者的血腫液、外周血及健康對照組的外周血，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測不同時間組血腫液及外周血中IL-23和MMP-9含量。與健康體檢者外周血相比較，血腫內(nèi)IL-23，MMP-9含量均顯著增高。隨血腫形成時間增加，血腫內(nèi)IL-23含量逐漸降低，MMP-9含量逐漸增高，各時間組之間差異顯著（P＜0.01）。血腫患者外周血IL-23、MMP-9含量增高，但各組間差異不明顯。血腫內(nèi)IL-23和MMP-9的含量在一定時間段內(nèi)呈現(xiàn)時序性變化規(guī)律，可應(yīng)用于硬膜下血腫形成時間推斷。

非急性硬膜下血腫 血腫形成時間 白細(xì)胞介素-23 基質(zhì)金屬蛋白酶-9

1 引言

硬膜下血腫是常見的顱內(nèi)血腫，多由外傷造成。根據(jù)臨床起病緩急，硬膜下血腫分為急性、亞急性及慢性，傷后3～21天出現(xiàn)癥狀者為亞急性，21天以上出現(xiàn)癥狀為慢性。亞急性和慢性硬膜下血腫（以下統(tǒng)稱為非急性硬膜下血腫）于外傷后一段時間才呈現(xiàn)相應(yīng)癥狀，因此，與外傷之間的關(guān)聯(lián)性成為法醫(yī)鑒定的難點問題。推斷非急性硬膜下血腫形成時間有助于分析血腫成因，但是目前尚沒有關(guān)于非急性硬膜下血腫形成時間推斷的相關(guān)報道。

研究證實，局部炎癥反應(yīng)，血腫外膜新生血管生成及再出血是非急性硬膜下血腫發(fā)生、發(fā)展的重要機制[1-5]。本研究選擇與炎癥反應(yīng)和新生血管生成密切相關(guān)的白細(xì)胞介素-23（interleukin-23，IL-23）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）作為觀察對象，檢測這兩種細(xì)胞因子在非急性硬膜下血腫液中的表達(dá)及含量變化，探討利用細(xì)胞因子推斷硬膜下血腫形成時間的可行性。

2 材料與方法

2.1 研究對象及分組

選取2014年9月至2016年9月間符合條件的非急性硬膜下血腫住院患者30例（男26例，女4例）；年齡46～73歲，平均（64.5±7.3）歲；23例有明確外傷史；6例伴有顱骨骨折。

其中，納入病例需符合以下條件：影像學(xué)檢查初次發(fā)現(xiàn)血腫時，血腫量估算不超過10mL，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀無或輕微，依據(jù)臨床癥狀及CT或MRI檢驗結(jié)果的變化證實血腫為慢性進(jìn)程，隨病程發(fā)展，患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀逐漸加重，所有病例均為單側(cè)幕上血腫，全部采取局麻下顱骨鉆孔沖洗引流術(shù)抽取血腫，術(shù)前估算血腫量范圍50～100mL；初次檢出血腫后超過3d出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，超過7d行顱骨鉆孔沖洗引流術(shù)；患者術(shù)前60d內(nèi)無急慢性感染性疾病史，術(shù)前凝血功能檢測正常，顱腦以外器官及組織無輕傷（含）以上程度損傷。

分組：納入患者初次發(fā)現(xiàn)血腫至手術(shù)之間的時間間隔不同，最短7d，最長64d，平均（31±7）d。依據(jù)血腫形成時間不同分為3組：7～14d血腫組（A組，9例）；15～21d血腫組（B組，8例）；22d以上血腫組（C組，13例）。

2.2 檢材采集

所有病例均在局麻下行顱骨鉆孔沖洗引流術(shù)，術(shù)中收集未沖洗前抽出的血腫液10mL和患者靜脈血3mL備檢。同年齡段的10名志愿者（8男，2女，凝血功能正常，近期無感染性疾病史）分別空腹抽取靜脈血3mL作為健康外周血對照組。所采靜脈血均置于3.2%枸椽酸鈉抗凝（1∶9）真空采血管，血腫液置于干燥試管，3000r/min離心10min（離心半徑4cm），分離出血清或上清液。全部檢材-80℃冰箱低溫保存?zhèn)錂z。（本研究符合患者所在醫(yī)院人體試驗委員會所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，得到批準(zhǔn)予以實施，并與患者家屬及自愿者簽署實驗知情同意書。）

