香葉醇對人肝癌細胞株Huh7增殖及TGF-b1/Smad 2信號通路影響研究

徐 慧，鄧意志

（長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，長沙 410100）

香葉醇對人肝癌細胞株Huh7增殖及TGF-b1/Smad 2信號通路影響研究

徐 慧，鄧意志

（長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，長沙 410100）

目的：探討香葉醇對肝癌細胞株Huh7增殖及TGF-b1/Smad 2信號通路的影響。方法：不同濃度香葉醇干預(yù)體外培養(yǎng)肝癌細胞株Huh7不同時間。MTT檢測香葉醇對Huh7細胞生長情況的影響，流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化情況，RT-PCR和Western blot分別檢測細胞內(nèi)TGF-b1和Smad 2 mRNA和蛋白表達水平的變化情況。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示香葉醇顯著抑制了肝癌細胞的生長。流式細胞結(jié)果表明香葉醇明顯降低了肝癌細胞S期含量而增加了G0/G1期含量。而TGF-b1和其下游因子Smad2的mRNA和蛋白水平的表達也明顯受到香葉醇的抑制，且這種抑制作用呈濃度一時間依賴性。結(jié)論：香葉醇可能夠通過阻斷TGF-b1/Smad 2信號通路抑制肝癌細胞生長。

香葉醇；轉(zhuǎn)化生長因子b1；肝癌

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)《2012中國腫瘤登記年報》統(tǒng)計，肝癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病率第三位（28.71/10萬），死亡率第二位（26.04/10萬），我國肝癌患者數(shù)量占全球54%，每年死于肝癌的人數(shù)達37萬［1］。肝癌好發(fā)于男性，高發(fā)年齡為30～50歲。由于肝癌的早期癥狀隱匿，肝癌難以早期診斷且易發(fā)生轉(zhuǎn)移，使得肝癌患者預(yù)后差，致死率高居不下；若不對肝癌患者采取治療措施，5年存活率低于5%。盡管肝癌治療已取得一定程度進展，但是目前肝癌患者5年期存活率仍不到5%［2］。Gotzmann J等研究發(fā)現(xiàn)TGF-b1在肝細胞惡變?yōu)楦伟┘毎^程中發(fā)揮重要作用。因此，靶向TGF-b1是肝癌治療的潛在有效靶點［3］。（無環(huán)）單萜香葉醇是在檸檬、天竺葵及其他從醫(yī)用植物中提取的精油中含量極低的天然化合物。香葉醇具有抗氧化、抗微生物和抗炎活性［4］。此外，香葉醇還能通過靶向細胞周期和凋亡過程抑制多種人類腫瘤細胞生長［5-，7］。本研究主要探討香葉醇對肝癌細胞株生長的影響及其與TGF-b1信號通路的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 細胞培養(yǎng) 肝癌細胞株Huh-7購自中南大學(xué)細胞生物實驗中心，細胞在37℃，含5%CO2的養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%小牛血清的DMEM高糖培基（美國Hyclone公司）培養(yǎng)，培養(yǎng)基中分別加入終濃度為100mg/L的鏈霉素與青霉素，細胞貼壁生長24h。細胞用0.05%胰蛋白酶一EDTA消化傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

1.1.2 試劑來源 香葉醇（Sigma-48799）購自Sigma公司；Trizol、RT-PCR試劑盒大連寶生物公司。PVDF膜購自美國Millipore公司、抗體TGF-b1和Smad2購自美國Santacruz公司。

1.2 主要方法

1.2.1 MTT法檢測香葉醇對肝癌細胞株Huh7生長的

影響 Huh7細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，消化計數(shù)，以105個/mL接種于96孔板，培養(yǎng)過夜后，分別用1、2、4、6、8、16 mmol的香葉醇干預(yù)Huh7細胞24、48 和72 h，對照組細胞僅加入相應(yīng)培基。藥物干預(yù)完成后，棄去培養(yǎng)，加入200 ml 5mg/ml MTT繼續(xù)培養(yǎng)4小時，最后用50ml DMSO處理，酶標儀測定OD450nm時細胞吸光值（OD），然后計算抑制率。抑制率=（1-藥物干預(yù)組OD/對照組OD）×100%。并在倒置顯微鏡下觀察未經(jīng)香葉醇處理及經(jīng)香葉醇處理的Huh7細胞形態(tài)。

1.2.2 流式細胞儀檢測香葉醇對肝癌細胞株Huh7細胞周期的影響 1、2、4、6、8、16 mmol的香葉醇干預(yù)Huh7細胞48h（根據(jù)MTT結(jié)果篩選出的最佳作用時間點）后，棄去培基，PBS漂洗細胞兩次，4%多聚甲醛固定過夜，PI染色后流式細胞儀檢測其細胞周期。

