藏茵陳4種有效成分的含量測(cè)定

張慧，楊孟妮，李洋，劉娟，李文婷，夏厚林

藏茵陳4種有效成分的含量測(cè)定

張慧，楊孟妮，李洋，劉娟，李文婷，夏厚林

目的：建立藏茵陳4種有效成分的含量測(cè)定方法，并測(cè)定10批不同來源的含量。方法：采用HPLC（高效液相色譜法）法，同時(shí)測(cè)定藏茵陳中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷和芒果苷的含量，采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm（獐牙菜苦苷）、274 nm（龍膽苦苷）、246 nm(獐牙菜苷)和258 nm（芒果苷）。結(jié)果：建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定藏茵陳中四種有效成分含量的方法，四種成分分離度良好，方法學(xué)考察符合要求。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可靠性好，可用于同時(shí)測(cè)定藏茵陳中四種有效成分的含量。

藏茵陳；有效成分；HPLC；含量測(cè)定

藏茵陳為多基源藥材，本研究所用藏茵陳（Artemisiae)為來源于龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬（Swertia)植物川西獐牙菜（Swertia mussotii Franch.)印度獐牙菜（Swertia chirayita (Roxb.ex Flemi)Karste.)的干燥全草。藏茵陳是貴重的八珍藏藥之一，藏藥名為蒂達(dá)，為藏藥中最具特色的治療‘赤巴’病，清諸熱，治血病，膽病等的常用藥[1]。藏醫(yī)所說的赤巴諸癥與漢醫(yī)理論中的中焦諸病略同，特別是廣義的肝膽癥更接近赤巴癥。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，其所含獐牙菜苦苷主要具有清熱、消炎等生理作用[2～5]。獐芽菜苷能有效保護(hù)肝細(xì)胞，并能促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)[6,7]，龍膽苦苷具有保肝、健胃、抗氧化等作用[8]，芒果苷主要具有抗氧化[9,10]、抗結(jié)核[11]和抗菌作用[12,13]以及保肝利膽作用。

根據(jù)本課題組前期藥理篩選顯示其活性成分集中在大極性部位。由于上述4種成分在大極性部位含量相對(duì)較高，而其藥理作用又與古籍記載的清肝膽，解諸熱等功效息息相關(guān)，因此對(duì)該4種成分進(jìn)行含量測(cè)定，有著重要的意義。由于HPLC法常用于單體成分含量的測(cè)定，故本實(shí)驗(yàn)擬采用HPLC法建立同時(shí)測(cè)定4種有效成分含量的方法。本方法準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性好，可用于藏茵陳的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS124S電子分析天平（十萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器，北京有限公司)，HPLC高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200 Series)，KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷（購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司 中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，經(jīng)HPLC面積歸一化法檢測(cè)含量達(dá)到98%以上)，甲醇（色譜純)，磷酸（色譜純)，水（超純水)，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

藥材來源見表1，S1、S3、S6和S10藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授初步鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物川西獐牙菜的干燥全草；S2、S4、S5、S7、S8和S9藥材初步鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物印度獐牙菜的干燥全草；S11為S1的花葉部分；S12為S1的根莖部分。

表1 實(shí)驗(yàn)用藏茵陳樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱量獐牙菜苦苷，龍膽苦苷，獐牙菜苷和芒果苷對(duì)照品各適量，加甲醇配制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，取適量?jī)?chǔ)備液稀釋至每1 mL含獐牙菜苦苷0.2 mg，龍膽苦苷0.06 mg，獐牙菜苷0.14 mg，芒果苷0.5 mg，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取本品粉末（過四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超聲處理（功率600W，頻率40kHz)1h，過濾，加甲醇定容至25 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1色譜條件 以島津Inertsil ODS-3 C18（250*4.6mm，5μm)為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm（獐牙菜苦苷)、274 nm (龍膽苦苷)、246 nm（獐牙菜苷)和258 nm（芒果苷)；流速：1.0 mL﹒min-1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL；采集時(shí)間：30 min，洗脫程序見表1。在此條件下藏茵陳中獐牙菜苦苷（保留時(shí)間為：12.08 min)，龍膽苦苷（保留時(shí)間為：16.12 min)，獐牙菜苷（保留時(shí)間為：18.87 min)，芒果苷（保留時(shí)間為：26.67 min)與其他組分在30 min內(nèi)均能達(dá)到基線分離(見圖1)