2.3 檢測方法

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血腫液及靜脈血中IL-23和MMP-9含量。IL-23 ELISA kit購自廣州威佳科技有限公司，Human MMP-9 PicoKineTMELISA Kit 試劑盒購自博士德生物工程有限公司，各步驟均依照儀器和ELISA檢測試劑盒說明書要求進(jìn)行操作。凍存的上清液樣本室溫溶解后，將待測樣品加入不同抗體包被的96孔板，加入反應(yīng)緩沖液后37℃封閉40min，洗滌后添加酶標(biāo)抗體，37℃孵育40min，TMB底物顯色后，加入硫酸終止反應(yīng)。應(yīng)用意大利SD11/XT-96MB酶標(biāo)儀檢測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出IL-23、MMP-9表達(dá)水平，單位為pg/mL。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；采用t檢驗；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

與健康志愿者和同組患者外周血比較，血腫內(nèi)IL-23含量顯著提高。隨血腫形成時間延長，IL-23含量逐漸下降，在7～14天血腫組（A組）含量最高，15～21天血腫組（B組）降低，22天以上血腫組（C組）最低，如圖1所示，分別是同組患者外周血內(nèi)IL-23含量的40.1倍、29.4倍和23.0倍，不同時間組之間差異顯著（P＜0.01）。與健康志愿者外周血內(nèi)IL-23含量相比較，各組血腫患者外周血IL-23含量雖明顯增高（P＜0.05），但組間差異不明顯（P＞0.05）。

圖1 非急性硬膜下血腫患者血腫液和外周血內(nèi)IL-23含量變化（pg/mL， x±s）

圖2 非急性硬膜下血腫患者血腫液MMP-9含量變化（pg/mL， x±s）

與健康志愿者和同組患者外周血比較，血腫內(nèi)MMP-9含量顯著提高，不同時間組之間差異顯著（P＜0.01）。隨血腫形成時間延長MMP-9含量逐漸增加，7～14天血腫組（A組）含量最低，15～21天血腫組（B組）開始增高，22天以上血腫組（C組）最高，如圖2所示，分別是同組患者外周血內(nèi)MMP-9含量的25.4倍、54.0倍和71.9倍。與健康志愿者外周血內(nèi)IL-23含量相比較，各組血腫患者外周血MMP-9含量雖明顯增高（P＜0.05），但組間差異不明顯（P＞0.05）。血腫和靜脈血內(nèi)IL-23和MMP-9含量變化如表所示。

表 非急性硬膜下血腫患者血腫液和外周血內(nèi)IL-23和MMP-9含量變化（pg/mL， x±s）

4 討 論

損傷時間推斷是法庭科學(xué)研究的熱點和難點問題。目前，皮膚、肌肉等軟組織損傷形成時間的推斷已經(jīng)取得了關(guān)鍵性進(jìn)展，硬膜下血腫形成時間推斷仍缺乏有效方法，導(dǎo)致硬膜下血腫與爭議外傷之間是否存在關(guān)聯(lián)成為法醫(yī)學(xué)鑒定中的疑難問題。尋找硬膜下血腫形成時間推斷的靈敏指標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)化的形成時間推斷方法具有現(xiàn)實的法醫(yī)學(xué)實踐意義。

炎癥反應(yīng)、新生血管生成是創(chuàng)傷或疾病發(fā)展過程中必不可少的病理過程，與炎癥反應(yīng)、新生血管生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子越來越多的被應(yīng)用于損傷時間推斷[6-8]。研究證實，局部炎癥反應(yīng)、新生血管的形成及再出血可能是慢性硬膜下血腫發(fā)生、發(fā)展的重要機制，與之相關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子在慢性硬膜下血腫內(nèi)高表達(dá)已經(jīng)被證實[9-11]，但表達(dá)是否呈現(xiàn)時序性仍屬未知。炎癥反應(yīng)和新生血管生成分別在損傷后的不同時段占優(yōu)勢，因此，我們設(shè)想促炎性和促血管生成的細(xì)胞因子在硬膜下血腫發(fā)展的不同時程內(nèi)發(fā)揮作用，可能具有時序性表達(dá)規(guī)律，可作為血腫形成時間推斷的指標(biāo)。

