高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)血清中合成大麻素JWH-203

徐秀明

（遼寧警察學(xué)院刑事技術(shù)系 遼寧 大連 116036）

高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)血清中合成大麻素JWH-203

徐秀明

（遼寧警察學(xué)院刑事技術(shù)系 遼寧 大連 116036）

通過篩選選擇性的SPE材料，優(yōu)化SPE條件，建立了血清中合成大麻素JWH-203的固相萃取-液相色譜-電噴霧三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法，血清中JWH-203濃度在4ng/mL～200ng/mL范圍具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限為0.2ng/mL。日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于3.5%，日間RSD小于8.6%，空白添加法測(cè)定方法的回收率為97%～103%，并考察了該方法的基質(zhì)效應(yīng)和處理效率。該方法可為法庭科學(xué)中血液樣品中JWH-203的檢驗(yàn)鑒定提供技術(shù)支持。

液質(zhì)聯(lián)用 新精神活性物質(zhì) 合成大麻素 JWH-203 “香料”類毒品

1 引言

“香料”類毒品是自2004年開始銷售于歐洲的便利店或網(wǎng)上商店，2008年開始在世界各國(guó)流行的一種新型毒品[1]，其主要成分是合成大麻素類化合物，這是一大類模擬天然大麻的主要活性成分四氫大麻酚而合成的一類化合物，它們與四氫大麻酚具有相似的藥理與生理作用，都是大麻素受體（CB1和/或CB2）的受體激動(dòng)劑[2-3]。“香料”類毒品是將一種或幾種合成大麻素溶解于有機(jī)溶劑中，然后噴灑在香料或藥草上，干燥后形成的。該類毒品通常被冠以“無成癮性”、“草本興奮劑”、“合法興奮劑”、“合法嗨藥”等欺騙性的名稱，使人在好奇心的趨使下服用此類毒品[4]。商品名稱以“K2”或“Spice”著稱，另有Genie（精靈）、Zohai（佐海）、音樂小草等。實(shí)際上，其成癮性與大麻類似，作用于人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)興奮、致幻等，效果是大麻的4-5倍[3]。這些合成大麻素種類很多，有萘甲酰吲哚類（JWH-018，JWH-073，JWH-210，JWH-015等）、苯乙酰吲哚類（JWH-203，JWH-250）、環(huán)己基苯酚類（CP-47，497，CP-47，497-C8等），以及大麻酚經(jīng)典結(jié)構(gòu)（HU-210）等多種結(jié)構(gòu)類型，通常是根據(jù)發(fā)明者的姓名、發(fā)明時(shí)間及化合物結(jié)構(gòu)，分別被編號(hào)為不同系列的代碼[5]。聯(lián)合國(guó)毒品與犯罪問題辦公室（UNODC）在2016年世界毒品報(bào)告《World Drug Report 2016》中指出，2015年中UNODC成員國(guó)監(jiān)測(cè)到了21種新的合成大麻素類化合物，主要濫用人群是青少年，這些香料類的毒品一般是卷成香煙或以煙斗的形式，通過燃燒吸食。目前，我國(guó)尚沒有對(duì)合成大麻素類物質(zhì)的整體濫用情況開展監(jiān)測(cè)，整體濫用情況還不清楚，但遼寧、北京、浙江等地的公安機(jī)關(guān)在查獲的植物碎葉或花瓣樣品中都檢出了合成大麻素，主要是90后人群在娛樂場(chǎng)所中濫用。