1.2.3 RT-PCR檢測香葉醇對肝癌細胞株Huh7細胞TGF-b1和Smad2 mRNA表達的影響 采用Oligo7.0軟件設(shè)計TGF-b1、Smad2 及b-actin引物，并交由Invitrogen公司合成。 引物序列如下：TGF-b1，5'-CCT TGC TGG ACC GCA ACA AC-3'（正向），5'-CAG CAG CCG GTT ACC GAC-3'（反向）；Smd 2，5'-CAG GTT CCA GCT ATG GAG C-3'（正向），5'-TTC ATG GCC GAA TCC CAT-3'（反向）；b-actin，5'-CAG GTC ATA CTC CTG CGG CTG -3'（正向），5'-CGG GAC CTC ACT GAC TACC TC-3'（反向）。Trizol提取細胞tRNA，采用易步發(fā)RTPCR試劑盒擴增。擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物行1.8%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳結(jié)果，并進行灰度值分析。

1.2.4 Western blot檢測香葉醇對肝癌細胞株Huh7細胞TGF-b1和Smad2 蛋白表達的影響 香葉醇作用Huh7細胞48h后，收集細胞，加入150mL細胞裂解液，超聲粉碎，離心，取上清。分別取100mg樣品蛋白/孔上樣，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)1小時（4℃，100v），5%脫脂奶粉封閉2h，然后分別用b-actin（1∶1000），TGF-b1（1∶500）、Smad2（1∶500）一抗 4℃平搖過夜，HRP標記二抗（1∶1000）避光孵育2h，ECL Plus顯色液顯色，顯影、定影，掃描條帶并行分析，以目的條帶與b-actin條帶吸光度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 香葉醇對肝癌細胞株Huh7生長及形態(tài)的影響1、2、4 mmol香葉醇干預(yù)Huh7細胞時OD450值與對照組相比無明顯差異，而8和16香葉醇干預(yù)Huh7細胞時OD450值明顯下降，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。相同濃度香葉醇干預(yù)Huh7不同時間后，OD450值均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1）。MTT結(jié)果表明，香葉醇以時效性和劑效性抑制Huh7生長。

圖1

在不同濃度香葉醇干預(yù)的細胞分別于培養(yǎng)24，48和72小時后，于倒置相差顯微鏡下觀察，人肝癌Huh7細胞經(jīng)香葉醇處理后出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，比較香葉醇藥物作用組和對照組，未受到香葉醇干預(yù)的細胞均呈單層細胞貼壁生長，細胞間結(jié)構(gòu)緊密，細胞增殖生長（圖2-A）。隨藥物干預(yù)的劑量和時間延長，細胞形態(tài)逐漸變圓，細胞間間隙增大，細胞密度逐漸變小，細胞內(nèi)中毒顆粒增多，折光度下降，部分細胞喪失貼壁能力，懸浮在培養(yǎng)基中生長，隨機視野可見細胞密度明顯減少。在相同的時間內(nèi)，細胞對不同濃度藥物的反應(yīng)存在差異。隨香葉醇藥物濃度的增大，肝癌Huh7細胞脫落的比例增多，細胞碎裂的比例明顯增多。上述結(jié)果提示香葉醇可以抑制Huh7細胞的增殖（圖2-B，C，D）。

2.2 香葉醇對肝癌細胞株Huh7細胞周期的影響 與對照組比較，當香葉醇濃度為1、2、4 mmol/l時，處于G0/G1的Huh7細胞的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而隨著香葉醇濃度的增加，G0/G1期Huh7細胞的比例較對照顯著增加（P＜0.05），而S期和G2，M的比例則顯著下降（P＜0.05）（表1）。

2.3 香葉醇對肝癌細胞株Huh7 TGF-b1和Smad2 mRNA和蛋白表達的影響 RT-PCR和Western Blot實驗結(jié)果表明，香葉醇以時間劑量效應(yīng)抑制Huh7 TGF-b1和Smad2 mRNA和蛋白表達（圖2，3，4）。

圖2. Huh7細胞形態(tài)學(xué)觀察。

表1 不同濃度香葉醇對Huh7細胞周期的影響

圖3 香葉醇對Huh7 TGF-b1和Smad2 蛋白表達的影響

圖3 香葉醇對Huh7 TGF-b1和Smad2 mRNA表達的影響

3 討論

轉(zhuǎn)化生長因子b1（transforming growth factor-b1，TGF-b1）在胚胎形成、細胞生長調(diào)控、胞外基質(zhì)分泌、血管生成及免疫調(diào)節(jié)等多種生理過程中發(fā)揮重要作用。動脈粥樣硬化和臟器纖維化與TGF-b1表達異常密切相關(guān)，特別是TGF-b1與癌癥的相關(guān)性近年來成為學(xué)者們關(guān)注的焦點［8］。Samds是一類十分重要的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)信號分子家族，其中Smad2識別和結(jié)合上游信號分子，并將其轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，并激活TGF-b1/Smads信號通路，因此Smad2是TGF-b1/Smads信號通路至關(guān)重要的調(diào)控分子。Smad2表達沉默會導(dǎo)致TGF-b1/Smads信號通路發(fā)生紊亂［9］。

