苯基衍生化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定尿樣中氰離子

李 想 朱 昱 夏鑫鑫 宋 輝 伊魁宇

（中國刑事警察學(xué)院法化學(xué)系 遼寧 沈陽 110035）

苯基衍生化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定尿樣中氰離子

李 想 朱 昱 夏鑫鑫 宋 輝 伊魁宇

（中國刑事警察學(xué)院法化學(xué)系 遼寧 沈陽 110035）

建立尿中氰離子的衍生化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定方法。通過苯胺與亞硝酸鹽生成的重氮鹽與氰離子發(fā)生反應(yīng)，衍生物用GC/MS/MS進(jìn)行檢測。優(yōu)化了衍生化溫度和時間、催化劑用量、衍生化試劑的用量等衍生化條件。在最佳條件下，氰離子衍生物穩(wěn)定且色譜峰形良好，在0.1～10μg/mL范圍內(nèi)，檢出限為0.030μg/mL，測量限為0.10μg/mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.61%，相對回收率為96.12%。該方法回收率高，專屬性好，可用于尿中氰離子的定量測定。

苯胺 衍生化 GC/MS/MS 氰離子

1 引言

氰化物在工業(yè)中使用很廣泛，經(jīng)常發(fā)生職業(yè)性氰化物中毒的情況。在社會上也有用氰化物自殺或他殺的情況。氰化物因其所具有的劇毒性，在刑事毒物案件的分析中受到高度重視，致死原因主要是通過氰化物進(jìn)入人體后所釋放出的氰基（CN-）與人體內(nèi)的細(xì)胞色素氧化酶中的三價鐵進(jìn)行結(jié)合，使得細(xì)胞傳遞氧的功能喪失，最終導(dǎo)致機(jī)體的缺氧死亡。氰化物中毒案件的高發(fā)性和高致命性使其定量定性分析在司法鑒定中具有非常重要的意義。

近年來，人們將科學(xué)研究的重點放在高效樣品前處理技術(shù)與靈敏的檢測手段相結(jié)合方面，促使分析生物檢材中氰化物的檢測有了很大的進(jìn)展，并且極大地提高了氰化物定性定量分析的靈敏度和專屬性。色譜法[1-6]等新型技術(shù)手段逐步取代了傳統(tǒng)的檢測方法，如分光光度法[7]、硝酸銀滴定法[8]等。對于生物檢材中的氰化物分析主要是通過將其衍生化為大分子物質(zhì)后再進(jìn)行定性定量分析，在此過程中發(fā)展出多種衍生化試劑，同時應(yīng)用高靈敏的檢測技術(shù)，使生物檢材中痕量甚至超痕量氰化物的檢測分析得以實現(xiàn)。

目前對于氰離子檢測的色譜方法有許多，包括離子色譜法[1]69-71、氣相色譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[3-4]、液相色譜法[5]587-589、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用[6]143-147等方法。離子色譜法共存離子干擾大，易受內(nèi)源雜質(zhì)干擾。衍生化頂空氣相色譜法[2]39-43是目前分析氰化物的一種較為常用的氣相色譜分析方法，使用電子捕獲器進(jìn)行檢測，雖然靈敏度高，但定性分析特異性差。衍生化頂空GC/MS方法[4]31-34，使用五氟芐基溴做衍生化試劑，衍生化效率低，容易出現(xiàn)內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾。液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用使用衍生化方法，但衍生產(chǎn)物在生物檢材中穩(wěn)定性不佳，重現(xiàn)性不好。本文采用衍生化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法檢測尿液中的氰離子，由于氰離子檢測易受內(nèi)源雜質(zhì)干擾，經(jīng)過衍生化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法可有效提高檢測專屬性，衍生物穩(wěn)定性好。

2 實驗方法

2.1 儀器與試劑

Finnigan PolarisQ氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀；高速離心機(jī)；渦旋混合器。苯胺購置于沈陽市試劑一廠，純度大于99.5%；氯代芐、鹽酸、亞硝酸鈉、硫酸銅均購置于國藥集團(tuán)試劑有限公司，分析純；氰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液購置于北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，濃度為100μg/mL。

2.2 溶液配制

尿液中添加氰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成標(biāo)準(zhǔn)添加尿樣，取100μg/mL氰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液10mL用尿液稀釋至100mL；用甲醇配制成濃度為1.0mg/mL的氯代芐溶液；用環(huán)己烷配制成濃度為0.15mol/mL的苯胺溶液；用水配制成濃度為50mg/mL的亞硝酸鈉溶液；用水配制成濃度為0.1mol/L的硫酸銅溶液；用水配制成濃度為1mol/L的鹽酸溶液。