JWH-203是一種苯乙酰吲哚類的合成大麻素，是由John W. Huffman合成并命名的，中文名稱為1-戊基-3-（2-氯苯乙?；┻胚幔⑽拿麨?-（2-Chlorophenyl）-1-（1-pentyl-1H-indol-3-yl）ethanone。2010年10月29日，歐洲毒品和毒品成癮檢測(cè)中心（European Monitoring Centre of Drugs and Drug Abuse，EMCDDA）的早期預(yù)警系統(tǒng)（Early Warning System，EWS）首次報(bào)道了這種新型合成大麻素，由拉脫維亞的有機(jī)合成機(jī)構(gòu)鑒定出了這種合成大麻素，并且是來自中國(guó)的1.8公斤JWH-018的粉末。2016年2月，國(guó)家禁毒委員會(huì)辦公室發(fā)布的《2015年中國(guó)毒品形勢(shì)報(bào)告》中指出：包括合成大麻素在內(nèi)的新精神活性物質(zhì)是通過國(guó)外訂單的形式在中國(guó)生產(chǎn)的。在2015年10月，我國(guó)已將JWH-203列入管制藥品目錄。Huffman研究了JWH-203的藥理活性，該化合物與大麻素受體CB1和CB2都具有很強(qiáng)的作用能力[6]。合成大麻素類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用法[7-8]、液相色譜法[9-10]、液質(zhì)聯(lián)用法[11-13]、超臨界流體色譜法[14]等。關(guān)于JWH-203檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要是針對(duì)固體粉末和“香料”草本植物中該合成大麻素的檢測(cè)[15]，生物檢材中JWH-203的檢測(cè)僅Kneisel S等報(bào)道了采用液液萃取-液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)血液中合成大麻素JWH-203，方法回收率低，僅為54.7%[16]。本文通過優(yōu)化篩選固相萃取材料，建立了血清中JWH-203檢測(cè)的SPE-LC-MS/MS方法，大大提高了回收率，有效去除了蛋白質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾，提高了檢測(cè)靈敏度。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Agilent液質(zhì)聯(lián)用儀（Agilent 1200 infinity LC系統(tǒng)，配有電噴霧離子源的Agilent 6460 Triple Quadrupole質(zhì)譜系統(tǒng)），0.1mg電子天平，Millipore Simplicity純水制備系統(tǒng)。

標(biāo)準(zhǔn)品JWH-203，純度大于98%，購(gòu)于美國(guó)Cato公司。甲醇為色譜純（Oceanpark），所用水為超純水。

2.2 樣品溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：使用分析天平準(zhǔn)確稱取JWH-203的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末1mg，用甲醇定容于5mL容量瓶中，得到濃度為200μg/mL的儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于冰箱（-20℃）中備用。

校準(zhǔn)溶液的制備：向500μL不含藥物的血清中添加10μL適量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成JWH-203濃度分別為4、10、40、100和200 ng/mL系列溶液作為校準(zhǔn)溶液。

質(zhì)控樣品的制備：向500μL不含藥物的血清中添加適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，JWH-203濃度分別為4、40和200ng/mL。

2.3 樣品處理

血清樣品（添加藥物JWH-203及空白血清）的處理采用固相萃?。⊿PE）方法，實(shí)驗(yàn)用SPE柱為華譜60-C18 HCE 100mg柱，500μL血清樣品中加入1.5mL超純水稀釋后，加入2mL甲醇，渦旋5min，超聲15min，離心20min（4200r/min），上清液作為SPE上樣液。SPE條件：活化（2mL甲醇），平衡（1mL 50%甲醇-水），上樣（4mL離心處理的上清液），淋洗（0.5mL 50%甲醇-水），洗脫（1mL 80%乙腈-水，洗脫液含0.2%甲酸）。洗脫液經(jīng)過40℃氮吹，干燥后，100μL甲醇復(fù)溶，以備LC-MS分析。

2.4 儀器條件

LC條件色譜柱：華譜C18（2.1×50mm，3μm），柱溫30℃；流動(dòng)相：甲醇-水，流速0.2mL/min，初始時(shí)甲醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，保持3.5min，3.5min至5.5min內(nèi)，甲醇的體積分?jǐn)?shù)增至100%，保持9.5min。流動(dòng)相恢復(fù)至80%甲醇的初始流動(dòng)相后，柱平衡5min，再準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣；進(jìn)樣體積5μL。