TGF-b1/Smads信號通路在腫瘤不同階段發(fā)揮不同的作用。腫瘤形成時，TGF-b1/Smads信號通路抑制腫瘤細胞生長。在這一階段，一旦參與TGF-b1/Smads信號通路的信號分子表達異常，腫瘤細胞既能捕捉到這一信息，從而“逃避”TGF-b1/Smads信號通路的抑制作用。而當腫瘤處于進展期時，TGF-b1/Smads信號通路發(fā)揮促進腫瘤細胞生長的作用，并增強腫瘤的侵襲性和惡性程度［10］。

程朋等研究發(fā)現(xiàn)TGF-b1和Smad2在肝癌組織中的表達高于正常肝組織，TGF-b1和Smad2基因過表達可能在HCC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用［11］。王春雷等研究表明：HepG2細胞系比Huh-7和Hep3B細胞系更易發(fā)生TGF-b1誘導(dǎo)的凋亡，Smad4也許是TGF-b1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要調(diào)控因子之一［12］?？惖葎t研究證實TGF-b1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制，使TGF-b1介導(dǎo)的抗增殖信號不能正常下傳，可能是肝癌發(fā)生的機制之一［13］。這些研究提示TGF-b1/Smd 2信號通路是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要參與者，是肝癌治療的潛在有效靶點。

香葉醇已被證實能夠抑制多種人類腫瘤的生長，其主要通過抑制多種腫瘤生長因子、腫瘤代謝酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及抗凋亡蛋白表達發(fā)揮腫瘤抑制作用［14］。本研究首先采用MTT實驗檢測香葉醇對肝癌細胞Huh7生長的影響，結(jié)果證實香葉醇以時間和劑量依賴效應(yīng)抑制肝癌細胞生長，這一結(jié)果與以往研究結(jié)果一致［15］。此外，本實驗結(jié)果還發(fā)現(xiàn)香葉醇能夠抑制S期腫瘤細胞比例，使多腫瘤細胞發(fā)生G0/G1期阻滯。而Western Blot和R-PCR實驗表明，香葉醇能夠降低肝癌細胞中TGF-b1和Smad2 蛋白和mRNA表達。這一結(jié)果提示香葉醇能夠抑制肝癌細胞TGF-b1/Smad2信號通路活性，且這種抑制作用有濃度-時間依賴性。

總之，香葉醇能夠抑制肝癌細胞生長，是其發(fā)生G0/G1期阻滯。其可能機制是香葉醇通過抑制TGF-b1和Smad2表達而阻斷TGF-b1/Smad2信號通路，本文研究結(jié)果為肝癌臨床治療提供了新思路。但是，香葉醇抑制TGF-b1/Smad2信號通路具體作用機制仍需進行深入探討，并需進行體內(nèi)實驗驗證，以便為將香葉醇作為預(yù)防或治療肝癌的有效藥物提供最為充分依據(jù)。

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Effect of Geraniol on proliferation and TGF-b1 signaling pathway of human hepatcellular Carcinoma cell line Huh7

Xu Hui, Deng Yi-zhi
(Changsha Health Vocational College, Changsha 410100, China)

ObjectiveTo observe the effect of Geraniol on proliferation and TGF-b1 signaling pathway of human hepatcellular Carcinoma cell line Huh7.MethodsHuman hepatcellular Carcinoma cell line Huh7 was cultured and treated with Geraniol at different concentration and at different time points. The effect of Geraniol on Huh7 cell proliferation was studied by means of MTT, the cell cycle was detected with flow eytometry; RT-PCR and western blot were used to detect the expressions of TGF-b1 and Smad 2 at mRNA and protein levels.ResultsThe viability of Huh-7 cells treated with Geraniol was obviously decreased. Analysis of the cell cycle revealed that Geraniol induced a significant decrease in cells in the S phase and increase in cells in the G1 phase. Furthermore, the expressions of TGF-b1 and its downstream factor-Smad 2 at mRNA and protein levels wele inhibited by Geraniol in a concentration and time dependent manner.Conclusions Geraniol perhaps plays its inhibitory effects Huh-7 cells through inhibiting the the activity of TGF-b1 signaling pathway.

geraniol; TGF-b1 signaling pathway; hepatcellular carcinoma

R273

A

1673-016X（2017）06-0012-04

2017-07-25

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃項目（No：B2014-150）

鄧意志，E-mail: 934503827@qq．com