IL-23是具有顯著促炎作用的細(xì)胞因子，與許多疾病組織炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，在多種損傷和疾病的炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮作用[12]，但在法醫(yī)學(xué)損傷時間推斷方面目前尚未見相關(guān)報道。MMP-9為明膠酶，主要由單核及巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞分泌，可降解明膠和Ⅳ型膠原，對纖維結(jié)合素、彈性蛋白也有降解作用，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)減低血管生成的阻力， 并通過活化和釋放血管生成因子而促進(jìn)血管的生成。李小林等通過大鼠腦損傷模型的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)腦損傷后MMP-9呈現(xiàn)時序性規(guī)律表達(dá)，可用于腦損傷時間推斷[13]。李剛蓮等通過大鼠皮膚切創(chuàng)模型發(fā)現(xiàn)MMP-9在皮膚損傷組織內(nèi)的表達(dá)具有良好的時間相關(guān)性，可成為皮膚損傷時間推斷的指標(biāo)[14]。MMP-9已經(jīng)成為損傷時間推斷的研究熱點，但在硬膜下血腫形成時間推斷方面尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)研究報道。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)的檢測結(jié)果較之HE染色、免疫組化、原位雜交等法醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察方法具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，已經(jīng)成為研究創(chuàng)傷、疾病等病理過程中關(guān)鍵性細(xì)胞因子含量變化的重要技術(shù)手段。

本實驗分別檢測非急性硬膜下血腫及外周靜脈血中IL-23和MMP-9含量的變化。結(jié)果顯示，與健康志愿者和同組患者的外周血比較，硬膜下血腫患者血腫內(nèi)IL-23、MMP-9的含量均顯著提高，提示新生血管生成和局部炎癥反應(yīng)是非急性硬膜下血腫的發(fā)生、發(fā)展的重要機制，而IL-23、MMP-9可能是相關(guān)病理進(jìn)程中的關(guān)鍵性細(xì)胞因子。

隨血腫形成時間延長IL-23含量逐漸下降，7～14d血腫組含量最高，15～21d血腫組降低，22d以上血腫組最低，分別是同組患者外周血內(nèi)IL-23含量的40.1倍、29.4倍和23.0倍，不同時間組之間差異顯著（P＜0.01）。與之相反，血腫內(nèi)MMP-9含量隨血腫時間延長而逐漸增加，分別是同組患者外周血內(nèi)MMP-9含量的25.4倍、54.0倍和71.9倍，各時間組之間同樣差異顯著（P＜0.01）。IL-23和MMP-9隨血腫形成時間而呈現(xiàn)的時序性變化規(guī)律為硬膜下血腫形成時間推斷提供了可能。同時，IL-23、MMP-9含量的不同變化規(guī)律提示IL-23可能在硬膜下血腫發(fā)生和發(fā)展的早期發(fā)揮作用，而MMP-9在非急性硬膜下血腫發(fā)展的中晚期起作用。

本實驗中，血腫患者與健康自愿者外周血相比較，IL-23，MMP-9含量亦顯著增高（P＜0.05），但各時間組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），這提示細(xì)胞因子全身性的含量變化尚無法應(yīng)用于損傷時間推斷，而創(chuàng)傷局部組織內(nèi)細(xì)胞因子的變化更具有法醫(yī)學(xué)意義。

與皮膚損傷、顱腦損傷時間推斷中動物建模不同，由于血腫量無法人為控制，統(tǒng)一的外傷性硬膜下血腫動物模型建立尚無法實現(xiàn)，因此符合實驗構(gòu)想的臨床病例樣本和檢材的收集成為本研究的關(guān)鍵。本實驗在檢材收集過程中盡量避免各種可能的干擾因素，力求實驗樣本的標(biāo)準(zhǔn)、統(tǒng)一。我們將初次發(fā)現(xiàn)血腫至手術(shù)之間的時間間隔假定為血腫形成時間，并據(jù)此分組，而對于血腫發(fā)生至初次檢出之間的時間尚無法評估。本研究首次嘗試通過血腫內(nèi)細(xì)胞因子的含量變化推斷硬膜下血腫形成時間，實驗結(jié)果高度提示具有進(jìn)一步研究的價值，將更多的細(xì)胞因子納入檢測范圍，提高時間分組的精確度將成為今后研究工作的重點。

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D919

A

2095-7939（2017）05-0086-04

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.05.017

2017-05-09

公安部技術(shù)研究計劃項目（編號：2014JSYJB013）。

杜宇（1977-），男，山東新泰人，中國刑事警察學(xué)院法醫(yī)學(xué)系副教授，博士，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究。

（責(zé)任編輯：孟凡騫）