質(zhì)譜條件采用電噴霧離子化模式（ESI），根據(jù)化合物的性質(zhì)選擇正離子檢測(cè)；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM模式），監(jiān)測(cè)母離子m/z為340.1，定量子離子m/z為125.0，定性子離子m/z為188.0。對(duì)質(zhì)譜條件采用單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最優(yōu)的檢測(cè)條件為：毛細(xì)管電壓4000V（+），干燥氣為氮?dú)?，流?0L/min，干燥氣溫度為350℃，霧化器壓力為50psi，鞘氣流速為11L/min，鞘氣溫度為350℃。

3 結(jié)果與討論

3.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

血液樣品體系中含有大量的蛋白質(zhì)、磷脂等雜質(zhì)，不僅會(huì)因?yàn)榛|(zhì)效應(yīng)影響檢測(cè)的靈敏度，而且在液相色譜柱中分離時(shí)，蛋白質(zhì)大分子也會(huì)堵塞柱系統(tǒng)，造成柱壓快速上升，影響色譜柱的使用壽命。因此，有效去除血液樣品中的蛋白質(zhì)等大分子是十分必要的。以往的文獻(xiàn)中，常規(guī)血液樣本中蛋白質(zhì)的去除多采用乙腈沉淀蛋白，再經(jīng)微孔濾膜過濾的方法。在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)常用的0.22μm的微孔濾膜（Nylon膜和PES膜）對(duì)目標(biāo)物JWH-203都存在嚴(yán)重的吸附效應(yīng)，吸附損失在30%～70%，尤其是對(duì)低濃度的樣品吸附損失更嚴(yán)重。若是只用乙腈沉淀蛋白，不經(jīng)微孔濾膜過濾，多次進(jìn)樣后仍然會(huì)導(dǎo)致柱壓升高。因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇了SPE的前處理方法，采用60-C18 HCE 100mg的SPE小柱，該柱填料的材料表面帶有正電荷，對(duì)目標(biāo)物JWH-203除了疏水性作用外，還有電荷作用，有利于屏蔽材料表面硅羥基對(duì)JWH-203的作用，改善峰形，并且采用0.2%甲酸的乙腈-水（80:20，V:V）洗脫液進(jìn)行洗脫時(shí)，洗脫效率顯著高于常規(guī)C18-SPE柱。本實(shí)驗(yàn)采用60-C18 HCE 100mg的SPE小柱，對(duì)JWH-203的上樣、淋洗及洗脫條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，具體條件見“2.3”樣品處理部分，對(duì)100ng JWH-203標(biāo)準(zhǔn)品的回收率為95%～107%。

3.2 LC-MS檢測(cè)條件的選擇

質(zhì)譜條件優(yōu)化：從目標(biāo)物JWH-203的分子結(jié)構(gòu)可以看出，該分子容易產(chǎn)生[M+H]+，因此選擇正離子檢測(cè)模式，全掃描模式，得到JWH-203的分子離子峰（母離子）后，對(duì)分子離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離分析，根據(jù)得到的二級(jí)全掃描質(zhì)譜的主要碎片離子，確定定量和定性分析的子離子。然后，采用單因素實(shí)驗(yàn)的方法，優(yōu)化質(zhì)譜的各個(gè)參數(shù)使檢測(cè)的響應(yīng)值最大（具體條件參見“2.4”儀器條件）。本實(shí)驗(yàn)采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，有利于降低背景干擾，提高靈敏度。

色譜分離優(yōu)化：分別以甲醇、乙腈和水為流動(dòng)相，考察了不同條件下JWH-203的分析結(jié)果，最終選擇甲醇-水為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方式（具體分離條件見“2.4”儀器條件），JWH-203出峰后，保持甲醇沖洗柱系統(tǒng)，以便將樣品中的雜質(zhì)全部洗脫出來。