表1 流動(dòng)相比例表

圖1 藏茵陳對(duì)照品HPLC色譜圖

圖2 藏茵陳樣品HPLC色譜圖

2.2.2 線性關(guān)系的考察 分別取‘2.1.1’項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5mL、2mL、3mL、3.3mL、3.6mL、4mL，加相應(yīng)溶劑至4mL。分別進(jìn)樣20 μL。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積（A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程見表2。結(jié)果表明獐牙菜苦苷在0.5μg～4 μg，龍膽苦苷在0.15μg ～1.2 μg，獐牙菜苷在0.35μg ～2.8 μg，芒果苷在1.25μg ～10 μg之間有較好的線性關(guān)系。

表2 藏茵陳中4種成分線性回歸方程

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液，按“2.2.1”條件重復(fù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積，結(jié)果對(duì)照品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分別為0.67%，0.71%，0.70%，0.85%，表明方法精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取‘2.1.2’中供試液溶液20 μL，按“2.2.1”條件分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果樣品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分別為0.69%，1.26%，1.57%，0.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品粉末6份，各約0.5 g，精密稱定，制備成供試品溶液，按“2.2.1”條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分別為1.31%，1.40%，1.26%，1.28%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱定已知含量的藥材粉末0.25g共6份，精密加入適量獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷對(duì)照品按供試品溶液制備及測(cè)定法操作，進(jìn)行色譜分析，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的平均回收率分別為95.31%，92.70%，91.95%，94.87%，RSD分別為1.11%，1.05%，1.03%，0.54%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品測(cè)定

準(zhǔn)確吸取‘2.1.2’項(xiàng)下供試品溶液各20 μL, 注入液相色譜儀, 按測(cè)定法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3。由表可見不同來源的藏茵陳各有效成分的含量相差較大。

表3 樣品中各有效成含量（n=3)

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)對(duì)10批藏茵陳全草開展了4種有效成分的含量測(cè)定，由表3結(jié)果橫向觀察顯示：10個(gè)樣品中4種有效成分含量的高低順序都呈現(xiàn)出芒果苷＞獐牙菜苦苷＞獐牙菜苷＞龍膽苦苷；縱向觀察顯示：獐牙菜苦苷和芒果苷含量最高的批次都為購(gòu)自西藏的1601（編號(hào)S3)，龍膽苦苷含量最高的批次為購(gòu)自西藏的1511（編號(hào)S1)，獐牙菜苷含量最高的批次為購(gòu)自西藏的1603（編號(hào)S10)，4種成分含量最低的批次都為購(gòu)自新都的1602（編號(hào)S2)?？傮w來說各有效成分含量最高的批次都為西藏采購(gòu)，說明西藏采購(gòu)的質(zhì)量較優(yōu)。該含量差異可能與基源、環(huán)境以及采收加工有關(guān)。

3.2 獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷都屬于環(huán)烯醚萜苷類，該三成分的含量總和顯示：S1、S3、S6和S10的全草樣品普遍高于其他6個(gè)批次全草樣品，結(jié)合基源鑒定結(jié)果初步說明川西獐牙菜環(huán)烯醚萜苷類含量可能高于印度獐牙菜。該含量差異主要與基源不同有關(guān)，提示了明確藥材的來源對(duì)藏茵陳研究的重要性。

3.3 本實(shí)驗(yàn)對(duì)S1藥材進(jìn)行了分部位研究，由表3結(jié)果顯示橫向?qū)Ρ龋悍植课谎芯恳卜?種有效成分含量芒果苷＞獐牙菜苦苷＞獐牙菜苷＞龍膽苦苷的分布；縱向比較S1、S11和S12顯示：獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和芒果苷含量都為S11（花葉)＞S1（全草)＞S12（根莖),龍膽苦苷含量則為S12（根莖)＞S11（花葉)，該結(jié)果初步提示藏茵陳中獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和芒果苷成分主要存在于花葉中，龍膽苦苷主要存在于根莖中。藏茵陳的臨床用藥都是全草入藥，由于市場(chǎng)上購(gòu)買的樣品大部分都是經(jīng)過產(chǎn)地加工后將根莖花葉分離，導(dǎo)致臨床用藥可能因?yàn)槿∷幉痪鶎?dǎo)致質(zhì)量不一，分部位研究可以有效的指導(dǎo)臨床用藥。由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)分部位研究?jī)H進(jìn)行了一個(gè)初探，進(jìn)一步確證需要加大批次進(jìn)行研究。

3.4 芒果苷屬于口山酮類，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷屬于環(huán)烯醚萜苷類，由表可知每個(gè)樣品都呈現(xiàn)出芒果苷單體的含量大于另外三個(gè)環(huán)烯醚萜苷總和的含量，提示芒果苷在該兩個(gè)來源中的重要性，推測(cè)可能為其主要活性成分。

[1] 王寶勤等.國(guó)家藏藥標(biāo)準(zhǔn)全書（全3卷)[M].北京：中華醫(yī)學(xué)電子音像出版社,2004.

