miR-586在骨肉瘤患者體內的表達及意義的相關研究

陳是煌，尹 毅，郭志宏，陳 偉

（昆山市第一人民醫(yī)院脊柱外科，蘇州 310000）

miR-586在骨肉瘤患者體內的表達及意義的相關研究

陳是煌，尹 毅，郭志宏，陳 偉

（昆山市第一人民醫(yī)院脊柱外科，蘇州 310000）

目的：探究miR-586在骨肉瘤患者體內的表達及意義。方法：選取我院2014年9月～2016年9月收治的骨肉瘤患者151例，將其作為觀察組，選擇同期于我院進行體檢的健康的志愿者52例，將其作為對照組，對患者瘤體周圍正常骨組織及骨肉瘤瘤體組織中miR-586的表達、兩組血清miR-586的表達、患者血清中miR-586表達與骨肉瘤患者瘤體組織的相關性、miR-586對骨肉瘤的診斷價值進行分析。結果：瘤體周圍正常骨組織、骨肉瘤瘤體組織的miR-586相對表達水平分別為（0.94±0.27）、（5.34±0.29），患者瘤體周圍正常骨組織較骨肉瘤瘤體組織中miR-586相對表達水平高，差異明顯具有統(tǒng)計學意義；觀察組、對照組血清miR-586的相對表達水平分別為（1.48±0.47）、（0.85±0.22），觀察組較對照組高，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義；經皮爾森相關系數分析發(fā)現，患者血清中miR-586與骨肉瘤患者瘤體組織呈正相關的關系；經對觀察組、對照組患者外周血miR-586水平ROC曲線分析，曲線下面積為0.882（0.774、0.991為95%可信區(qū)間；P=0.023），當0.9551為最佳篩查陽性屆值（cut-off）時，特異度及敏感度均為85%。結論：miR-586對骨肉瘤患者具有較好的診斷價值，其表達水平可作為骨肉瘤患者診斷的生物學指標。

miR-586；骨肉瘤；診斷價值

惡性骨腫瘤具有3種類型，分別為繼發(fā)性骨腫瘤、原發(fā)性骨腫瘤及轉移性骨腫瘤三種，近年來，臨床多采用新輔助治療的方式對患者進行治療，患者的生存期得到了明顯改善［1］。骨肉瘤是一種原發(fā)惡性骨腫瘤，在骨惡性腫瘤中約占三分之一，常見于兒童和青少年，多發(fā)于四肢長骨部位，膝關節(jié)周圍為最常發(fā)病部位，其發(fā)病率約為百萬分之四［2-4］。骨肉瘤惡性程度高，其在局部進行侵襲性生長，早期多發(fā)生轉移故臨床對骨肉瘤患者的早期診斷尤為重要［5-6］。有研究指出，microRNAs（即miRNAs）是骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的重要指標［7-8］。miRNAs具有檢測方法價格低、取材便捷的優(yōu)點，被認為是一種具有早期檢測、預后功能的生物標志物［9］。臨床關于miR-586在骨肉瘤中的作用的相關研究甚少，故對miR-586在骨肉瘤患者體內的表達及意義進行了探究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2014年9月～2016年9月收治的151例骨肉瘤患者，將其作為觀察組，其中男75例，女76例，年齡21～42歲，平均年齡（25.34±7.24）歲。納入標準：經影像學檢查、病史、活組織檢查確診為骨肉瘤。排除標準：排除于手術前接受過放療或化療的患者。同期選擇于我院進行體檢的健康的志愿者52例，將其作為對照組，其中男26例，女26例，年齡22～41歲，平均年齡（26.32±7.19）歲。所有患者在年齡、性別等方面沒有差異，沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 樣本處理及RNA提取 收集觀察組術前新輔助化療前及對照組晨起空腹外周靜脈血2mL，肝素抗凝，30分鐘的時間內，將其進行分裝200μL全血于凍存管內，凍存管內裝有研磨珠及Trizol，將其進行足夠的震蕩，然后將其置于-80℃的冰箱；對患者后蜀瘤體周圍正常骨組織和骨肉瘤瘤體組織進行收集，然后將其放入液氮內進行保存。對患者總RNA進行抽取，抽取依據RNA提取試劑盒說明書（Invitrogen公司）進行，對其純度、濃度進行測定，測定儀器為紫外線分光光度計，在電泳條件下對其完整性進行檢測［10］。