3.3 線性范圍與最低檢出限

將分別添加4、10、40、100和200ng/mL“2.2”中配制的血清樣品中JWH-203的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.3”樣品處理方法處理后，經(jīng)LC-MS分析，以血清中JWH-203的濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制曲線，擬合出線性回歸方程，Y =7 90.11 X + 583.10，R2= 0.9990。因此，該方法定量檢測(cè)血清中JWH-203濃度在4ng/mL～200ng/mL范圍具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)得血清中JWH-203的最低檢出限為0.2ng/mL。

3.4 回收率與精密度

通過測(cè)定線性范圍內(nèi)低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來考察方法的準(zhǔn)確性和精密度。按照“2.2”方法配制4、40、200ng/mL 3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行配制6份，按照“2.3”方法處理后，經(jīng)LC-MS分析，根據(jù)測(cè)定的定量離子峰面積和擬合的線性方程獲得方法的準(zhǔn)確度（相對(duì)回收率）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)濃度的相對(duì)回收率平均值（n=6）分別為102.12%、101.16%、97.53%。每個(gè)濃度同一天內(nèi)連續(xù)提取測(cè)定3次，并連續(xù)測(cè)定3天，得到方法的日內(nèi)精密度平均值為2.71%，日間精密度平均值為7.02%，詳細(xì)結(jié)果參見下表，表明方法不存在系統(tǒng)性偏差。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)與處理效率

液質(zhì)分析中，由于分析物的共流出組分會(huì)影響電噴霧接口的離子化效率，從而產(chǎn)出基質(zhì)效應(yīng)。基質(zhì)效應(yīng)是通過比較3個(gè)不同條件下的信號(hào)峰面積獲得的，Set1：JWH-203的甲醇溶液，Set2：血清樣品基質(zhì)經(jīng)SPE提取后添加JWH-203，Set3：血清中添加JWH-203后再經(jīng)SPE提取處理?；|(zhì)效應(yīng)（ME）= Set2 / Set1，提取回收率（RE）= Set3/ Set2，方法處理效率（PE）= Set3 / Set1。按照“2.2”方法配制4、40、200ng/mL 3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行配制6份，按照“2.3”方法處理后，經(jīng)LC-MS分析，通過測(cè)量各個(gè)濃度樣品的定量離子峰面積，獲得方法的基質(zhì)效應(yīng)、提取回收率和處理效率數(shù)值。從結(jié)果可以看出，所建立的SPE前處理方法的提取回收率大于82%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)[16]報(bào)道的回收率54.7%。方法的處理效率和相對(duì)回收率接近100%，完全滿足檢測(cè)需求。

表 血清中JWH-203的基質(zhì)效應(yīng)、回收率、處理效率和精密度

4 結(jié)論

本文建立了固相萃取-高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測(cè)血清中合成大麻素JWH-203的檢測(cè)方法，并系統(tǒng)考察了方法的線性范圍、精密度和基質(zhì)效應(yīng)等參數(shù)，國(guó)內(nèi)生物檢材中合成大麻素的檢測(cè)，目前尚未見于文獻(xiàn)報(bào)道，并且本文所建立檢測(cè)方法的回收率遠(yuǎn)高于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的液液萃取-液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)方法的回收率。鑒于國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新型毒品合成大麻素JWH-203主要是以固體粉末或植物基質(zhì)“香料”的形式，尚未有吸毒人員的案例報(bào)道，因此，沒有將該檢材方法應(yīng)用于實(shí)際案例中血清樣品的檢測(cè)，但該方法的建立可以給法庭科學(xué)中血液樣品中合成大麻素JWH-203的檢驗(yàn)鑒定提供借鑒和技術(shù)支持。

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O657.63

A

2095-7939（2017）05-0079-04

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.05.015

2017-03-30

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（編號(hào)：L2014510）。

徐秀明（1980-），女，山東淄博人，遼寧警察學(xué)院刑事技術(shù)系講師，博士，主要從事毒品毒物分析檢驗(yàn)研究。

（責(zé)任編輯：孟凡騫）