2.3 樣品制備

取尿樣1mL，加5μL氯代芐溶液，渦旋離心。加入0.25mL苯胺衍生化試劑，0.5mL亞硝酸鈉溶液，0.1mL硫酸銅溶液，以0.05mL鹽酸溶液，渦旋混合1min。放入50℃水浴鍋中加熱15min。將溶液渦旋后離心，取上清液1μL，備檢。

2.4 GC-MS條件

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；載氣為高純氦氣，流速為1.0mL/min；進(jìn)樣口溫度為280℃。色譜柱升溫程序：初始柱溫為60℃，保持1min，以20℃/min升至80℃，再以5℃/min升至95℃，最后以20℃/min升至280℃。

MS條件：溶劑延遲3min；一級質(zhì)譜掃描范圍50～200amu；電子轟擊源能量70eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度200℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜定性分析

由于氰離子無法直接提取至有機(jī)相中，需將水性樣品基質(zhì)中氰離子衍生化成有機(jī)物后進(jìn)行分析。將苯胺與亞硝酸鈉反應(yīng)生成重氮鹽，再與氰離子發(fā)生親核取代反應(yīng)，生成衍生化產(chǎn)物苯甲腈。氰離子的衍生化反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 氰離子衍生化反應(yīng)式

衍生化產(chǎn)物苯甲腈及內(nèi)標(biāo)物氯代芐用GC/MS/MS進(jìn)行分析的二級質(zhì)譜總離子流色譜圖和質(zhì)譜圖如圖2和圖3所示。從圖2中可以看出苯甲腈和氯代芐的峰形良好，保留時間分別為4.83min和5.3min。苯甲腈和氯代芐的二級質(zhì)譜特征離子峰分別為76m/z和65m/z。可結(jié)合二級質(zhì)譜特征離子峰及保留時間進(jìn)行分析。

圖2 苯甲腈和氯代芐的二級質(zhì)譜總離子流圖

圖3 苯甲腈和氯代芐的二級質(zhì)譜圖

3.2 衍生化條件的選擇

3.2.1 衍生化溫度和時間

較高的反應(yīng)溫度、較長的衍生化時間有利于衍生化完全進(jìn)行。為考察衍生化溫度和時間對反應(yīng)產(chǎn)率所產(chǎn)生的影響，移取10μg/mL氰離子的尿樣標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，按照2.3項進(jìn)行實驗，分別對反應(yīng)溫度和時間進(jìn)行考察。實驗研究表明本衍生化反應(yīng)在50℃水浴時，衍生化反應(yīng)速度適中，反應(yīng)完全。如繼續(xù)升高反應(yīng)溫度則反應(yīng)劇烈，不易控制反應(yīng)進(jìn)程。當(dāng)反應(yīng)溫度為50℃時考察衍生化時間，發(fā)現(xiàn)時間超過15min，苯甲腈與氯代芐的色譜峰面積之比不隨時間延長變化。因此選擇苯基衍生化反應(yīng)溫度為50℃水浴，反應(yīng)時間為15min。

3.2.2 催化劑用量

催化劑用量要適量，用量不足，反應(yīng)進(jìn)行過慢，或無法達(dá)到衍生化要求；用量過大，會有少部分催化劑進(jìn)入有機(jī)相，影響檢測結(jié)果。為了考察催化劑用量對反應(yīng)產(chǎn)率所產(chǎn)生的影響，移取10μg/mL氰離子的尿樣標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL，按照2.3項中方法分別加入0.02mL、0.1mL、0.2mL的硫酸銅溶液，衍生化后進(jìn)行GC/MS/MS測定。結(jié)果表明：當(dāng)硫酸銅溶液用量為0.1mL時，衍生化反應(yīng)完全，試劑用量超過0.1mL時，響應(yīng)值基本不變，但譜圖中雜質(zhì)峰增加。綜合考慮，本實驗硫酸銅溶液用量為0.1mL。

3.2.3 衍生化試劑用量

取1 mL 10μg/mL氰離子的尿樣標(biāo)準(zhǔn)溶液3份，按2.3項中方法分別加入0.1mL、0.25mL、0.5mL的苯胺溶液，衍生化后進(jìn)行GC/MS/MS測定。結(jié)果表明：當(dāng)苯胺溶液用量為0.25mL時，衍生化反應(yīng)完全，試劑用量超過0.25mL時，響應(yīng)值基本不變，但譜圖中雜質(zhì)峰增加。綜合考慮，本實驗苯胺溶液用量為0.25mL。