1.3 反轉錄-熒光定量PCR檢測 將RNA逆轉錄為cDNA，后進行檢測，反轉錄試劑盒（Qiagen公司），20μL反應體系，其中 1μL反轉錄酶、1μL總的RNA，14RμL Nase Free 水、（5×）4μL反轉錄緩沖液。37℃為反應條件，5min95℃。進行實時熒光定量PCR檢測，檢測采用miScript SYBR Green PCR kit（Qiagen公司），反應體系依據說明書進行，預變性5min95℃為反應條件［11］；延伸及變性以10s95℃、20s60℃、20s72℃ 40個循環(huán)進行。20s78℃為熒光收集。內參為管家基因U6，miR-586的相對表達量依據相對定量法進行計算。5'-CGCGGATCCGTAAGAAGAAATCTGAATGCTTTTGT-3'為miR-586的引物。

1.4 觀察指標 對患者瘤體周圍正常骨組織及骨肉瘤瘤體組織中miR-586的表達、兩組血清miR-586的表達、患者血清中miR-586與骨肉瘤患者瘤體組織的相關性、miR-586對骨肉瘤的診斷價值進行分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 數據處理采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。（± s）表示計量資料，用t對其進行檢驗 ；（%）表示計數資料，用χ2進行檢驗。miR-586的診斷效果依據ROC曲線進行評估，骨肉瘤患者瘤組織中miR-586表達水平與血清miR-586水平的相關性依據皮爾森相關系數進行評估。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者瘤體周圍正常骨組織及骨肉瘤瘤體組織中miR-586的表達 患者瘤體周圍正常骨組織較骨肉瘤瘤體組織中miR-586相對表達水平高，差異明顯具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 患者瘤體周圍正常骨組織及骨肉瘤瘤體組織中miR-586的表達

2.2 兩組血清miR-586的表達 觀察組較對照組患者的血清miR-586的相對表達水平高，差異明顯，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組患者血清miR-586的表達

2.3 患者血清中miR-586與骨肉瘤患者瘤體組織的相關性 經皮爾森相關系數分析發(fā)現，患者血清中miR-586與骨肉瘤患者瘤體組織呈正相關的關系（r=0.907，P=0.001）。

2.4 miR-586對骨肉瘤的診斷價值 經對觀察組、對照組外周血miR-586水平ROC曲線分析，曲線下面積為0.882（0.774、0.991為95%可信區(qū)間；P=0.023），當0.9551為最佳篩查陽性屆值（cut-off）時，特異度及敏感度均為85%。

3 討論

骨肉瘤具有預后較差、惡性度高、多發(fā)于青少年等特點，早期易發(fā)生轉移，有研究表示，骨肉瘤患者在確診時多數患者已發(fā)生遠端微轉灶，骨肉瘤的轉移給臨床治療及患者健康恢復帶來了難題［12-14］。近年來，隨著經濟的快速發(fā)展，醫(yī)療科學水平的不斷提高，骨肉瘤患者的生存率得到了一定改善，但其早期轉移仍是臨床面臨的一個難題。有學者提出，腫瘤的轉移率是骨肉瘤患者生存率的主要影響因素，患者一旦有轉移的發(fā)生，生存率會受其影響而降低［15-16］。