[2] Komatsu K, Purusotam B, Yamaji S,et al. A comparative study on Swertiae herba from Japan, Nepal, and China and their hypoglycem ic activities in streptozotocin (STZ)-induced diabetic rats [J].Nat Med, 1997, 51： 265.

[3] Banerjee S, Sur T, KumarM S,et al. Assessment of the antiinflammatory effects of Swertia chirata in acute and chronic experimental models in male albino rats[J].Indian J Pharm,2000, 32： 21.

[4] Song W Z. A general survey on medicinal plants of Gentianaceae in China[J].Bull Chin Mat Med(中藥通報(bào)),1986, 11： 643.

[5] Ji Y B.Pharmacology and Application of the Active Constituents in Chinese Traditional Medicines(中藥有效成分的藥理與應(yīng)用) [M]. Haerbin： Heilongjiang Science and Technology Press, 1995.

[6] 胡若琪,饒嫻宜,盧明義,等.獐牙菜苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷大鼠血漿CAMP含量的影響[J].中國(guó)藥理及臨床,1989,5(4)：31.

[7] 郭愛華.龍膽科獐牙菜屬藥用植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2005,1(6)：57.

[8] 郭清峰,王瑋,韓文清.龍膽苦苷的藥理作用進(jìn)[J].廣東化工,2014,41(17)：121.

[9] GhosalS, Rao G, Saravanan V,et al. A plausible chem ical mechanism of the bioactivites of magiferin [J].Indian J Chem,Sect B：Org Chem Incl Med Chem, 1977, 35B(6)：561.

[10] Ashida S, Noguchi S F, Suzuki T. Antioxidative components,xanthone derivatives, in Swertia japonica Makino[J].J Amer Oil Chem Soc, 1994, 71(10)： 1095.

[11] Ghosal S, Chaudhuri R K. Chemical constituents of Gentianaceae.ⅩⅥ. Antitubercular activity of xanthones of Canscora decussata[J].J Pharm Sci, 1975, 64： 888.

[12] Bian Q Y, Luo N C, Xiao P G. Four xanthone glycosides from Swertia calycina Franch [J].Pharm Pharmacol Com,1998,4(12)：597.

[13] Rodriguez S, W olfender J L, Hakizamungu E,et al. An antifungal naphthoquinone, xanthones and secoiridoids from Swertia calycina[J].Planta Med, 1995, 61(4)： 362.

Determination of four active ingredients of Zangyinchen/

ZHANG Hui,YANG Meng-ni, LI Yang, LIU Juan, LI Wen-ting,XIA Hou-lin//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan )

Objective: To establish determination method of four effective components in Zangyinchen, and detect the content 5 of 10 batches samples from different sources. Method: High performance liquid chromatography (HPLC) method was used for the simultaneous determination of swertiamarin, gentiopicroside, swertiamarin and mangiferin in Zangyinchen on C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with methanol-0.1% phosphoric acid water solution as mobile phase in gradient elution. The detection wavelength was set at 238 nm (swertiamarin) , 274 nm (gentiopicroside), 243 nm (sweroside) and 258 nm (mangiferin).Result: The HPLC simultaneous determination of four effective components in Zangyinchen was established with good separation,and met the methodological requirements. Conclusion: The method is simple, accurate with ood repeatability and reliability, which can be used for the simultaneous determination of four effective components in Zangyinchen.

Zangyinchen; effective components; HPLC; determination of content

A

1674-926X(2017)04-004-04

成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地。

張慧(1991—），女，藥物分析碩士，主要從事中藥質(zhì)量控制研究。Tel：13880459062 Email：zhanghui9101@163.com

夏厚林(1964—)，男，教授，主要從事藥物分析學(xué)、物理化學(xué)研究。Tel：13568899011 Email：XHL64@163.com

2016-08-08

（責(zé)任編輯：李蕓霞)