3.3 線性范圍和檢出限

取1mL空白尿樣添加氰離子0.1μg，按照2.3項方法進(jìn)行分析，根據(jù)S/N=3∶1確定方法檢出限為0.030μg/mL，根據(jù)S/N=10∶1確定方法測量限為0.10μg/mL。取6份1 mL空白尿樣，分別添加氰離子，添加量各為0.1μg、0.5μg、2μg、5μg、8μg、10μg，上述溶液中加入氯代芐5μL，按照2.3項方法進(jìn)行分析，以苯甲腈和氯代芐色譜峰面積比值（Y）和氰離子濃度與氯代芐濃度比值（X）做線性回歸，得到方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=1.47X-0.02，γ=0.9983。

3.4 回收率和精密度

在0.1～10μg/mL的線性范圍內(nèi)采用氰離子加標(biāo)的方法進(jìn)行回收實驗，分別添加0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL 3個水平的氰離子標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個加標(biāo)尿樣平行測定6次。結(jié)果表明，不同加標(biāo)尿樣平均回收率分別為94.34%、95.92%和98.08%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.16%。

3.5 實際樣品測定

對作者所在單位受理的1起氰化物案件，用本文實驗方法進(jìn)行測定，得到案件樣本的二級質(zhì)譜總離子流圖，如圖4所示，譜圖顯示在實際案件中無干擾物質(zhì)的影響。尿樣中檢出氰離子成分，其含量為5.6μg/mL；說明本方法在尿樣分析中是可行的，能夠滿足尿樣中氰離子的檢測要求。

圖4 案件樣本中苯甲腈和氯代芐的二級質(zhì)譜總離子流圖

4 結(jié)論

由于氰化物中毒案件中的送檢檢材多數(shù)為生物檢材，生物檢材的特點是組分復(fù)雜且雜質(zhì)干擾較大。因此，使用傳統(tǒng)的檢測方法測定氰離子時不能將目標(biāo)物從復(fù)雜基質(zhì)中分離提取出來，從而達(dá)到分離分析的目的。同時，對氰化物進(jìn)行定性分析時特異性較差，并且由于生物檢材中復(fù)雜基質(zhì)的干擾易使檢驗結(jié)果出現(xiàn)假陽性，使分析結(jié)果的準(zhǔn)確度降低。

本文所采用的衍生化方法，建立了尿樣中氰離子的檢測手段。利用該衍生化方法，有效減少了尿樣中雜質(zhì)的干擾，提高了氰離子檢測的專屬性和靈敏度。通過對案件尿液樣品的分析實驗，證明了方法的可行性和實用性，為尿樣中氰離子的檢測手段提供了新的檢測方法。

[1]王勇.離子色譜法檢驗液中氰化物[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2011(4):69-71.

[2]Felby S.Determination of cyanide in blood by reaction headspace gas chromatography [J]. Forensic Science Medicine Pathology,2009(1):39-43.

[3]Desharnais, Huppé, MLamarche. et al. Cyanide quantification in post-mortem biological matrices by headspace GC-MS[J].Forensic Science International,2012(6):346-351.

[4]魏萬里.GC-MS/MS法檢驗生物檢材中的無機(jī)氰化物[J].刑事技術(shù),2009(6):31-34.

[5]孟梁,申貴雋,張強(qiáng).金屬配位劑衍生-高效液相色譜法測定糧食及白酒中的游離氰化物[J].分析科學(xué)學(xué)報,2009(5):587-589.

[6]Lacroix C,Sauaaereau E. Online liquid chromatography-tandem mass spectrometry cyanide determination in blood[J].Journal of Analytical Toxicology,2011(3):143-147.

[7]韓英.原子吸收分光光度計對生活飲用水中氰化物的測定[J].中國農(nóng)村衛(wèi)生,2016(22):53-54.

[8]趙玉娥.銀量法測定氰化物的指示劑[J].黃金,1990(5):60.

O657.63

A

2095-7939（2017）05-0083-03

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.05.016

2017-05-09

李想（1987-），女，山東蓬萊人，中國刑事警察學(xué)院法化學(xué)系助理實驗師，主要從事毒品毒物檢驗研究。

（責(zé)任編輯：孟凡騫）