有研究表明，miRNAs是一種生物標志物，可用于早期檢測及預后，具有檢測方法價格低、取材便捷的優(yōu)點，在臨床治療中發(fā)揮了一定作用。但目前，臨床對miR-586多集中在血壓系統(tǒng)疾病及消化道腫瘤等方面，如羅耀玲等指出，miR-586會對Bc1-2通路產生影響，從而可發(fā)揮對HepG2細胞的增殖、凋亡的調節(jié)作用。但臨床關于miR-586與骨肉瘤關系的相關研究甚少，目前僅有TENG等學者進行了體外細胞實驗，經實驗發(fā)現，患者骨肉瘤細胞的遷移、侵襲、分化、凋亡與miR-586存在一定聯(lián)系，miR-586的下調對細胞的遷移、侵襲、分化具有抑制作用，對腫瘤細胞的凋亡具有促進作用［17］。且目前，臨床尚無對miR-586的表達情況的相關研究，為減少骨肉瘤患者的痛苦，減少早期轉移的發(fā)生，本研究對miR-586在骨肉瘤患者體內的表達及意義進行了探究。

研究結果顯示，患者瘤體周圍正常骨組織較骨肉瘤瘤體組織中miR-586相對表達水平高，這與相關研究結果一致。觀察組較對照組患者的血清miR-586的相對表達水平高，骨肉瘤患者表達水平較正常健康患者高，說明血清miR-586的表達水平的提高具有一定程度的提示作用。經皮爾森相關系數分析發(fā)現，患者血清中miR-586與骨肉瘤患者瘤體組織呈正相關的關系，這說明血清miR-586對瘤體組織中miR-596的表達水平具有很好的反映作用，經分析，筆者認為可能是miR-596可參與到腫瘤發(fā)生的通路中去，參與方式為腫瘤增殖的信號分子。經對觀察組、對照組患者外周血miR-586水平ROC曲線分析，曲線下面積為0.882（0.774、0.991為95%可信區(qū)間），當0.9551為最佳篩查陽性屆值（cut-off）時，特異度及敏感度較高，說明miR-586對骨肉瘤患者具有較好的早期診斷價值。

綜上所述，骨肉瘤患者的瘤體組織、血清中的miR-586表達水平明顯提高，miR-586對骨肉瘤患者具有較好的診斷價值，其表達水平可作為骨肉瘤患者診斷的生物學指標。

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miR-586 studies on expression and meaning in patients with osteosarcoma

Chen Shi-huang, Yin Yi, Guo Zhi-hong, Chen Wei
(Department of Spine Surgery, the First People’s Hospital of Jiangsu, Suzhou 310000, China)

ObjectiveTo investigate the expression and significance of miR-586 in osteosarcoma patients.Methods151 patients with osteosarcoma in our hospital from September 2014 to September2016 were selected as the observation group. In the same period, 52 healthy volunteers were selected as our control group. Tumor surrounding normal bone tissue and osteosarcoma tissues and the expression of miR-586, two groups of patients with serum miR-586 expression in serum of patients with miR-586 and patients with osteosarcoma tumor correlation, the diagnostic value of miR-586 on osteosarcoma were analyzed.ResultsThe relative expression levels of miR-586 in the normal bone tissue and osteosarcoma tissue around the tumor were(0.94+0.27), (5.34+0.29). The relative expression of miR-586 in tumor tissues was higher than that in osteosarcoma tissues, and the difference was statistically significant. The relative expression levels of serum miR-586 in the observation group and the control group were (1.48+0.47), (0.85+0.22). The observation group was higher than the control group, and the difference was statistically significant. There was a positive correlation between miR-586 in serum and tumor tissue in osteosarcoma patients by Pearson correlation coefficient analysis. The miR-586 level and ROC curve of peripheral blood in the observation group and the control group were analyzed, the area under the curve was 0.882(0.774, 0.991 is 95% confidence interval; P=0.023),and when 0.9551 was the best screening positive term value (cut-off), the specificity and sensitivity were 85%.ConclusionMiR-586 has better diagnostic value for osteosarcoma, and its expression level can be used as a biological marker for the diagnosis of osteosarcoma.

MiR-586; osteosarcoma; diagnostic value

R738.1

A

1673-016X（2017）06-0061-03

2017-10-12

陳是煌，E-mail：865265818@qq．com